一种特异检测成熟microRNA表达水平的定量检测方法及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学技术领域，具体设及一种特异检测成熟microRNA表达水平 的定量检测方法及试剂盒。
【背景技术】
[0002] microRNAs(microRNA)是一类非编码、内源性的、长度约为20~23个核巧酸的单链 小分子RNAemicroRNAs由基因组DNA编码，在细胞核内最初被转录为几百个核巧酸的pri-microRNA，之后被Drosha剪切成长度约70~90碱基的pre-microRNA，并进一步由胞浆的 Dicer加工，最终形成成熟microRNAs。成熟microRNAs对转录后水平的基因调控广泛存在于 真核生物的发育和代谢过程，包括胚胎发育，细胞调亡、增殖、分化、应激应答，机体代谢，免 疫调节和疾病的发生与发展等。因此，建立一种快速、特异、灵敏的检测方法对microRNA的 功能研究和临床检测具有重要意义。
[0003] pre-mi croRNA 是成熟 microRNA 的前体。pre-mi croRNA 含有一个茎环结构（Stem-loop)，经过Dicer剪切加工，茎环结构中的茎与环分开，其中部分组成茎的两个RNA单短链 即为成熟的microRNA。由一个pre-microRNA得到的两个成熟microRNA通常分别被命名为 microRNA-5p和microRNA-3p(在旧的命名法中，也被称为有义链和无义链）。理论上一对 111；[(31'01?魁-59和111；[(31'01?魁-化来源于同一个pre-microRNA，其数量应该是相等的。但在实际 研究中发现，很大一部分microRNA的5p和化数量差异非常大。原因在于，经过Dicer剪切加 工后，得到的两个成熟microRNA(5p和化），往往只有一条具有基因调控功能，另一条则迅速 被降解。因此在对mi croRNA的生物功能的研究中，特异的检测成熟的mi croRNA-Sp或 microRNA-化的在细胞或组织中表达量是非常重要的。
[0004] 目前为止，常用的microRNA检测方法主要有Ξ大类。其中Nodhern blotting被看 成是检测单个microRNA的金标准，但是Nodhern blotting方法操作复杂，费时费力，不适 合高通量分析。忍片适合高通量的分析，但特异性和可重复性低。实时定量PCR适合高灵敏 的检测，方便快捷，可用于mi croRNA批量检测。但目前通用的Stem-1 OOP PCR方法因为上游 引物序列取自成熟microRNA的DNA序列，而该序列也同时存在于pre-microRNA中，因此 Stem-loop PCR方法无法排除pre-microRNA的非特异扩增。在实际实验中需要反复调整反 应条件，W降低对pre-mi croRNA的非特异扩增，结果并不十分理想。一些公司在Stem-loop PCR方法的基础上引入化qman探针，W期得到较高的扩增特异性，但化qman探针价格昂贵， 而且并不能完全弥补引物不特异而带来非特异扩增。总之，目前的方法很难做到对成熟 microRNA高特异、高灵敏的便利检测。
【发明内容】
[000引为了克服上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种特异检测成熟 microRNA表达水平的定量检测方法及试剂盒，该方法检测过程简便，检测结果灵敏准确。
[0006 ]本发明是通过W下技术方案来实现：
[0007]本发明公开的一种特异检测成熟microRNA表达水平的定量检测方法，包括W下步 骤：
[000引 1)提取样品中的包含microRNA组分的总RNA或小RNA(small RNA)，在反转录酶及 Poly A聚合酶或化ly U聚合酶的作用下，反转录获取cDNA;
[0009] 2)根据microRNA成熟序列及pre-microRNA序列，设计只针对microRNA成熟序列的 上游引物，然后进行实时定量PCR，特异性检测成熟microRNA表达水平。
[0010] 步骤1)所述的反转录采用一步法进行短时反应。短时反应条件为:37°C，10~15分 钟;42°C，10~15分钟;85°C，5分钟。
[0011] 步骤1)中化ly A聚合酶或化ly U聚合酶的使用，由成熟microRNA序列信息和pre-microRNA序列信息进行选择。
[0012] 在pre-microRNA序列中，位于待测microRNA的5p或化序列下游的两个碱基为-NA-时，使用POly U聚合酶;其中，N为A，U，C或G中的一个；
[0013] 在pre-microRNA序列中，位于待测microRNA的5p或化序列下游的两个碱基为-NU-时，使用P0ly A聚合酶;其中，N为A，U，C或G中的一个；
[0014] 在pre-microRNA序列中，位于待测microRNA的5p或化序列下游的两个碱基为-NS-时，使用poly A聚合酶或poly U聚合酶中的任意一个，其中，N为A，U，C或G中的一个;S为C或 G中的一个。
[0015] 步骤1)反转录过程中所用的引物根据所选的化ly A聚合酶或化ly U聚合酶而定。 [0016]当使用Poly A聚合酶时，反转录引物序列如SEQ.ID.no. 1所示，且在3'端末尾为 VN-;其中，V为A，C或G中的一个;N为A，T，C或G中的一个；
[0017]当使用Poly U聚合酶时，反转录引物序列如SEQ.ID.no. 2所示，且在3'端末尾为 BN-;其中，B为T，C或G中的一个;N为A，T，C或G中的一个。
[001引检测成熟microRNA的上游引物为成熟microRNA的DNA序列加上末尾两个碱基，该 末尾两个碱基是根据反转录过程中所选的化ly A聚合酶或化ly U聚合酶而定。
[0019] 当使用Poly A聚合酶时，检测成熟microRNA的上游引物的末尾添加的两个碱基 为-AA;
[0020] 当使用Poly U聚合酶时，检测成熟microRNA的上游引物的末尾添加的两个碱基 为-TT。
[0021 ]本发明还公开了实现上述的特异性检测成熟microRNA表达水平的定量检测方法 的试剂盒(如100次检测试剂盒），包括W下两个部分:a)反转录部分，其构成组分有:M-MLV 逆转录酶（20,000U)，Poly A聚合酶（20U)，Poly U聚合酶（20U)，一步法反应缓冲液 (200ul)，反转录引物如SEQ.ID.no. 1(2.5uM)，反转录引物如SEQ.ID.no. 2(2.5uM);b)定量 PCR部分，其构成组分有:PCR酶（250U)，PCR反应缓冲液（1ml)，PCR反应下游通用引物5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'（lOuM)，PCR反应microRNA特异上游引物（lOuM)。
[0022]与现有技术相比，本发明具有W下有益的技术效果：
[002引本发明公开的特异检测成熟microRNA表达水平的定量检测方法，首先根据 microRNA的成熟序列及其前体序列，使用多聚腺嚷岭核巧酸聚合酶(poly(A)聚合酶)或多 聚尿喀晚核巧酸聚合酶(poly (U)聚合酶)结合反转录酶，将microRNA反转录为cDNA。然后根 据microRNA的成熟序列及其前体序列，设计只针对成熟microRNA的上游引物。在实时定量 PCR过程中，该引物只扩增成熟microRNA的cDNA，而不会扩增pre-microRNA的cDNA，从而达 到高特异、高灵敏的检测成熟microRNA的表达水平的目的。检测过程简便，检测结果灵敏准 确。该方法能够有效用于成熟microRNA(ma化re microRNA,长度为20-23个碱基）在细胞或 组织内表达水平的检测。根据PCR反应的特异性主要取决于引物3'端2-3个碱基的正确匹配 的特性，设计合成特异引物，该引物只识别成熟microRNA(长度为20-23个碱基)反转录产物 cDNA，在实时定量PCR过程中不会与microRNA前体(pre-microRNA，长度为70-90个碱基）的 反转录产物cDNA结合，即不存在针对pre-microRNA的非特异扩增。本发明检测成熟 microRNA的特异性高于目前广泛使用的基于实时定量PCR的其他方法。
【附图说明】
[0024]图1为本发明方法的原理图；
[002引图2为具体实施例1中，实时定量PCR的扩增曲线；
[0026] 图3为具体实施例1中，根据扩增曲线得到的microRNA-124-5p在神经元与化la细 胞内相对表达水平柱状图；
[0027] 图4为具体实施例1中，microRN