用于籼稻育成品种遗传完整性分析的引物组合及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及遗传完整性分析引物，具体地说，设及用于釉稻育成品种遗传完整性 分析的SSR分子标记核屯、引物。
【背景技术】
[0002] 种质是指亲代通过生殖细胞或体细胞传递给子代的遗传物质。种质库保存的种质 材料一般可分为两类：遗传上同质种质（genetically homogeneous accessions)，指在一 份种质内，其个体之间基本上具有相同的遗传结构，如自花授粉作物育成品种、异花授粉作 物自交系等；遗传上异质种质（genetically heterogeneous accession)，指在一份种质 内，其个体之间不具有相同的遗传结构，如野生种、原始地方品种、异花授粉的栽培品种等。
[0003] 遗传完整性是指群体的遗传结构得到完全的保持，包括基因型频率分布及等位基 因频率分布和其原始群体一样，保持不变。维持种质的遗传完整性就是在繁殖过程中要有 最大的遗传相似性，在保存过程中表现最低程度的遗传变异。
[0004] 准确评价育成品种稻种资源的遗传多样性和完整性，对于其在育种、生产中的应 用具有重要的作用，对种质资源的安全保存具有重要意义。传统方法是采用表型多样性鉴 定法，即通过调查多项农艺性状，反映种质的遗传多样性和完整性。但是该方法容易受气 候、人为等因素影响。近年来分子标记技术在种质遗传多样性和完整性研究中得到越来越 广泛的应用。分子标记技术中有多项技术参数会影响评价结果的可靠性和准确性。USSR分 子标记为例，其关键的技术瓶颈包括引物的筛选、群体量的大小等。
[0005] 因此，亟需获得可用于釉稻育成品种遗传完整性分析的SSR核屯、引物，并建立釉稻 育成品种遗传完整性分析方法。
【发明内容】
[0006] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种用于釉稻育成品种遗 传完整性分析的引物组合及其应用。
[0007] 为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
[000引本发明提供一套用于釉稻育成品种遗传完整性分析的SSR核屯、引物组合与方法， 所述方法是基于SSR分子标记原理，采用经过前期大量筛选工作所获得的12对多态性核屯、 引物，对100~160个单株的釉稻育成品种基因组DNA进行扩增，利用生物分析软件统计分析 群体的遗传多样性指数，反映群体的遗传完整性保持情况。
[0009]第一方面，本发明提供用于釉稻育成品种遗传完整性分析的引物组合，其由如下 12个引物对组成：
[0010]55301:正向引物如沈9 10^.1所示;反向引物如沈9 10^.2所示；
[0011] SSR02:正向引物如沈Q ID NO. 3所示;反向引物沈Q ID NO.4所示；
[0012] SSR03:正向引物如沈Q ID NO.5所示;反向引物如沈Q ID NO.6所示；
[0013] SSR04:正向引物如沈Q ID NO.7所示;反向引物如沈Q ID NO.8所示；
[0014] SSR05:正向引物如沈Q ID NO.9所示;反向引物如沈Q ID NO. 10所示；
[001引 SSR06:正向引物如沈Q ID NO. 11所示;反向引物如沈Q ID NO. 12所示；
[0016] SSR07:正向引物如沈Q ID NO. 13所示;反向引物如沈Q ID NO. 14所示；
[0017] SSR08:正向引物如沈Q ID NO. 15所示;反向引物如沈Q ID NO. 16所示；
[001引 SSR09:正向引物如沈Q ID NO. 17所示;反向引物如沈Q ID NO. 18所示；
[0019] SSRIO:正向引物如沈Q ID NO.19所示;反向引物如沈Q ID NO.20所示；
[0020] SSRll:正向引物如沈Q ID NO.21所示;反向引物如沈Q ID NO.22所示；
[0021] SSR12:正向引物如沈Q ID NO.23所示;反向引物如沈Q ID NO.24所示。
[0022] 上述12对核屯、引物是从550对SSR引物中，经筛选获得。引物筛选方法为，W160个 单株的釉稻育成品种議晚釉19号的DNA为模板，分别用550对SSR引物进行扩增，扩增产物经 聚丙締酷胺凝胶电泳、凝胶银染、统计扩增结果。针对每对引物在160个单株中的扩增结果， 剔除不具备多态性的引物，保留具有多态性的引物，最终筛选获得12对多态性核屯、引物。筛 选得到的引物相对未被选择引物，在体现种质的遗传多样性方面具有明显优势。
[0023] 第二方面，在上述引物组合存在的前提下，任何含有该引物组合的产品均在本发 明的保护范围内，例如含有上述引物组合的试剂或试剂盒。原因在于，其在应用时利用的是 本发明所述引物组合的特殊性，且得到的结果取决于本发明所述引物组合的特殊性。
[0024] 第Ξ方面，本发明提供前述引物组合在分析釉稻育成品种遗传完整性方面的应 用。由于前述引物组合能够针对釉稻育成品种的遗传多样性进行鉴定，所得结果可用于判 断种质遗传完整性的保持情况。因此，本发明提供前述引物组合可用于釉稻育成品种遗传 完整性分析。
[0025] 第四方面，本发明提供一种分析釉稻育成品种遗传完整性的方法，W待分析样本 的基因组DNA为模板，利用前述引物组合进行PCR扩增，经聚丙締酷胺凝胶电泳分离扩增产 物，利用生物学软件对电泳结果进行遗传结构分析。
[0026] 进一步地，所述待分析样本的样本量(群体量)为100~160。原因在于，经实验统计 发现，群体量越小，特异性单株平均频率越低，其标准偏差和变异系数很大，表明采用过小 的群体量，取样误差十分明显。群体量增加至100单株时，特异单株频率逐步稳定趋近10%， 变异系数控制在15% W内，基本可W代表160单株的多样性。因此在进行釉稻育成品种遗传 完整性分析时，需要保证100株W上的群体量。
[0027] 作为优选，所述基因组DNA提取自釉稻叶片，因幼嫩叶片中次生代谢物质含量低， 易于获得高质量DNA，优选幼嫩叶片。
[00%]优选地，所述种子来自釉稻育成品种。
[0029] 作为优选，为了更好的观察扩增结果，可采用6%聚丙締酷氨凝胶电泳分离扩增产 物，电泳结束后采用银染法染色。
[0030] 更进一步地，所述PCR扩增的反应体系为：10 X PCR缓冲液(含Mgh) 2.0化，2.5mmol/ L dNTP 1.5yL，5UAiL Taq 0.化L，化mol/L SSR引物2.0yL，20ng/yL DM 2.0化，d加 2〇 12.0化。
[0031] 所述PCR扩增的程序为：94°C预变性5min; 95°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸 lmin，38个循环;72°C延伸lOmin。待溫度降至10°C后，于4°C冰箱内保存备用。
[0032] 基于上述优选方案，本发明提供一个完整具体的实施方式，包括如下步骤：
[0033] (1)采用CTAB法提取釉稻育成品种待分析样本叶片的基因组DNA，样本为100~160 单株釉稻；
[0034] (2)W步骤(1)提取的DNA为模板，用前述引物组合进行PCR扩增；
[0035] (3)采用6%聚丙締酷氨凝胶电泳对扩增产物进行分离，电泳结束后采用银染法染 色；
[0036] (4)利用生物学软件分析电泳结果。
[0037] 其中，所述步骤(4)具体为：统计扩增谱带类型，参照DNA marke;r(pBR322)估计片 段大小。使用P0PGE肥等软件对不同釉稻育成品种种质群体进行遗传结构分析，比较不同种 质等位基因数、有效等位基因数、基因多样性指数、香农指数等指标。采用SPSS或SAS等软 件，分析群体间各指数差异，若无显著差异则认为群体遗传完整性得到有效保持，若差异达 到显著水平，则认为群体遗传完整性发生了改变。
[0038] 本发明的有益效果在于：
[0039] 本发明W釉稻育成品种議晚釉19号为材料，通过大量实验研究，筛选出了一批可 用于釉稻育成品种遗传完整性分析的SSR核屯、引物，建立了用于釉稻育成品种遗传完整性 分析的引物组合，并基于此，建立了分析方法。
[0040] 本发明提供的分析方法适用于釉稻育成品种种质遗传完整性的分析。所筛选的引 物组合和最少100个单株的群体量，为准确分析釉稻育成品种种质保存和繁殖更新过程中 遗传完整性检测提供了标准方法。
【附图说明】
[0041] 图1为本发明实施例1中引物SSR09对部分单株"議晚釉19号"的扩增结果。左起第3 泳道为Marker，其它泳道为"議晚釉19号"单株DNA扩增结果。
[0042] 图2为本发明实施例1中不同大小群体量多态性单株差异。
【具体实施方式】
[0043] 下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是W下实 施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技 术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可W对本发明进行各种修改和替换。
[0044] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0045] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0046] 实施例1釉稻育成品种种质的遗传完整性分析
[0047] 1.实验材料
[0048] W釉稻育成品种議晚釉19号为试材，种子育苗后移栽至大田进行常规管理。随机 选取160个单株，取其幼嫩叶片，-20°C冻存备用。
[0049] 2.基因组DNA提取:采用CTAB法分别提取160个单株叶片的基因组DNA。
[0050] 3.引物合成及筛选
[0051] (1)合成引物：参考水稻SSR引物序列，随机选择550对引物，经生工生物工程（上 海)股份有限公司合成引物。
[0052] (2)引物筛选:采用160个单株DNA模板，利用全部550对引物进行扩增，扩增产物经 聚丙締酷胺凝胶电泳、凝胶银染，根据扩增结果，剔除不具多态性的引物，共筛选出12对特 异多态性引物，其中引物