专利名称：一种通过特异性dna片段识别水稻糯性基因的分子标记方法
技术领域：
本发明涉及分子标记方法，具体涉及用于识别作物特异性基因的分子标记方法。
背景技术：
水稻蜡质基因编码结合在淀粉粒上的淀粉合成酶(granule-bound starch synthase，GBSS)，又称Wx蛋白，该蛋白催化合成直链淀粉。非糯性水稻直链淀粉含量(amylose content，AC)在7~33％，。Sano等(1986)根据Wx蛋白的特性，将非糯蜡质基因进一步分为Wxa和Wxb两种等位基因，其中籼稻以Wxa为主，AC较高，粳稻全为Wxb，AC较低。糯性水稻的AC含量小于2％。
目前有关水稻非糯性Wx基因的分子标记已有报道，Bligh等(1995)根据在非糯性水稻蜡质基因的序列分析中发现的位于该基因前导内含子剪接位点上游55bp处的一段(CT)n微卫星序列而设计了一对SSR标记引物484/485，由于(CT)n的重复次数在Wxa和Wxb之间不同，此标记可用于区分Wxa和Wxb两种等位基因。蔡秀玲等(2002)通过Wxa和Wxb的特定序列位点的差异，根据Wxb基因第一内含子5′端的剪接位点为GT，Wxa基因的为TT这一差异，在此突变位点上下游区域设计一对PCR引物，并利用内切酶AccI只识别未突变位点及其旁邻序列gtatac而不能识别突变位点及其旁邻序列ttatac的特点，建立的能特异性识别两种非糯蜡质基因的CAPS分子标记PCR-AccI，该标记也可用于区分Wxa和Wxb两种等位基因。但上述分子标记均不能专区分糯稻与非糯稻Wx基因，目前也无有关水稻糯性Wx基因专一性分子标记的报道。
Masayuki Isshiki等(2001)对一个糯稻品种Wx基因的测序发现，该Wx基因在第二外显子上有一段46bp、碱基序列为ACGGGTTCCAGGGCCTCAAGCCCACGGGTTCCAGGGCCTCAAGCCC的DNA片段，而非糯稻Wx基因中只有23bp、碱基序列为ACGGGTTCCAGGGCCTCAAGCCC的片段，比糯性水稻的少23个核苷酸。在此基础上，本发明通过对荆糥6号和沱江糥5号等20个糯稻品种的Wx基因进行测序后证实，该片段为糯稻的Wx基因所特有，是水稻糯性Wx基因的标志性特异片段(为了便于叙述，在本专利申请中将此片段简称为特异性片段)。
糯稻是水稻中重要的品种类型，具有很高的食用价值和工业价值。由于水稻糯性Wx基因对于非糯性Wx基因为隐性，在育种过程中当两者处于杂合状态时从外观上无法区别，但如有相应的分子标记则能鉴别糯性Wx基因是否存在，从而为育种选择提供准确的依据。
发明内容
本发明的目的就是公开了一种通过特异性DNA片段识别水稻糯性基因的分子标记方法。
本发明通过以下方式实现本发明以水稻糯性Wx基因的特异性片段为核心序列设计并合成引物，利用该引物对待测水稻样品的DNA进行PCR扩增，通过对扩增产物的检测(电泳等方式)，以扩增产物中是否含有全部或部分特异性片段来识别待测样品中是否含有水稻的糯性Wx基因。
为了保证对水稻糯性Wx基因PCR扩增的特异性，根据特异性片段的序列特征，引物设计的范围以特异性片段为核心，向左右两侧序列各延伸500个核苷酸，共1046个核苷酸，以下为该片段的核苷酸序列(其中加粗斜体的字母为特异性片段序列)1 TTAATCATTC ATCTGATCTG CTCAAAGCTC TGTGCATCTC CGGGTGCAAC GGCCAGGATA61TTTATTGTGC AGTAAAAAAA TGTCATATCC CCTAGCCACC CAAGAAACTG CTCCTTAAGT121 CCTTATAAGC ACATATGGCA TTGTAATATA TATGTTTGAG TTTTAGCGAC AATTTTTTTA181 AAAACTTTTG GTCCTTTTTA TGAACGTTTT AAGTTTCACT GTCTTTTTTT TTCGAATTTT241 AAATGTAGCT TCAAATTCTA ATCCCCAATC CAAATTGTAA TAAACTTCAA TTCTCCTAAT301 TAACATCTTA ATTCATTTAT TTGAAAACCA GTTCAAATTC TTTTAGGCTC ACCAAACCTT361 AAACAATTCA ATTCAGTGCA GAGATCTTCC ACAGAACAGC TAGACAACCA CCATGTCGGC421 TCTCACCACG TCCCAGCTCG CCACCTCGGC CACCGGCTTC GGCATCGCCG ACAGGTCGGC481 GCCGTCGTCG CTGCTCCGCC ACGGGTTCCA GGGCCTCAAG CCCACGGGTT CCAGGGCCTC601 AAGCCCCGCA GCCCCGCCGG CGGCGACGCG ACGTCGCTCA GCGTGACGAC CAGCGCGCGC661 GCGACGCCCA AGCAGCAGCG GTCGGTGCAG CGTGGCAGCC GGAGGTTCCC CTCCGTCGTC721 GTGTACGCCA CCGGCGCCGG CATGAACGTC GTGTTCGTCG GCGCCGAGAT GGCCCCCTGG781 AGCAAGACCG GCGGCCTCGG TGACGTCCTC GGTGGCCTCC CCCCTGCCAT GGCTGTAAGC901 ACACACAAAC TTCGATCGCT CGTCGTCGCT GACCGTCGTC GTCTTCAACT GTTCTTGATC961 ATCGCATTGG ATGGATGTGT AATGTTGTGT TCTTGTGTTC TTTGCAGGCG AATGGCCACA1021 GGGTCATGGT GATCTCTCCT CGGTACGACC AGTACAAGGA CGCTTGGGAT ACCAGCGTTG1081 TGGCTGAGGT AGGAGCATAT GCGTGATCAG ATCATCACAA GATCGATTAG CTTTAGATGA1121 TTTGTTACAT TTCGCAAGAT TTTAAC引物设计时，将上游引物5′端核苷酸的位置限制在上述1046个核苷酸片段中第1～523个核苷酸的序列范围内，超过此限范围，上游引物将导致对水稻糯性Wx基因扩增的特异性降低甚至不再具有特异性；下游引物的反向互补序列的3′端核苷酸则限制在上述1046个核苷酸片段中第524～1046个核苷酸的序列范围内，超过此限范围，下游引物也将导致对水稻糯性Wx基因扩增的特异性降低甚至不再具有特异性。引物的长度在18个核苷酸左右。引物设计完成后，按照设计的引物序列合成引物。引物的合成可交专业DNA合成公司合成。合成引物后，即可进行DNA的扩增。首先提取待测样品的DNA，现已报道的DNA提取方法很多，可任意选择一种。然后在0.2ml的PCR扩增专用薄壁管中，依次加入10～40ng待测样品DNA，上、下游引物各2.5pM，1mM MgCl2，4种dNTP(dCTP、dGTP、dATP、dTTP)各50μM及0.4个单位的taq聚合酶，反应总体积为12.5μl。除待测样品DNA和引物外，各试剂(dNTP、tap酶等)及实验用品(薄壁管、吸管、吸头等)均在专业公司购买。将加好样的薄壁管放入PCR循环仪进行扩增反应。扩增条件为95℃下变性60秒；在55~68℃下复性20秒；72℃延伸10秒；循环33次。扩增结束后，取3～4μl扩增产物点样，1.5％琼脂糖凝胶，80v，电泳15min。电泳完毕后，凝胶于EB溶液中染色15min，GelDoc2000凝胶自动成相系统(Bio-RAD公司)照相分析。
根据引物设计的位置，在对水稻糯性基因进行扩增时产生的DNA扩增片段中所含水稻糯性Wx的特异性片段的大小有所不同当上、下游引物的部分或全部序列均不在水稻糯性Wx的特异性片段上时，扩增出的水稻糯性Wx基因的DNA片段具有完整的特异性片段；当上、下游引物之一的部分或全部序列在该特异性片段中时，扩增出的水稻糯性Wx基因的DNA片段则只具有该特异性片段的部分序列。而在对水稻非糯性Wx基因的扩增时，由于DNA模版中没有该特异性片段，用相同的引物对水稻非糯性Wx基因进行扩增时，其扩增片段比糯性Wx基因的扩增片段短，并且当引物之一的位置位于特异性片段的某些特殊的引物位置上时，非糯性Wx基因甚至会因该引物不能与之配对或配对较弱而无扩增产物产生。上述糯性与非糯性Wx基因的差异都可以通过电泳显示出来。
本方法与背景技术相比，本发明具有以下优点1、本方法能专一性的识别水稻糯性Wx基因，这是本技术最大的特色和创新点。
2、该方法可用于糯稻的新品种选育，进行糯稻的分子标记辅助育种，从而缩短糯稻新品种的育种周期，加快育种进程。
四
附图中左图为实施例1中PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测结果，扩增材料包括1-6荆糥6号、沱江糥5号、R838、明恢63、金23A、II-32A；附图中右图为实施例2中PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测结果，扩增材料包括1-6荆糥6号、沱江糥5号、R838、明恢63、金23A、II-32A。
五具体实施例方式
实施例1I.引物的合成将上、下游引物均设计在水稻糯性Wx基因特异性片段的两侧，引物不含该特异性片段的序列，上游引物5′-TCA CCA CGT CCC AGCTCG-3′位于该特异序列左侧(上述Wx基因序列中423～440bp处)，下游引物5′-ACC GAC CGC TGC TGC TTG-3′的反向互补序列位于该特异序列右侧(上述Wx基因序列中609～626bp处)，两个引物所涉及的扩增片段总长度为204bp，由于上、下游引物均不在该特异序列上，所以该片段具有完整的水稻糯性Wx基因的特异序列，而相应的非糯性Wx基因的片段长度为181bp。
II.引物的合成 本技术的引物由上海博雅生物工程有限公司合成。
III.DNA提取 现已报道的DNA提取方法很多，可任意选择。本技术使用的是卢扬江等(1992)报道的水稻DNA提取方法。
IV.DNA扩增PCR反应在9700(AB公司)上进行，体积均为12.5ul，其中模板DNA 2ul(30ng)，10×Taq缓冲液1.25ul，2.5pM上下游引物各1ul，2.5mM dNTP混合液1ul，LA Taq酶(Takara)0.4U。扩增反应条件如表1。
表1 PCR反应条件
V.电泳在DYC微型水平电泳槽(北京六一厂)上进行。点样4ul，1.5％琼脂糖凝胶，80v，电泳15min；所用DNA分子量标准为DL2000(天为时代公司)，参照物片段(bp)从小到大依次为100、250、500、750、1000、2000。电泳完毕，凝胶于EB溶液中染色15min，GelDoc2000凝胶自动成相系统(Bio-RAD公司)照相分析。结果如说明书附图中A图所示(荆糥6号和沱江糥5号为糯稻品种，R838、明恢63为非糯的Wxb品种，金23A及II-32A为非糯的Wxa品种)。
实施例2引物的设计上游引物5′-GGG TGC AAC GGC CAG GAT-3′位于水稻糯性Wx基因的特异性片段左侧(上述Wx基因序列中42～59bp处)，下游引物5′-TGG AAC CCG TGG GCT TGA-3′的反向互补序列位于该特异性片段的中部(上述Wx基因序列中516～533bp处)，两个引物所涉及的扩增片段总长度为492bp，由于下游引物的全部序列都在该特异性片段上，在糯性Wx基因的扩增片段中只具有部分该特异性片段，但在非糯性Wx基因中，由于下游引物位于该特异性片段特殊的位置上，使该引物不能与非糯性Wx基因的相应部位配对，故在非糯性水稻Wx基因中不能产生扩增产物。结果如说明书附图中B图所示(荆糥6号和沱江糥5号为糯稻品种，R838、明恢63为非糯的Wxb品种，金23A及II-32A为非糯的Wxa品种)。
引物的合成等具体操作方法同实施例1。
实施例3引物的设计上游引物5′-TCAAGCCCACGGGTTCCA-3′位于水稻糯性Wx基因的特异性片段的中部(上述Wx基因序列中514～531bp处)，下游引物5′-GCCATTCGCCTGCAAAGA-3′的反向互补序列位于该特异性片段的右侧(上述Wx基因序列中879～896bp处)，两个引物所涉及的扩增片段总长度为383bp。
除复性温度为62℃外，引物的合成等具体操作方法同实施例1。
实施例4引物的设计上游引物5′-AGAACAGCTAGACAACCACCAT-3′位于水稻糯性Wx基因的特异性片段的左恻(上述Wx基因序列中393～414bp处)，下游引物5′-TTCGCCTGCAAAGAACAC-3′的反向互补序列位于该特异性片段的右侧(上述Wx基因序列中875～892bp处)，两个引物所涉及的扩增片段总长度为500bp。
除复性温度为56℃外，引物的合成等具体操作方法同实施例1。
权利要求
1.一种分子标记方法，其特征在于该方法是通过特异性DNA片段识别水稻糯性基因。
2.根据权利要求1所述的分子标记方法，其特征在于本方法以水稻糯性Wx基因的特异性片段为核心序列设计并合成引物，利用该引物对待测水稻样品的DNA进行PCR扩增，通过对扩增产物的检测，以扩增产物中是否含有全部或部分特异性片段来识别待测样品中是否含有水稻的糯性Wx基因。
3.根据权利要求2所述分子标记方法，其特征在于引物设计的范围以特异性片段为核心，向左右两侧序列各延伸500个核苷酸，共1046个核苷酸，以下为该片段的核苷酸序列(其中加粗斜体的字母为特异性片段序列)1TTAATCATTC ATCTGATCTG CTCAAAGCTC TGTGCATCTC CGGGTGCAAC GGCCAGGATA61 TTTATTGTGC AGTAAAAAAA TGTCATATCC CCTAGCCACC CAAGAAACTG CTCCTTAAGT121 CCTTATAAGC ACATATGGCA TTGTAATATA TATGTTTGAG TTTTAGCGAC AATTTTTTTA181 AAAACTTTTG GTCCTTTTTA TGAACGTTTT AAGTTTCACT GTCTTTTTTT TTCGAATTTT241 AAATGTAGCT TCAAATTCTA ATCCCCAATC CAAATTGTAA TAAACTTCAA TTCTCCTAAT301 TAACATCTTA ATTCATTTAT TTGAAAACCA GTTCAAATTC TTTTAGGCTC ACCAAACCTT361 AAACAATTCA ATTCAGTGCA GAGATCTTCC ACAGAACAGC TAGACAACCA CCATGTCGGC421 TCTCACCACG TCCCAGCTCG CCACCTCGGC CACCGGCTTC GGCATCGCCG ACAGGTCGGC481 GCCGTCGTCG CTGCTCCGCC ACGGGTTCCA GGGCCTCAAG CCCACGGGTT CCAGGGCCTC601 AAGCCCCGCA GCCCCGCCGG CGGCGACGCG ACGTCGCTCA GCGTGACGAC CAGCGCGCGC661 GCGACGCCCA AGCAGCAGCG GTCGGTGCAG CGTGGCAGCC GGAGGTTCCC CTCCGTCGTC721 GTGTACGCCA CCGGCGCCGG CATGAACGTC GTGTTCGTCG GCGCCGAGAT GGCCCCCTGG781 AGCAAGACCG GCGGCCTCGG TGACGTCCTC GGTGGCCTCC CCCCTGCCAT GGCTGTAAGC901 ACACACAAAC TTCGATCGCT CGTCGTCGCT GACCGTCGTC GTCTTCAACT GTTCTTGATC961 ATCGCATTGG ATGGATGTGT AATGTTGTGT TCTTGTGTTC TTTGCAGGCG AATGGCCACA1021 GGGTCATGGT GATCTCTCCT CGGTACGACC AGTACAAGGA CGCTTGGGAT ACCAGCGTTG1081 TGGCTGAGGT AGGAGCATAT GCGTGATCAG ATCATCACAA GATCGATTAG CTTTAGATGA1121 TTTGTTACAT TTCGCAAGAT TTTAAC
4.根据权利要求3所述分子标记方法，其特征在于引物设计时，将上游引物5′端核苷酸的位置限制在权利要求3所述1046个核苷酸片段中第1～523个核苷酸的序列范围内；下游引物的反向互补序列的3′端核苷酸则限制在权利要求3所述1046个核苷酸片段中第524～1046个核苷酸的序列范围内。
5.本发明方法在水稻育种中的应用。
全文摘要
本发明涉及分子标记方法，针对目前水稻育种中糯性基因不易识别的问题，本发明公开了一种通过特异性DNA片段识别水稻糯性基因的分子标记方法，以水稻糯性Wx基因的特异性片段为核心序列设计并合成引物，利用该引物对待测水稻样品的DNA进行PCR扩增，通过对扩增产物的检测，以扩增产物中是否含有全部或部分特异性片段来识别待测样品中是否含有水稻的糯性Wx基因，本方法能专一性的识别水稻糯性Wx基因，用于糯稻的新品种选育，可缩短糯稻新品种的育种周期，加快育种进程。
文档编号C12N15/11GK1837373SQ20051002054
公开日2006年9月27日 申请日期2005年3月21日 优先权日2005年3月21日
发明者罗科, 田洁, 孙华钦 申请人:中国科学院成都生物研究所