一种运用根癌农杆菌介导的水稻转化方法
【专利摘要】本发明公开了一种运用根癌农杆菌介导的水稻转基因方法。不进行愈伤组织培养，将沾有外源基因的根癌农杆菌菌液的接种针直接侵染受体水稻种子的胚芽生长点，完成转基因操作。分别选用含转化质粒pBI121-GUS的农杆菌和pCDMARUBA-Hyg的农杆菌为转化载体菌株，以粳稻南粳45与南粳47和籼稻9311为转基因受体水稻品种验证了本发明。本方法与传统的农杆菌介导法不同的是，本方法不需诱导愈伤组织以及之后的一系列组织培养过程，节省了大量的人力和财力，且时间比较短；克服了在其它方法中籼稻品种难以转化的问题；转化载体可不必插入标记基因，具有简单、快速、高效、通用、安全的优点，是一种改良的水稻转基因新技术。
【专利说明】一种运用根癌农杆菌介导的水稻转化方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种运用根癌农杆菌介导的简单、快速、高效的水稻转化方法的建立，属于水稻遗传改良与农业生物技术应用领域。
【背景技术】
[0002]人口、资源、环境一直是人类生存与发展所面临的主要问题。近年来，由于人口增长、气候变化等因素，出现了全球性的粮食短缺，主要农产品价格快速上涨，在世界范围内造成了粮食危机与恐慌。而水稻作为世界上最重要的粮食作物之一，进一步提高水稻产量具有极其重要的意义。但是，可利用的耕地和淡水资源逐年减少，大量使用农药、化肥导致环境严重污染同时增加了农业生产成本和农民负担，农业生态系统遭受严重破坏，因此，确保粮食安全的根本途径在于提高作物单产。依靠惯有方法很难培育出在产量潜力上有大突破的新品种。近二十几年来，通过转基因技术培育转基因高产作物不断传出佳讯。转基因技术作为一种可持续发展的方式，可提高农作物产量和品质，具有良好的发展潜力和前景，将为世界农业发展注入新的动力[1]。
[0003]目前，在水稻育种上相继开发研究的转基因技术有以农杆菌为主导的载体介导转基因技术；以基因枪、PEG等介导的基因直接导入技术和以花粉管通道转化、生殖细胞浸泡吸收为主的种质系统转化技术，尤以农杆菌介导技术、基因枪导入技术和花粉管通道技术的研究报道最多，其中农杆菌介导技术占64%[2]。
[0004]以载体介导的转化，即利用另一种生物来实现基因的转入和整合，主要的方法就是农杆菌介导法。农杆菌细胞内的Ti质粒或Ri质粒具有一段T-DNA，可通过农杆菌侵染植物伤口进入细胞，并插入到植物基因组中。通过将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染，可实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株[3]。自`从1978年Chilton等M第一次利用农杆菌的Ti质粒为载体将T-DNA上的胭脂碱基因转入烟草细胞以来，根癌农杆菌在双子叶植物转化中得到了广泛应用。1986年，Baba等[5]通过PEG法将农杆菌原生质球与水稻原生质体融合，获得了能够合成胭脂碱的水稻转化组织。之后，科学界开始对农杆菌介导的水稻转化进行了广泛的研究，试图通过转基因技术来提高水稻产量、改良品质和增强抗性[6_8]。但是，由于国内外各个实验室所使用的基因型、外植体的不同和培养环境条件的差异，造成了各个转化体系中的结果不尽相同，转化率也普遍不高。所以，近二十几年来，不同研究人员分别从Ti质粒的改造、转化载体的构建和组织培养方面入手，不断优化农杆菌介导的水稻转化方法，以期提高转化效率。一是选择最适农杆菌及优化载体。由于不同基因型水稻接受农杆菌菌株的亲和性不同，所以选取合适的农杆菌菌株和优良的质粒对转化来说非常重要。用于水稻转化的农杆菌菌株较为普遍的有A281、A656、LBA4404、EHAlOl、EHA105、AGLl。李双成等[9]以3个籼稻品种和2个粳稻品种为对象，对农杆菌转化水稻过程中影响转化效率的因素进行了研究，发现菌株AGLl和EHA105按一定比例混合共转化，对抗性愈伤率有显著影响。现在水稻农杆菌介导应用最多的是EHA105菌株。[0005]对天然Ti质粒的改造，最初只有共整合载体到现在的共整合载体、双T-DNA载体、双元载体、超级双元载体都可利用；在转化频率不断提高的同时，在去选择标记上也不断取得进步。1996年，Komari等[1°]构建了所谓的“超级双元载体”，以该载体转化农杆菌LBA4404菌株，阳性菌液侵染水稻愈伤组织，共转化率可达47%，转化植株自交后代中，约65%的植株只含报告基因而不含标记基因。2004年，殷丽青等[11]运用农杆菌介导的双T-DNA法培育含反义蜡质基因的无选择标记水稻，获得了 55.4%的共转化率，转化植株自交后代有29.2%的植株中只含有目的基因而不含选择标记基因。夏志辉[12]利用DRB双元载体培育无选择标记的转基因水稻。2005年，朱祯、李旭刚发明了一种利用双T 一 DNA载体培育无选择标记转基因水稻的方法，单子叶植物表达载体中含两个独立T - DNA结构域且带MAR(matrix attachment region)序列,提高了获得稳定的无选择标记的转基因水稻的比率，并将该体系申请了专利[13]。2007年，朱丽等M尝试利用共转化和花药培养技术相结合，快速获得了纯合的无选择标记的三价转基因水稻。这种方法仅需要一代即可获得纯合的目的植株，大大加快了研究进程。[0006]二是优化组织培养因素。1996年，Rashid等[15]利用Hiei等[16]的转化体系得到了较多的转基因水稻植株。Aldemita等[17]报道，利用农杆菌介导转化籼稻品种IR72和TCS10，稳定转化率为1%-5%。1999年，Khanna等[18]利用农杆菌介导转化水稻，来源于根尖、芽尖、幼苗以及成熟胚盾片的愈伤组织都表现出较高的稳定转化频率。2001年，陈秀花等[19]以GUS基因的瞬时表达为依据，研究了农杆菌介导转化水稻的影响因素，指出预培养4-5天的幼胚是较为理想的转化受体材料；在共培养基中添加较高浓度的乙酰丁香酮可提高GUS基因的瞬间表达频率，按此条件进行双菌共转化，抗性愈伤组织的转化率最高可达70%。2004年，夏志辉[12]利用DRB双元载体培育无选择标记的转基因水稻，并对转化效率的影响因素做了研究，(I)确定了转化过程中的最佳侵染浓度为0D600=0.2 ； (2)MS培养基比CC培养基更适合水稻成熟胚愈伤组织的诱导，但CC培养基比MS培养基更适合成熟胚愈伤组织的继代培养；(3)水稻尤其是籼稻在分化过程中对潮霉素(Hyg)最为敏感，在分化培养基中添加20mg/L Hyg就足以将转化细胞与非转化细胞区分开。在壮苗生根培养阶段，需要15mg/L的Hyg ； (4)出愈率与甘露醇的浓度密切相关，出愈率随着甘露醇的减少而增加。2005年，PutuSupartana等[2°]利用农杆菌介导直接侵染粳稻品种越光的胚芽生长点获得转基因植株，转化效率高达40%。2010年，Kenjirou Ozawa等[21]发现，利用农杆菌介导转化，在共培养过程中，用N6液体培养基比用N6固体培养基转化率提高了 10倍。2011年，李笑寒等_通过培养条件的优化，建立了一个高效的水稻转化技术体系。他们的研究结果表明，相比较于暗培养，光照培养进行愈伤诱导可以使诱导天数缩短4-5d;诱导培养基中加入适量的激素可以使籼稻愈伤诱导提高25%-30% ;分化培养基中加入适量的氨基酸和甘露醇可以使植株再生频率提高15%_20%。AlagarsamyKarthikeyan等[23]利用农杆菌侵染籼稻ADT43叶片来源的愈伤获得转基因植株，将籼稻的转化率提高到9.33%，且在Ttl与T1代植株中，目的基因拷贝数为I或2。2012年，牟晨等[24]通过对经典水稻转基因方法的优化和改进，使用成熟胚，采取升汞灭菌，侵染时农杆菌的0D_值为0.1时，转化效率较原方法提闻约23%。
[0007]综上所述，农杆菌介导转基因技术经过近二十几年的发展和优化，转化条件、转化效率等都得到了长足的改进和提高，但与现代农业形势对转基因产品的需求相比，其步伐仍然不够快，仍存在许多障碍和安全隐患，仍需进一步加强农杆菌介导转化技术的研发，突破核心技术，以培育满足人们需求的转基因水稻新品种。
[0008]利用植物生长点转化的原理可能是外源DNA通过细胞间隙进入茎尖生长点细胞部位，并转化生长点细胞，产生转基因后代。近年来，有一些关于植物生长点用于转化的报道，特别是在小麦、玉米上。1996年，杜立群等[25]用小麦的生长点作为外源基因的直接受体，利用基因枪轰击小麦生长点获得转基因小麦。2005年，RAZZAQ Abdul等[26]以小麦为材料，尝试了一种对生长点直接进行转化的方法，并初步证明了这一方法的可行性。2009年，董福双等[27]以小麦品种石4185为对象，建立了“用解剖刀去除种子根、用镊子把芽鞘掰去、用镊尖扫去包盖生长点的未展开叶、将带生长点的部分与胚乳分离”为特点的受体制备方法，初步建立了基因枪法转化小麦种子芽生长点的技术，但到目前为止还未见利用该技术在水稻转基因操作相关的报道。2011年，孙传波等[28]以玉米自交系郑58的茎尖为受体，通过农杆菌介导法将抗草甘膦EPSPS基因转入玉米中，初步证明外源基因已经整合到玉米基因组中，以玉米茎尖作为受体的转化系统用于基因转化是可行、高效的。在水稻上，2001年，林拥军利用农杆菌浸种法将反义Wx基因导入水稻品种珍汕978[29]。2005年，PutuSupartana等[2°]利用农杆菌介导直接侵染粳稻品种越光胚芽生长点获得转基因植株。但是，该文献没有提及在籼稻品种上成功转化，不但所用的质粒载体偏小，而且只包含了 I个外源基因。本技术方案不但在籼稻上获得成功转化，而且还成功将2个抗虫基因同时转入水稻中。
[0009]本技术建立了一套利用根癌农杆菌介导，直接以水稻胚芽生长点为转化受体而不需诱导愈伤组织以及之后的一系列组织培养过程，避免对组织培养的过分依赖的高效、简单、快速的水稻转化体系；克服了在其它方法中基因型为籼稻品种难以转化的问题；可以不需在质粒载体上插入选择标记基因，直接对转化植株进行目的基因的检测，减轻人们对转基因生物安全性的担忧，为转化水稻提供一种简单、快速、高效、安全的方法，从而为满足现代农业形势对转基因产品的需求增添一份力量。
[0010]主要参考文献:
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【发明内容】
[0040]本发明针对传统农杆菌介导法过度依赖一系列的组织培养过程，而组织培养筛选周期较长，耗时耗费，对受体愈伤状态要求高，基因型依赖强的技术难题，以水稻胚芽生长点为转化受体，建立了优化的农杆菌介导水稻转化法，规避了传统农杆菌介导法对组织培养的过度依赖性，是本发明的宗旨。
[0041]本发明所采用的技术方案是:一种运用根癌农杆菌介导的水稻转化方法，不进行愈伤组织培养，而是将沾有外源基因的根癌农杆菌菌液的接种针直接侵染受体水稻种子的胚芽生长点，完成转基因操作。
[0042]本发明方法中所述受体水稻种子的胚芽生长点是切除种根和幼芽后的胚芽生长点，或者是未去壳萌发后的胚芽生长点。
[0043]本发明的方法既适用于粳稻品种也适用于籼稻品种。
[0044]本发明方法所述受体水稻种子可选自用成熟水稻种子浸泡24-36h后的材料。
[0045]本发明的一个实例，其主要步骤包括:
[0046]I)选用南粳45(粳稻)和9311 (籼稻)的成熟胚作为转基因受体。
[0047]2)选用的转化质粒载体pBI121-GUS含gus基因；质粒载体pCDMARUBA_Hyg含sbk、sck和hpt基因。
[0048]3)将未去壳的水稻种子先用75%的乙醇浸泡5min，再用0.1%的升汞杀菌18min，无菌水冲洗3-4次，消毒后的种子浸放在无菌水中，置于26-28°C恒温培养箱中培养I-3d。
[0049]4)用沾有扩大培养后的农杆菌液的接种针直接侵染已经处理过水稻种子的胚芽生长点(或者已切除种根和幼芽的胚芽生长点)，然后将侵染后的水稻种子放入植物培养瓶中(植物培养瓶里盛有2cm厚的蛭石，蛭石上铺有一张湿润的滤纸)；22-24°C暗培养9-14d。
[0050]5)将暗培养后苗长为IOcm左右的转化苗浸泡在浓度为lmg/mL的头孢霉素溶液中lh，之后将苗移到网室中种在盆钵中，盆钵直径30cm，5棵/盆[0051]6)在水稻长至7、8叶期，对转pBI121-GUS载体的植株取叶片进行DNA检测和⑶S组织化学检测，对转pCDMARUBA-Hyg载体的植株取叶片进行外源基因DNA检测和抗虫试纸条检测。[0052]本发明的水稻转化方法，具有以下优点:
[0053]I)本发明方法不需诱导愈伤组织以及之后的一系列组织培养过程，即不须配制各种培养基、控制各种培养条件并对其不断进行优化调整，利用传统农杆菌介导法获得转基因植株的周期至少为2-4个月，而应用本方法只需10-15d，由此可见，本发明技术在大大缩短培养周期的同时节省了大量的财力物力，极大的简化了农杆菌介导转化法的流程，提高了转化的工作效率。
[0054]2)本发明方法克服了在其它方法中基因型为籼稻品种难以转化的问题，不仅将基因成功的导入粳稻品种南粳45中，而且也成功导入籼稻品种9311中。
[0055]3)本发明方法所用的转化载体可以不须插入标记基因或报告基因，转化载体只需携带目的基因和基本构件，在进行农杆菌侵染转化后待转化植株成苗，直接对转化植株进行目的基因的检测，提高了转基因水稻的安全性，减轻了人们对转基因生物安全性的担忧。
【专利附图】
【附图说明】
[0056]图1质粒PBI121-GUS结构示意图。
[0057]图2质粒pCDMARUBA-Hyg结构不意图。
[0058]图3转gus基因Ttl代植株的PCR检测(M:DL2000DNA Marker ；ck:未转化植株DNA ；
[0059]P:阳性质粒DNA ；1-26:转gus基因植株)。
[0060]图4?；转化植株的抗虫基因sbk检测(注:CK:未转化植株；P:阳性质粒DNA;M:DL2000Marker ；9:9311 ；45:南粳 45 ；83:南粳 47)
[0061]图5部分转基因Ttl代`植株gus基因的组织化学检测(ck-:未转化植株叶片)。
[0062]图6部分转基因T1代植株群体的PCR检测(注:ck:未转化植株DNA ；P:阳性质粒DNA ；
[0063]M:DL2000Marker ;其余为转基因T1代植株)。
[0064]图7部分转基因T1代植株gus基因的组织化学检测(注:ck:未转化植株)
[0065]图STci转化植株的PCR检测(注:CK:未转化植株;P:阳性质粒DNA ；M:DL2000Marker ；41-49:南粳 45)。
【具体实施方式】
[0066]质粒载体pBI121-GUS (Plant Cell R印orts, 2009，28 (9): 1319-1327)携带有PBI121-GUS质粒的EHA105菌株，南京晓庄学院蔡小宁教授实验室提供；
[0067]质粒载体pCDMARUBA-Hyg (ZL02107429.1,朱祯李旭刚，一种利用双T-DNA载体培育无选择标记转基因水稻的方法)引自中国科学院遗传与发育研究所朱祯研究员项目组。
[0068]实施例1—胚芽生长点直接侵染法
[0069]1.选用水稻(Oryza sativa L.)品种南粳45 (粳稻)、南粳47 (粳稻)和9311 (籼稻)成熟种子作为转基因受体，其种子均已商品化，来源于江苏省农业科学院粮食作物研究所。
[0070]2.将未去壳的水稻种子先用75%的乙醇浸泡5min，再用0.1%的升汞杀菌18min，无菌水冲洗3-4次，消毒后的种子浸放在无菌水中，置于26-28°C恒温培养箱中培养I-3d。[0071]3.植物表达载体农杆菌的培养与检测
[0072]I)植物表达载体农杆菌的培养
[0073]A.分别取农杆菌LBA4404菌液(带有转化质粒pBI121_⑶S，质粒pBI121_GUS结构如图1)和农杆菌EHA105菌液(带有转化质粒pCDMARUBA-Hyg，质粒pCDMARUBA-Hyg结构如图2)200 μ L于1.5ml离心管中，用接种环进行平板划线(培养皿中含卡那霉素，50ug/mL;利福平，50ug/mL)，28°C倒置培养48h，挑选单菌落接种于IOml的LB液体培养基中(含50mg
? L—1利福平和50mg.I/1卡那霉素)，28°C，200rpm振荡培养24h。
[0074]B.取培养好的检测有阳性质粒的上述两种菌液各1ml，分别放至IOOml液体LB培养基(含IOOuM乙酰丁香酮)中扩大培养，28°C 200rpm振荡培养至OD6c?值为0.4。为了便于观察和使菌状态良好，扩大培养液里不加抗生素。
[0075]2)植物表达载体农杆菌阴阳性的检测
[0076]A.质粒DNA的提 取
[0077]用BIOMIGA EZgene公司生产的Plasmid Miniprep Kit试剂盒对上述两种质粒DNA进行微量提取，步骤如下:
[0078]①取I-4mL ( —般2mL)在LB液体培养基中培养过夜的菌液，室温下10，OOOrpm离心lmin，收集菌体，并尽可能的吸去上清。
[0079]②加入250 μ L已加入RNaseA的Bufffer Al，用涡流震荡器震荡重悬细菌沉淀，悬浮需充分，不应留有小菌块。
[0080]③加入250 μ L Bufffer BI，温和并充分地上下翻转混合10次，然后静置5min至
溶液粘稠而澄清。
[0081]④加入350 μ LBufffer NI，立即反转多次，至溶液充分混匀，此时出现白色絮状沉淀。
[0082]⑤将离心管转至高速离心机,在室温下13000rpm离心lOmin。
[0083]⑥小心吸取离心后的上清液至带有收集管的DNA柱中，室温下13000rpm离心Imin，倒掉收集管中的废液，将离心柱重新放回到收集管中。
[0084]⑦向DNA柱中加入500 μ L Buffer KB,室温下13000rpm离心lmin,倒掉收集管中
的废液，将离心柱重新放回到收集管中。
[0085]⑧向离心柱中加500 μ L DNA Wash Buffer (确保已加入无水乙醇！)，室温下13，OOOrpm离心lmin，倒掉收集管中的废液，将离心柱重新放回到收集管中。重复该步骤I次。
[0086]⑨将离心柱放回高速离心机中开盖，室温下13000rpm离心2min，以彻底去除残留的乙醇。
[0087]⑩将离心柱移入新的1.5mL离心管中，向DNA柱正中央加入50-100 μ L的ddH20或Elution Buffer,室温静置2min, 13000rpm离心lmin,洗脱质粒DNA。将洗脱液再加入柱中，13000rpm离心lmin,收集洗脱液。
[0088]B.质粒DNA检测
[0089]①质粒pBI121-GUS基因扩增
[0090]目的基因gus。
[0091]PCR 扩增体系:PCR buffer2.0yL, dNTP2.0μ L，引物 2.0 μ L (表 1)，TaqDNA 聚合酶 0.2 μ L，DNA2.0 μ L，补充 ddH20 M 20 μ L0
[0092]PCR 扩增程序为:94°C，5min ；94 °C, 30sec, 57 °C, 30sec, 72 °C，30sec，35 个循环；72°C，IOmin0扩增结果加指示剂后用1%的琼脂糖凝胶进行110v、lh电泳后照相。
[0093]选取PCR扩增结果为阳性的菌液进行扩大培养。
[0094]②质粒pCDMARUBA-Hyg基因扩增
[0095]目的基因sbk、sck和标记基因hpt的PCR扩增体系和扩增程序均一致。
[0096]PCR 扩增体系:PCR buffer2.0 μ L，dNTP2.0 μ L，引物 2.0 μ L (表 1)，TaqDNA 聚合酶 0.2 μ L，DNA2.0 μ L，补充 ddH20 M 20 μ L0
[0097]PCR 扩增程序为:94°C,5min ；94°C, 30sec, 56 °C, 30sec, 72 °C, 30sec, 35 个循环；72°C，lOmin。扩增结果加指示剂后用1%的琼脂糖凝胶进行电泳110v，Ih后照相。
[0098]选取PCR扩增结果为阳性的菌液进行扩大培养。
[0099]4.转基因受体水稻品种的遗传转化
[0100]以下操作均要求在无菌条件下进行。
[0101]用沾有扩大培养后的0D_值为0.4扩大培养的农杆菌液的接种针刺入胚芽生长点；将针刺后的种子放入植物培养瓶中(植物培养瓶里盛有2cm厚的蛭石，蛭石上铺有一张湿润的滤纸)，10粒/瓶，22-24°C暗培养9-14d。
[0102]用含质粒pBI121-GU`S的农杆菌按照上述方法侵染90粒南粳45水稻种子；用含质粒pCDMARUBA-Hyg的农杆菌按照上述方法侵染98粒9311、100粒南粳45和100粒南粳47水稻种子。
[0103]5.水稻转化苗的杀菌与移苗
[0104]将暗培养后苗长为IOcm左右的转化苗浸泡在lmg/ml的头孢霉素溶液中Ih,之后将苗移到网室中种在盆钵中，盆钵半径15cm，5棵/盆。
[0105]6.转基因苗的PCR检测
[0106]待处理后的苗长至7、8叶，株高40cm以上，每株取200mg左右嫩叶(以未针刺水稻苗为阴性对照)进行DNA检测。
[0107]用SDS法从水稻(转基因Ttl代与非转基因)新鲜叶片中微量提取总DNA。
[0108](I)取约200mg新鲜的水稻叶片用液氮速冻后研磨成粉末，迅速转移至2mL离心管中；
[0109](2)加入 650 μ L 经 65°C预热的 SDS 抽提缓冲液(0.1M Tris-HCl, ρΗ8.0 ；0.05ΜEDTA, ρΗ8.0 ；0.5Μ NaCl ；1.25%SDS)，65°C水浴 30min，每隔 IOmin 摇动混匀；
[0110](3)加入 150μ L5M KAc (ρΗ5.2)摇匀，冰浴 30min ；
[0111](4)加入350 μ L24:1的氯仿异戊醇混合液，摇动混匀，静置3min ；
[0112](5) 12，OOOrpm离心lOmin，小心转移上清于一洁净的1.5mL离心管中；
[0113](6)加入800μ L-20°C预冷的无水乙醇，轻轻颠倒混匀，在_20°C冰箱自由沉降20min ；
[0114](7) IOOOOrpm离心6min,弃上清收集沉淀；
[0115](8)加入400 μ L75%的乙醇洗涤沉淀；
[0116](9)倒掉乙醇，超净台上吹干沉淀后加入200μ LlXTE(pH8.0)溶解，_4°C保存备用。[0117]非转基因单株设为阴性对照，上述质粒DNA检测为阳性的质粒DNA为阳性对照。以水稻基因组DNA为模板，转质粒pBI121-GUS的水稻植株以GUS基因的序列设计引物进行转基因植株的PCR分析；转质粒pCDMARUBA-Hyg的水稻植株分别以SBK、SCK、HPT基因的序列设计引物进行转基因植株的PCR分析(表I)。
[0118]表I基因位点或连锁标记的引物序列
[0119]
【权利要求】
1.一种运用根癌农杆菌介导的水稻转化方法，其特征在于该方法不进行愈伤组织培养，将沾有外源基因的根癌农杆菌菌液的接种针直接侵染受体水稻种子的胚芽生长点，完成转基因操作。
2.根据权利要求1所述的根癌农杆菌介导的水稻转化方法，其特征在于所述受体水稻种子的胚芽生长点是切除种根和幼芽后的胚芽生长点，或者是未去壳萌发后的胚芽生长点。
3.根据权利要求1或2所述的根癌农杆菌介导的水稻转化方法，其特征在于所述的水稻是梗稻品种或軸稻品种。
4.根据权利要求1或2所述的根癌农杆菌介导的水稻转化方法，其特征在于所述受体水稻种子是用成 熟水稻种子浸泡24-36h后的材料。
【文档编号】C12N15/84GK103451230SQ201310434861
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年9月23日 优先权日:2013年9月23日
【发明者】张启军, 颜文飞, 吕川根, 刘少奎, 赖东, 张斌, 秦海龙, 廖慧敏, 宗寿余, 夏士键, 虞德容 申请人:江苏省农业科学院