一种发根农杆菌介导的转基因灯盏花毛状根转化方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物生物技术中的植物基因工程技术领域，具体而言，设及一种发根 农杆菌介导的转基因灯盏花毛状根遗传转化的方法。
【背景技术】
[0002] 植物细胞的遗传转化是植物基因工程的一个关键环节。自Abel等（1986)将烟草 花叶病毒灯MV)衣壳蛋白cDNA导入烟草细胞，获得抗TMV病毒的转基因烟草植株后，先后 发展了许多植物遗传转化方法和技术。
[0003] 灯盏花Elrigeron breviscapus (Vant. )Hand-Mazz.又名灯盏细辛、短亭飞蓬，是为 菊科飞蓬属多年生草本植物。其主要有效成分为灯盏花素，即灯盏乙素和少量灯盏甲素的 混合物。灯盏花素具有舒张血管、改善微循环、抑制血小板及红细胞聚集，治疗冠屯、病、屯、绞 痛、肾衰和高血脂症等疾病等多种作用。但是作为云南最有发展前景的药物之一，却面临着 种质退化的严峻挑战。因此，从处于代谢节点处的关键基因着手，改善灯盏花的种质，提高 灯盏花素的含量成为亟待解决的问题。
[0004]目前尚未有灯盏花遗传转化体系建立的报道。
[0005] 自 1907 年Smith和Townsend发现发根农杆菌（Agrobacteriumrhizogenes)會b 诱导植物形成毛状根化ai巧root)W来，迄今为止已经有160多种植物成功地利用化质 粒进行了转化。例如：中国专利CN200910237579. 2,申请公布号为CN102057868A，发明名称 为"一种金铁锁毛状根系的诱导与培养方法"，公开了一种金铁锁毛状根系高效诱导与培养 方法：取金铁锁幼嫩茎为外植体进行脱分化处理，获得新鲜金铁锁愈伤组织，将愈伤组织与 含有化质粒的发根农杆菌（ACCC10060)共培养，W无菌纸吸取多余菌液后转入到诱导培养 基中诱导培养，在金铁锁愈伤组织处生长出金铁锁毛状根；抑菌培养后将具有毛状根的外 植体放入扩增培养基中进行毛状根的扩大培养。又如：中国专利申请CN201310603423. 8， 申请公布号为CN103695462A，发明名称为"一种甜叶菊毛状根诱导和培养生产绿原酸和二 咖啡酷奎宁酸的方法"，公开了一种采用转基因技术，用发根农杆菌侵染甜叶菊外植体，获 得产绿原酸和二咖啡酷奎宁酸的甜叶菊毛状根的方法。
[0006] 影响发根农杆菌转化成功的因素有很多，包括转化植株的种类、部位、生理状态； 发根农杆菌的种类、细胞悬浮液密度；培养基组成和培养条件等等。
[0007] 不同的植物要通过发根农杆菌诱导形成毛状根，W及W此为基础获得高品质的转 基因植株还是要付出艰辛的工作的。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供一种通过发根农杆菌诱导灯盏花形成毛状根的方法。
[0009] 本发明提供了一种发根农杆菌巧8C1介导的转基因灯盏花毛状根转化方法，本发 明为了做到取材方便，直接用灯盏花无菌苗叶作为外植体，在此基础上建立了W叶片为外 植体的发根农杆菌巧8C1介导的灯盏花转基因毛状根遗传体系的方法，不仅减少所使用仪 器的费用，使实验操作技术容易在普通实验室进行，而且也为今后利用转基因技术对灯盏 花进行遗传改良提供了技术上的支持。
[0010] 本发明选择的MS和B5培养基，是植物细胞工程的常用培养基，广泛地应用于植物 组织培养，效果良好。本发明所用的植物培养基除培育无菌苗是WMS作为基础培养基外， 其余均WB5为基本培养基，根据不同的培养期，特定地添加了不同种类、不同浓度的抗生 素。
[0011] 本发明是将预培养后的灯盏花叶片外植体浸入含有携带目的基因和筛选基因的 重组质粒的发根农杆菌菌液中，具体的技术方案如下： 阳〇1引 （1)提取携带目的基因的重组閒B-Flag质粒
[0013] 将含有重组质粒的大肠杆菌化ansl-Tl菌检、测序验证后，接种到含75mg/L卡那 霉素化an)的LB液体培养基（配制试剂购自生工生物公司）中，在37°C、200巧m的条件下 过夜培养；用质粒小提试剂盒（购自全式金生物公司）提取重组质粒。该方法属于一般分 子生物学常规操作。
[0014] 本发明所述目的基因可W依实验目的不同而不同，在本发明的具体实施例中W CHI(查尔酬异构酶基因）为例；也可选择C服（查尔酬合成酶基因）、F3H(类黄酬3'-径化 酶基因）等目的基因。
[0015] 本发明所述的筛选基因是指P皿-Flag质粒自身携带的潮霉素（Hyb)抗性基因。
[0016] (2)准备遗传转化使用的灯盏花外植体 阳017] 将灯盏花种子用0. 1 %升隶消毒lOmin后，无菌水漂洗3-5次，用无菌吸水纸吸除 残留水分，接种到MS培养基上，在溫度25 +rC、光照强度40001X、光周期为1化光照化黑 暗的条件下培养45-60天，获得灯盏花无菌苗。
[0018] 将灯盏花无菌苗叶片剪成0.5-lcm2大小的叶盘，接种到预培养培养基上，在 25 +rC条件下暗培养2天，作为遗传转化的受体。
[0019] 培养灯盏花无菌苗的培养基为：MS+30g/L薦糖巧.5g/L琼脂。pH5. 6-5. 8 ;
[0020] 叶盘预培养培养基为：B5+30g/L薦糖巧.5g/L琼脂。抑5. 8-6. 0。
[0021] (3)含携带目的基因CHI的P皿-Flag重组质粒的巧8C1发根农杆菌工程菌的获得
[0022] 将提取的重组质粒通过冻融法导入巧8C1发根农杆菌中，再经抗生素抗性筛选及 PCR菌检鉴定，获得含有重组质粒的发根农杆菌。
[0023] (4)灯盏花叶片外植体的遗传转化
[0024] 将用含40mg/L利福平巧if)(巧8C1发根农杆菌抗性）和75mg/L卡那霉素化an) (P皿-Flag载体抗性）的Y邸培养基活化培养至ODe。。为0.6+ 0. 1的巧8C1发根农杆菌工 程菌，室溫下5000巧m离屯、lOmin，无菌条件下去上清，用等体积新鲜的含100μmol/L乙酷 下香酬（As)的B5液体培养基重悬菌体。28°C，10化pm振荡解育30min后，将预培养好的叶 盘在超净工作台中于菌液中浸染lOmin，期间不断轻轻摇晃使其浸染充分。取出外植体，用 无菌滤纸吸除残留菌液，接种于共培养培养基，25°C，暗培养2天。
[00巧]将共培养的外植体转移到除菌培养基上于25Γ无光条件下进行除菌培养，待毛状 根长出至2-3cm长后，将其剪下，连续转接至新的除菌培养基中，W除去发根农杆菌。 阳0%] 共培养培养基为：B5+30g/L薦糖巧.5g/L琼脂，pH5. 8-6. 0 ;
[0027]除菌培养基为：B5+500mg/l，300mg/l，lOOmg/L头抱霉素（Cef) +30g/L薦糖巧.5g/ L琼脂，pH5.8-6.ο。
[0028] (5)筛选培养转基因毛状根
[0029] 将除菌完全，生长状况良好的毛状根转移至筛选培养基，25°C，暗培养至少15天。
[0030] 筛选培养基为：B5+5mg/L潮霉素B(Hyb) +30g/L薦糖巧.5g/L琼脂，pH5.8-6. 0 ;
[0031] 化)PCR扩增鉴定毛状根 阳03引取在筛选培养基上仍然生长良好的毛状根一小段，用CTAB法提取总DNA，W此DNA为模板，进行PCR检测，鉴定是否含转入的目的基因CHIW及巧8C1发根农杆菌特有的 rolB、role基因。引物根据目的基因CHI和P皿-Flag表达载体W及农杆菌rolB、role特 异序列设计。
[003引 目的基因CHI扩增引物为： 阳的4] P皿-CHI-F:5>-CTCAAGCTTGGATCCATGGCTGCC-3> (沈QIDN0:1)
[0035] P皿-CHI-R:5,-CGATACCGTCACTAGTCAAACCATA-3,（SEQIDN0:2)
[0036] roIB基因扩增引物为：
[0037] rolB-F:5'-CGAGGGGATCCGATTTGCTT-3'(沈QIDN0:3) 阳的8] rolB-R:5'-GACGCCCTCCTCGCCTTCCT-3'(沈QIDN0:4)
[0039] role基因扩增引物为：
[0040] rolC-F:5'-TCGCCATGCCTCACCAACTCAC-3'(沈QIDN0:5)
[0041] rolC-R:5'-CCTTGATCGAGCCGGGTGAGAA-3,（沈QIDN0:6)
[0042] 反应体系均为（20yL) :d地20Ty^TemplateDM1yLR)rward P;rime;r(10yM)lyL，ReverseP;rime;r(10yM)lyL2X;rTaqPCRSuperMixlOyL。
[0043] PCR反应条件为：94°C5min，35 个循环（94°C30sec，55°C30sec，72°C60sec)， 72°C5min。
[0044] PCR产物经琼脂糖凝胶电泳和紫外检测。rolB的扩增条带大小为423bp，rolC为 62化P，目的基因CHI为714bp(如图1)。 W45] 本发明所述的CTAB法的全称是十六烷基立甲基漠化锭法，CTAB法能够提取植物 基因组DNA，属于一般分子生物学常规操作。
[0046] 本发明所述的PCR是"聚合酶链式反应"，是本领域技术人员公知的实验方法，根 据PCR引物