专利名称：一种基于发根农杆菌感染的诱发黄芩毛状根的培育方法
技术领域：
本发明属于黄芩的人工培育技术领域，涉及一种基于发根农杆菌感染的诱发黄芩毛状根的培育方法。
背景技术：
黄芩(Scutellariabaicalensis Georgi.)为唇形科(Labiatae)植物，是一种常用的中药。其性寒、味苦，归肺、心、肝、胆、大肠经，具有抗菌消炎、清热燥湿、泻火解毒、止血安胎等功效。黄芩为多年生草本植物，喜温和气候，耐寒冷、干旱，主要分布于河北、辽宁、陕西、山东、内蒙古等地，主要成分是黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素等。随着国际上对黄芩研究的深入，黄芩的主要成分黄芩苷在清除氧自由基、减轻组织的缺血再灌注损伤、调节免疫以及抗肿瘤和HIV等多方面均有较好作用。随着新药不断开发，黄芩苷用量迅速增加， 近年来，药材产地环境污染和农药喷施，都给黄芩资源的可持续发展带来严重危机。自1997年Ackermarm首先用发根农杆菌转化高等植物以来，迄今已有100多种植物建立了培养系统。利用发根农杆菌诱导植物产生毛状根，并对毛状根进行离体培养，生产有用的次生代谢产物，是使该植物可持续发展的有效途径之一。毛状根生长迅速，分支多无向地性，激素自养，生理生化、遗传特征稳定，次生代谢产物含量高，处于器官化水平，基本上保持了正常根的生化功能，且比细胞培养容易放大，该方法特别适合根用植物。因此通过大量培养毛状根替代野生资源，对保护环境与中药的可持续发展具有重大意义。
发明内容
本发明解决的问题在于提供一种基于发根农杆菌感染的诱发黄芩毛状根的培育方法，能够快速、高诱发率的诱发毛状根，解决黄芩资源短缺的问题。本发明是通过以下技术方案来实现1)将无菌的黄芩外植体接种于预培养基上，25 黑暗条件下预培养2 3d ；所述的预培养基为含有0. 15 1. Omg/kg 6-BA禾口 0. 1 0. 35mg/kg NAA的MS固体培养基；2)在预培养的黄芩外植体上划痕，加入活化的发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的菌液，并添加乙酰丁香酮，使其终浓度为200 600 μ g/mL，感染10 30min ；吸弃剩余的菌液后，将黄芩外植体转移到MS固体培养基上，25 黑暗培养2 3d，再转移到含抗菌素的MS固体培养基上，25 黑暗培养，诱发毛状根；3)待经发根农杆菌感染的黄芩外植体上长出的毛状根达到2 3cm时，在无菌条件下切下毛状根，将其转移到含抗菌素的MS固体培养基上，25 黑暗培养，直至发根农杆菌生长被抑制，然后切取毛状根；4)将切取的毛状根接种于MS固体培养基上，25 避光培养，每30天继代培养一次；5)选取MS固体培养基继代培养2次以上、生长旺盛的毛状根，切取根尖部分，接种到MS液体培养基上，100 200r/min振荡、25 避光培养，筛选生长迅速、能稳定产生黄芩苷的黄芩毛状根株系；6)选取MS液体培养基中生长旺盛的黄芩毛状根株系，切取根尖部分，接种到优化培养基上，100 200r/min振荡、25 避光培养，培养到32 38d补加培养液，培养至 60 80天收获毛状根；所述的优化培养基是在毛状根液体基本培养基上添加10 60g/L的碳源、0. 3 1. Og/L的氮源、20 100mg/L的生物诱导子、5. 3Χ1(Γ5 3. Ommol/L的非生物诱导子和 0. 2 0. 6mg/L的外源激素，pH值为4. 0 7. 0 ；所述的碳源为葡萄糖或蔗糖或果糖；氮源为硝酸铵或水解乳蛋白；生物诱导子为黑曲霉、米曲霉或蜜环菌诱导子；非生物诱导子为Ca2+、Mg2+或Co2+ ；外源激素为NAA或 6-BA。所述的毛状根液体基本培养基为MS培养基或采用以下配方包含大量元素、微量元素、铁盐和有机成分，pH为5. 8 6. 0 ；所述的大量元素为KNO3 :950mg/L、KH2PO4 :42. 5mg/L、MgSO4 · 7H20 185mg/L 和 CaCl2 · 2H20 220mg/L ；微量元素为KI :0. 83mg/L、H3BO3 :6. 2mg/L、MnSO4 · 4H20 :22. 3mg/L、ZnSO4 · 7H20 8. 6mg/L、Na2MoO4 · 2H20 :0. 25mg/L、CuSO4 · 5H20 :0. 025mg/L 和 CoCl2 :0. 025mg/L ；铁盐为Na2 · EDTA 18. 65mg/L 和 FeSO4 · 7Η2013· 9mg/L ；有机成分为肌醇100mg/L、甘氨酸Jmg/L、盐酸硫胺素0. lmg/L、盐酸吡哆醇 0. 5mg/L 和烟酸0. 5mg/L。所述的切取的根尖部分是按照5 8g/L的接种量接种到选育培养基中。所述的黄芩外植体的获得为将无菌的黄芩种子萌发后接种于含有0. 15 1. Omg/kg 6-BA和0. 1 0. 35mg/kg NAA的MS琼脂培养基上，在25 培养，生长成苗，切取苗的茎段作为外植体。所述的发根农杆菌的活化为将发根农杆菌的菌液均勻涂布于YEB琼脂培养基上，25°C培养，长出单菌落后，挑取单菌落于YEB液体培养基中，25°C、110r/min、黑暗条件下振荡培养2d ；然后再取菌体悬浮液转接种到YEB液体培养基中，25°C、110r/min、黑暗条件下振荡培养；YEB液体培养重复 2 3次，待农杆菌0D600为0. 4 0. 5时，用于感染黄芩外植体。所述的发根农杆菌为发根农杆菌A4、发根农杆菌A49615或发根农杆菌1. 2556。所述的抗菌素为氨苄西林钠，其浓度为180 500mg/kg。所述的筛选的黄芩毛状根株系，为黄芩苷含量可达毛状根干重4. 85%以上的株系。一种用于黄芩毛状根培养的优化培养基，是在毛状根液体基本培养基上添加 10 60g/L的碳源、0. 3 1. Og/L的氮源、20 100mg/L的生物诱导子、5. 3Χ1(Γ5 3. Ommol/L的非生物诱导子和0. 2 0. 6mg/L的外源激素，pH值为4. 0 7. 0 ；所述的碳源为葡萄糖或蔗糖或果糖；氮源为硝酸铵或水解乳蛋白；生物诱导子为黑曲霉、米曲霉或蜜环菌诱导子；非生物诱导子为Ca2+、Mg2+或Co2+ ；外源激素为NAA或 6-BA。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果1、本发明公开的基于发根农杆菌感染的诱发黄芩毛状根的培育方法，通过发根农杆菌诱导黄芩属黄芩得到毛状根，诱导率可达10 40%，在经过固体、液体培养基的选育培养，所得黄芩毛状根呈黄色毛发状，能稳定合成黄芩苷，对其ITS测序，鉴定该毛状根为黄芩属黄芩毛状根。更进一步，本发明将黄芩属黄芩毛状根在优化培养基上培养，其生长迅速，在 30 35天其生物量能增值23 35倍，并且只需在黑暗条件下培养，低能耗，低成本，适合工业化生产。据文献报道的黄芩道地药材(产地河北承德)最高含量15. 89 士 1.52%，从单位时间黄芩苷生成量来看，经选育培养的毛状根系是药材黄芩的19 23倍。2、利用本发明培育的黄芩毛状根，遗传性状稳定，产生次生代谢产物能力强，可以有效合成黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷和汉黄芩素等药用成分，其中黄芩苷含量可达毛状根干重的4. 85 11. 85%，并且与黄芩药材有相同的糖苷键水解酶系。其中含量较高者比2005 版药典规定“药用黄芩含黄芩苷(C21H18O11)不得少于9.0%”有显著的提高。3、利用本发明培育的黄芩毛状根，可经人工调节控制其生长和次生产物的合成， 生产所需产物；其生产方式避免了地理、季节和气候条件的限制也不受病虫害的影响。通过毛状根培养技术解决黄芩资源短缺问题，为中药黄芩有效成分来源开辟出一条有效途径。
图1是感染黄芩外植体后诱导的毛状根。图2是液体培养选育的黄芩毛状根。图3是优化培养基上培养的黄芩毛状根。图4是黄芩毛状根ITS的扩增条带示意图。图5是黄芩毛状根的ITS在NCBI上基因序列比对结果示意图。图6是毛状根液体培养生长曲线示意图。
具体实施例方式本发明公开一种基于发根农杆菌感染的诱发黄芩毛状根的培育方法，利用发根农杆菌菌液侵染黄芩外植体，诱导黄芩外植体形成毛状根，黄芩毛状根在MS固体培养基上呈黄色毛发状，能稳定合成黄芩苷，对其ITS测序，鉴定该毛状根为黄芩属黄芩毛状根。然后在选育培养基中进一步选育，优化培养条件，以选育提高毛状根中药用有效成分黄芩苷的含量的株系。下面结合具体的选育方法和黄芩苷的含量鉴定对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。实施例1一种基于发根农杆菌感染的诱发黄芩毛状根的培育方法，包括以下步骤1)黄芩外植体的获得与预培养将无菌的黄芩种子萌发后接种于预培养基在25 培养，生长成苗，切取苗的茎段作为外植体。或者，直接取黄芩苗消毒得，然后切取苗的茎段作为外植体。将获取的无菌的黄芩外植体接种于预培养基上，25 ^°C、黑暗条件下预培养2 3d ；所述的预培养基为含有0. 15 1. Omg/kg 6-BA禾口 0. 1 0. 35mg/kg NAA的MS固体培养基(具体可以采用ILMS培养基添加有30g蔗糖和5g琼脂)。2)发根农杆菌的活化及转染外植体具体选用发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes) A4、A49615 或 1. 2556 之一作为转染的发根农杆菌。发根农杆菌的活化取发根农杆菌菌液稀释10-6倍，取0. 2mL均勻涂布于YEB 琼脂培养基上，25°C培养，长出单菌落后，挑取单菌落于YEB液体培养基中，摇床上25°C、 llOr/min、黑暗条件下振荡培养2天；再取0. 2mL菌体悬浮液转接到YEB液体培养基中， 25°C、110r/min、黑暗条件下振荡培养，重复该步骤2 3次活化农杆菌，待农杆菌0D_为
0.4 0. 5时用于接种感染黄芩及外植体。在预培养的黄芩外植体上划痕，加入活化的发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的菌液，并于菌液中添加酚类物质乙酰丁香酮，使其终浓度为200 600 μ g/ mL，感染10 30min ；取出用无菌滤纸吸干多余的菌液后，转移到MS固体培养基上，25
黑暗培养2 3d，再转移到含抗菌素苄西林钠180 500mg/kg的MS固体培养基上， 25 黑暗培养。3)除菌待经发根农杆菌感染的黄芩外植体上长出的毛状根达到2 3cm时，在无菌条件下切下毛状根，将其转移到含180 500mg/kg氨苄西林钠的MS固体培养基上，25 28 V 黑暗培养，直至发根农杆菌生长被抑制(从未见发根农杆菌生长，延长培养时间到5天，至仍不能生长为止)，然后切取毛状根。4)毛状根固体培养将切取的毛状根接种于MS固体培养基上，25 避光培养，每30天继代培养一次。MS固体培养基上的黄芩外植体上长出的毛状根的结果图如图1所示。5)毛状根液体培养及选育选取生长旺盛、分枝多、长3 5cm的毛状根，切取根尖部分，接种到MS液体培养养基上，转速为110r/min振荡、25 观V避光培养，筛选在选育培养基中生长迅速、遗传稳定、能稳定产生黄芩苷的黄芩毛状根株系。MS液体培养基上的黄芩外植体上长出的毛状根的结果图如图2所示。6)毛状根的优化培养选取MS液体继代培养2次以上、生长旺盛、能稳定产生黄芩苷的毛状根根株系，切取根尖部分，按照5 8g/L的接种量，接种到优化培养基中，摇床上100 200r/min振荡， 25 避光培养；培养到32 38天补加浓缩5倍的毛状根液体基本培养液(相当于未浓缩100ml)，毛状根全培养基，培养期延长至60 80天；优化培养基上的黄芩外植体上长出的毛状根的结果图如图3所示，可见毛状根生长旺盛，布满整个培养瓶。所述的优化培养基是在毛状根液体基本培养基上添加10 60g/L的碳源、0. 3
1.0g/L的氮源、20 100mg/L的生物诱导子、5. 3Χ1(Γ5 3. Ommol/L的非生物诱导子和 0. 2 0. 6mg/L的外源激素，pH值为4. 0 7. 0 ；所述的碳源为葡萄糖或蔗糖或果糖；氮源为硝酸铵或水解乳蛋白；生物诱导子为黑曲霉、米曲霉或蜜环菌诱导子；非生物诱导子为Ca2+、Mg2+或Co2+ ；外源激素为NAA或 6-BA。所述的毛状根液体培养基为MS培养基或采用以下配方包含大量元素、微量元素、铁盐和有机成分，pH为5. 8 6. 0 ；所述的大量元素为KNO3 :950mg/L、KH2PO4 :42. 5mg/L、MgSO4 · 7H20 185mg/L 和 CaCl2 · 2H20 220mg/L ；微量元素为KI :0. 83mg/L、H3BO3 :6. 2mg/L、MnSO4 · 4H20 :22. 3mg/L、ZnSO4 · 7H20 8. 6mg/L、Na2MoO4 · 2H20 :0. 25mg/L、CuSO4 · 5H20 :0. 025mg/L 和 CoCl2 :0. 025mg/L ；铁盐为Na2 · EDTA 18. 65mg/L 和 FeSO4 · 7Η2013· 9mg/L ；有机成分为肌醇100mg/L、甘氨酸Jmg/L、盐酸硫胺素0. lmg/L、盐酸吡哆醇 0. 5mg/L 和烟酸0. 5mg/L。实施例2毛状根的优化培养与实施例1的筛选方法相同，不同的是优化培养基的添加成分的不同。所述的优化培养基是在毛状根液体基本培养基上添加40g/L的葡萄糖、0. 5g/L的水解乳蛋白、50mg/L的黑曲霉诱导子、1. Ommol/L的Ca2+和0. 25mg/L的NAA, pH值为7. 0。实施例3毛状根的优化培养与实施例1的筛选方法相同，不同的是优化培养基的添加成分的不同。所述的优化培养基是在毛状根液体基本培养基上添加20g/L的蔗糖、0. 45g/L的硝酸铵、40mg/L的米曲霉诱导子、1. Ommol/L的Mg2+和0. 25mg/L的6-BA，pH值为4. 0。实施例4毛状根的优化培养与实施例1的筛选方法相同，不同的是优化培养基的添加成分的不同。所述的优化培养基是在毛状根液体基本培养基上添加20g/L的果糖、0. 45g/L的水解乳蛋白、40mg/L的蜜环菌诱导子、1. Ommol/L的Co2+和0. 25mg/L的6_BA，pH值为6. 0。实施例5毛状根的优化培养与实施例1的筛选方法相同，不同的是优化培养基的添加成分的不同。所述的优化培养基是在毛状根液体基本培养基上添加60g/L的葡萄糖、1. Og/L的水解乳蛋白、20mg/L的米曲霉诱导子、0. 05mmol/L的Ca2+和0. 2mg/L的6_BA，pH值为6. 5。实施例6毛状根的优化培养与实施例1的筛选方法相同，不同的是优化培养基的添加成分的不同。所述的优化培养基是在毛状根液体基本培养基上添加50g/L的蔗糖、0. 4g/L的水解乳蛋白、30mg/L的黑曲霉诱导子、0. 005mmol/L的Mg2+和0. 5mg/L的6-BA，pH值为6. 5。对于培育的黄芩毛状根进行如下检测1、采用高效液相色谱法测定黄芩苷含量检测方法采用药典所规定的方法，多用色谱柱为化学键合型十八烷基柱(SCiClS色谱柱)，检测器为PUMP K-100U K-1501，流动相为甲醇水磷酸=50 50 0.2，检测波长为274nm，柱温为室温，流速为lmL/min。黄芩毛状根在本发明建立的培养体系下培养30 35天其生物量能增值23 35 倍，干燥毛状根中所测的黄芩苷含量可达毛状根干重的4. 85 11. 85%。比2005版药典规定“药用黄芩含黄芩苷(C21H18O11)不得少于9.0%”有显著的提高，据文献报道的黄芩道地药材(产地河北承德)最高含量15. 89士 1.52%，从单位时间黄芩苷生成量来看，经优化培养的毛状根系是药材黄芩的19 23倍。2、提取黄芩毛状根DNA进行ITS测序毛状根DNA的提取，方法如下1)取2g新鲜毛状根，用蒸馏水洗涤，充分吸干，于液氮中迅速研磨成粉。2)将冻粉迅速转入提取缓冲液2*TAB中，放入1. 5mL EP管中，尽快用细玻璃棒混勻，于65°C保温30min，其间轻柔搅动2_3次。3)取出离心管冷却至室温，加入等体积的氯仿/异戊醇(对/1)，轻缓颠倒混勻，静置 IOmin04) 12000rpm 离心 5min。5)转移上清液与另一离心管中，加入2. 5倍体积异丙醇，轻缓颠倒混勻，室温放置 15min。6) IOOOOrpm 离心 30s，收集沉淀。7)用70%乙醇2mL洗涤沉淀2次，室温下干燥lOmin。8)将沉淀溶于50 μ L TE缓冲液，_20°C冰箱中保存，备用。ITS序列扩增为ITS序列采用双引物进行扩增，引物序列分别为上引物5-TAA CAA GGT TTC CGT AGG TGA-3，下引物5-GGC CGT TGG GTC TCA TCT T-3，引物有上海捷瑞生物技术有限公司合成，扩增5. 8S rDNA及其两侧的ITSl和ITS2基因片段。反应体系50 μ L :10*PCR反应缓冲液 5.0 μ L，dNTP (各 IOmM) 2. O μ L, Taq 酶 2U，引物(10 μ Μ)各 3. O μ L，模板 4. O μ L。反应程序:95V 5min，94°C 15s，55°C 30s, 72°C lmin，循环 30 次，72°C 5min，4°C lmin。扩增产物使用琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色紫外下观察。扩增的产物的电泳结果如图4所示， ITS的扩增条带大小为589bp。对黄芩毛状根的ITS序列进行测序，其具体的ITS序列为
ggggggagattgtcgaactg tgaagcagac cacgaacacg tgtctaacgaccaatcgagg60
acaacggcgtgggggtgtgc cccccgtctg ggtcctcaca cccgcacggctggtgtgaga120
gcatcgtgtcgtgcgggcca acgaacccgg gcacggaatg cgccaaggaaaatcagaaga180
gatcgtccccctccgtgcgt cctgtccacg gagcacgcac ggggtgggtcaggcatttgt240
cgaatgtcataacgactctc ggcaacggat atctcaactc tcacatcgttgaagaacgta300
gtgaaatgtg atacttggtg tgaattacag aatcccgtga accatcgagtctttgaacgc360
aagtggcgcccgaagccatc gcgtctcccc ccctcacacc gcctcgagcg gtgccgtgtg420
gaggtggagattggcccccc gtgtggcccg gtgcatggcc gggccaaatg cgatccctcg480
gccatgcacgtcccgacaag tggtggttgt ttcctcaact cgcgtgctgt actgtgccaa540
ggcatcatccgttccataca gaatctaaag atgagacaca ccctgccaa589
ITS在NCBI上基因序列比对结果，如图5所示，毛状根的ITS与黄芩属黄芩(登录号AB557593. 1，)的ITS相似度高达90 %，说明该毛状根来源于黄芩属黄芩。将毛状根的 ITS提交GenBank，获得登录号JF824665。3、黄芩毛状根生长曲线测定测定挑选生长旺盛能稳定产生黄芩苷的毛状根根株系，称取0. 35g新鲜毛状根接种到 IOOmL优化培养液中培养至30d，100 200r/min，25 下在暗培养。每5d取出黄芩毛状根，经布氏漏斗抽滤后，无水滴下时称其鲜物质量。以黄芩毛状根生物量为纵坐标，生长天数为横坐标绘制黄芩毛状根生长曲线。其结果如图6所示，可以看到毛状根生长接近于对数生长曲线，从第15天起，其鲜重快速生长，至35天起生长进入平缓阶段。
权利要求
1.一种基于发根农杆菌感染的诱发黄芩毛状根的培育方法，其特征在于，包括以下步骤1)将无菌的黄芩外植体接种于预培养基上，25 黑暗条件下预培养2 3d；所述的预培养基为含有0. 15 1. Omg/kg 6-BA和0. 1 0. 35mg/kg NAA的MS固体培养基；2)在预培养的黄芩外植体上划痕，加入活化的发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的菌液，并添加乙酰丁香酮，使其终浓度为200 600 μ g/mL，感染10 30min ；将黄芩外植体转移到MS固体培养基上，25 黑暗培养2 3d，再转移到含抗菌素的MS固体培养基上，25 黑暗培养，诱发毛状根；3)待经发根农杆菌感染的黄芩外植体上长出的毛状根达到2 3cm时，在无菌条件下切下毛状根，将其转移到含抗菌素的MS固体培养基上，25 黑暗培养，直至发根农杆菌生长被抑制，然后切取毛状根；4)将切取的毛状根接种于MS固体培养基上，25 避光培养，每30天继代培养一次；5)选取MS固体培养基继代培养2次以上、生长旺盛的毛状根，接种到MS液体培养基上，100 200r/min振荡、25 避光培养，筛选生长迅速、能稳定产生黄芩苷的黄芩毛状根株系；6)选取MS液体培养基中生长旺盛的黄芩毛状根株系，切取根尖部分，接种到优化培养基上，100 200r/min振荡、25 避光培养，培养到32 38d补加培养液，培养至60 80天收获毛状根；所述的优化培养基是在毛状根液体基本培养基上添加10 60g/L的碳源、0. 3 1. Og/L的氮源、20 100mg/L的生物诱导子、5. 3Χ1(Γ5 3. Ommol/L的非生物诱导子和 0. 2 0. 6mg/L的外源激素，pH值为4. 0 7. 0 ；所述的碳源为葡萄糖或蔗糖或果糖；氮源为硝酸铵或水解乳蛋白；生物诱导子为黑曲霉、米曲霉或蜜环菌诱导子；非生物诱导子为Ca2+、Mg2+或Co2+ ；外源激素为NAA或6-BA。
2.如权利要求1所述的基于发根农杆菌感染的诱发黄芩毛状根的培育方法，其特征在于，所述的毛状根液体基本培养基为MS培养基或采用以下配方包含大量元素、微量元素、 铁盐和有机成分，pH为5. 8 6. 0 ；所述的大量元素为 KNO3 :950mg/L、KH2PO4 :42. 5mg/L、MgSO4 · 7H20 :185mg/L 和 CaCl2 · 2H20 220mg/L ；微量元素为 KI :0. 83mg/L,H3BO3 :6. 2mg/L、MnSO4 · 4H20 :22. 3mg/L、ZnSO4 · 7H20 :8. 6mg/ L、Na2MoO4 · 2H20 :0. 25mg/L、CuSO4 · 5H20 :0. 025mg/L 和 CoCl2 :0. 025mg/L ； 铁盐为 Na2 · EDTA :18. 65mg/L 和 FeSO4 · 7Η2013· 9mg/L ；有机成分为肌醇100mg/L、甘氨酸dmg/L、盐酸硫胺素0. lmg/L、盐酸吡哆醇0. 5mg/ L 和烟酸:0. 5mg/L。
3.如权利要求1所述的基于发根农杆菌感染的诱发黄芩毛状根的培育方法，其特征在于，所述的切取的根尖部分是按照5 8g/L的接种量接种到优化培养基中。
4.如权利要求1所述的基于发根农杆菌感染的诱发黄芩毛状根的培育方法，其特征在于，所述的黄芩外植体的获得为将无菌的黄芩种子萌发后接种于含有0. 15 1. Omg/kg 6-BA和0. 1 0. 35mg/kg NAA 的MS琼脂培养基上，在25 培养，生长成苗，切取苗的茎段作为外植体。
5.如权利要求1所述的基于发根农杆菌感染的诱发黄芩毛状根的培育方法，其特征在于，所述的发根农杆菌的活化为将发根农杆菌的菌液均勻涂布于YEB琼脂培养基上，25°C培养，长出单菌落后，挑取单菌落于YEB液体培养基中，25°C、110r/min、黑暗条件下振荡培养2d ；然后再取菌体悬浮液转接种到YEB液体培养基中，25°C、110r/min、黑暗条件下振荡培养；YEB液体培养重复2 3次，待农杆菌0D600为0. 4 0. 5时，用于感染黄芩外植体。
6.如权利要求1所述的基于发根农杆菌感染的诱发黄芩毛状根的培育方法，其特征在于，所述的发根农杆菌为发根农杆菌A4、发根农杆菌A49615或发根农杆菌1. 2556。
7.如权利要求1所述的基于发根农杆菌感染的诱发黄芩毛状根的培育方法，其特征在于，所述的抗菌素为氨苄西林钠，其浓度为180 500mg/kg。
8.如权利要求1所述的基于发根农杆菌感染的诱发黄芩毛状根的培育方法，其特征在于，所述的筛选的黄芩毛状根株系，为黄芩苷含量可达毛状根干重4. 85%以上的株系。
9.一种用于黄芩毛状根培养的优化培养基，其特征在于，是在毛状根液体基本培养基上添加10 60g/L的碳源、0. 3 1. Og/L的氮源、20 100mg/L的生物诱导子、5. 3X 1(Γ5 3. Ommol/L的非生物诱导子和0. 2 0. 6mg/L的外源激素，pH值为4. 0 7. 0 ；所述的碳源为葡萄糖或蔗糖或果糖；氮源为硝酸铵或水解乳蛋白；生物诱导子为黑曲霉、米曲霉或蜜环菌诱导子；非生物诱导子为Ca2+、Mg2+或Co2+ ；外源激素为NAA或6-BA。
全文摘要
本发明公开了一种基于发根农杆菌感染的诱发黄芩毛状根的培育方法，利用发根农杆菌菌液侵染黄芩外植体，诱导黄芩外植体形成毛状根，黄芩毛状根在MS固体培养基上呈黄色毛发状，能稳定合成黄芩苷，对其ITS测序，鉴定该毛状根为黄芩属黄芩毛状根。然后在选育培养基中进一步选育，优化培养条件，以选育提高毛状根中药用有效成分黄芩苷的含量的株系。通过发根农杆菌诱导黄芩属黄芩得到毛状根，诱导率可达10～40％，所得黄芩毛状根呈黄色毛发状，能稳定合成黄芩苷，本发明将黄芩属黄芩毛状根在优化培养基上培养，其生长迅速，在30～35天其生物量能增值23～35倍，并且只需在黑暗条件下培养，低能耗，低成本，适合工业化生产。
文档编号C12N5/04GK102229945SQ20111013237
公开日2011年11月2日 申请日期2011年5月20日 优先权日2011年5月20日
发明者李雅, 郭乐康, 钱卫东, 陈秀清, 齐香君 申请人:陕西科技大学