低能离子注入介导Ri质粒转化诱导黄芩毛状根的方法

低能离子注入介导Ri质粒转化诱导黄芩毛状根的方法
【专利摘要】本发明公开了一种低能离子注入介导Ri质粒转化诱导黄芩毛状根的方法，主要是利用低能离子注入介导技术高效、定向地将Ri质粒导入黄芩外植体中，促使Ri质粒与黄芩基因组发生重组整合，实现诱导黄芩毛状根的目的，所得的黄芩毛状根形态上多丛生，分枝多，无向地性，能够不依赖激素快速生长，能稳定生物合成黄芩苷，诱导率可达20～55％，黄芩苷含量可达16.47～19.56％。本发明提供的方法不仅操作简便，适用范围更广泛，将为单子叶植物及裸子植物的毛状根体系建立奠定基础。
【专利说明】低能离子注入介导Ri质粒转化诱导黄芩毛状根的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于黄芩的人工培育【技术领域】，具体涉及一种黄芩毛状根的诱导方法。
【背景技术】
[0002]药物植物被发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)感染后,在伤口处就会形成不定根，不定根除菌后能迅速生长，并产生多个分枝，呈毛发状，该不定根又被称为毛状根(Hairy roots)。自1907年Smith和Townsend发现发根农杆菌能诱导植物形成毛状根后，1930年Riker等再次阐述了该现象。随着植物生物技术的发展，有关毛状根的研究进展十分迅速，除了探求外源基因导入植物细胞的机制和植物激素的生理效应外，应用毛状根生物技术诱导植物次生代谢产物的形成与生物转化等研究也有很大发展。到20世纪末，国内外学者已建立了分属于31个科的100余种植物的毛状根培养体系，并进行次级代谢产物的生产和调控,包括苷类、生物碱、醌类、芳香油、酚类、黄酮等多种天然产物。毛状根培养技术已被认为是生产药用植物次生代谢产物的一条重要途径，具有非常广泛的应用前景。
[0003]发根农杆菌之所以具有这种致根性，是因为它具有能诱导毛状根产生的Ri质粒。Ri质粒是发根农杆菌染色体外的一个约250kb的大质粒，带有冠瘿合成酶基因。在Ri质粒上，存在与转化有关的 两个主要功能区，即T-DNA (转移区)和Vir (致病区)。Vir区基因并不发生转移，但它对T-DNA的转移非常重要。当发根农杆菌感染植物时Ri质粒上的T-DNA可以转化并插入到植物细胞基因组中，其整合和表达的结果导致了大量毛状根的产生。Ri质粒诱导的发根具有生长迅速、激素自养、生长条件简单、次生代谢产物含量高且稳定，分化程度高、不易变异等特点，而且可把二次代谢物分泌至培养基中。尽管发根培养技术应用于植物次生代谢生产的历史较短，但该技术发展迅速，特别是在一些有价值的药用植物次生代谢产物的生产上，但是该技术在推广过程中遇到了一些问题，如有些植物发根难以诱导，尤其是单子叶植物和裸子植物，这主要归因于发根农杆菌对这些植物的侵染能力较弱，致使处于发根农杆菌体内的Ri质粒不能转入到植物体内；同时，利用发根农杆菌诱导产生毛状根后，必须尽快除去毛状根吸附的发根农杆菌，使毛状根在无菌条件下生长。针对这些问题，亟需开发一种高效的转Ri质粒诱导毛状根的方法。
[0004]低能离子注入技术是20世纪80年代由我国科学家余增亮研究员等人开创和拓展的多学科交叉的新兴研究技术，目前已被广泛运用于生物品种改良。在此基础上，我国学者自主开发了低能离子注入介导的转基因技术。作为一种新的转基因方法，低能离子注入介导的转基因技术有其自身的特点:(1)注入离子对细胞具有极强的刻蚀作用，致使细胞表面形成可使外源DNA进入的通道，加上由于注入正离子的积累，大大降低了细胞表面的负电性，从而减少了细胞对带负电的外源DNA的静电排斥力，提高了外源DNA的导入。(2)低能离子注入介导转入的外源DNA是直接整合入宿主总DNA中，因此具有较好的遗传稳定性。
(3)低能离子注入介导的转基因技术是通过将能量较高的离子射入生物体内，通过能量沉积、质量沉积和电荷交换的机制使生物体产生自由基、染色结构变异或者DNA分子的断裂、碱基插入、缺失、重复等生物学效应而产生生物突变体。目前，低能离子注入介导外源DNA转化无论在理论上还是实际应用上都取得了显著成果。目前尚未见将低能离子注入转基因方法运用于诱导药用植物毛状根的研究报道。

【发明内容】

[0005]本发明的目的在于提供一种低能离子注入介导Ri质粒转化诱导黄芩毛状根的方法。
[0006]为达到上述目的，本发明 采用了以下技术方案:
[0007]I)将黄芩外植体转接到含50~200 μ g/mL乙酰丁香酮的MS固体培养基中，转接后于25~28°C黑暗培养2~3天，培养后用无菌水将黄芩外植体表面的培养基冲洗干净，冲洗干净后将黄芩外植体表面的无菌水用无菌风吹干，吹干后在黄芩外植体上划痕；
[0008]2)经过步骤I)后，将黄芩外植体放置于离子注入机的真空靶室内，然后对黄芩外植体进行低能离子注入；
[0009]3)将经过低能离子注入的黄芩外植体浸泡入含Ri质粒的TE缓冲溶液中并进行避光温育，温育的时间为2~4h,温育的温度为25~28°C,然后将黄岑外植体接种于含0.1~
0.5mg/L吲哚-3- 丁酸的MS固体培养基中，接种后于25~28°C黑暗培养21~25天诱导出毛状根。
[0010]所述黄芩外植体为切成0.5~1.0cm的黄芩带节茎段的碎段。
[0011]所述含Ri质粒的TE缓冲溶液中Ri质粒的浓度为≥200 μ g/mL。
[0012]所述离子注入的条件为:以N+作为注入离子，最佳注入剂量为2.5X1016~
3.5X 1016ions/cm2，最佳注入能量为25~30KeV,脉冲时间为5~IOs,间隔时间为5~IOs,真空度为1.5~2.0XlO-4Pa0
[0013]本发明具有以下有益的技术效果:
[0014]1、本发明所述诱导黄芩毛状根的方法通过低能离子注入介导的Ri质粒诱导黄芩属黄岑得到毛状根，结合基因间隔序列(intergenic transcribed spacer, ITS)基因检测分析，鉴定所得毛状根为黄芩属黄芩毛状根，诱导率可达20~55%，在液体培养基培养后，所得黄芩毛状根呈黄色，能稳定生物合成黄芩苷，黄芩苷含量可达16.47~19.56%。
[0015]2、本发明所述诱导黄芩毛状根的方法基于Ri质粒转化植物后，Ri质粒上的T-DNA片段整合入植物细胞核基因组中，使植物外植体产生毛状根的原理。与现有技术的不同之处在于，本发明所述Ri质粒转化方法是利用低能离子注入技术对植物表面具有高效冷刻蚀作用的特点，将来源于农杆菌的Ri质粒高效导入黄芩外植体中，诱导黄芩毛状根的生成，解决了现有技术只能依靠发根农杆菌对植物自然侵染能力的大小实现转移Ri质粒进行诱导毛状根的目的，提高了黄芩毛状根诱导的高效性，为黄芩毛状根的诱导开辟出一条有效途径。
[0016]3、本发明所述诱导黄芩毛状根的方法不需要发根农杆菌与植物外植体共培养，毛状根也无需脱菌处理，解决了毛状根诱导过程中，植物外植体与农杆菌共培养时间过长或过短引起植物细胞受到毒害而死亡的问题，操作简便，诱导效率得到提高。
[0017]4、对于步骤I)至步骤3)，现有技术中利用低能离子介导转化质粒(或基因片断)的相关研究表明，影响转化率的因子有离子的能量、剂量、每次脉冲处理剂量、离子质量数和化学性质等。其中，离子能量和剂量的增加有助于刻蚀样品产生微通道，但注入离子能量和剂量过高会引起靶材料遗传物质突变，适于诱变育种。因此，在植物转基因研究中，要求各种处理及培养条件尽量减小不必要的突变，所以离子束能量和剂量并不是越高越好。为此，当低能离子介导转化用至本发明时，本发明以黄芩外植体为研究对象，并在其表面进行划痕处理以及利用高浓度(400 μ g/mL)的Ri质粒进行转化以达到外源质粒的高效导入的目的，实现在提高转化效率的同时减少低能离子注入引发的宿主不必要的突变。
【专利附图】

【附图说明】
[0018]图1为经低能离子注入介导Ri质粒转化所得的黄芩毛状根的生长曲线图谱；
[0019]图2为经低能离子注入介导Ri质粒转化所得的黄芩毛状根生物合成黄芩苷的遗传稳定性图谱。
【具体实施方式】
[0020]下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
[0021]本发明针对利用农杆菌与植物外植体共培养诱导毛状根方法的不足，采用低能离子注入介导技术将Ri质粒直接导入黄芩外植体中，为黄芩毛状根的诱导提供新的方法:
[0022]I)黄芩外植体获得；
[0023]2)发根农杆菌培养及Ri质粒的制备；
[0024]3) N+注入介导Ri质粒转化黄芩外植体；
[0025]4)黄芩毛状根诱导培养；
[0026]5)黄芩毛状根的鉴别及黄芩苷检测。
[0027]本发明具体步骤如下:
[0028](一 )黄岑外植体的制备
[0029]将黄芩种子用自来水冲洗24h，然后用75%乙醇浸泡30s，然后用0.1 % HgCl2溶液对黄芩种子表面灭菌5min，然后用无菌水冲洗黄芩种子3~5次，然后将黄芩种子接种于MS 固体培养基(Murashige T and Skoog F (1962).Physiol Plantl5 (3): 473-497)上，恒温(25°C )培养箱中暗培养12d后种子开始萌发，种子开始萌发后设定光周期为12h，继续培养15d后长出幼苗。取黄芩植株幼苗，无菌条件下切取带节茎段，将带节茎段切成0.5~
1.0cm碎段得黄芩外植体。
[0030]( 二)发根农杆菌培养和Ri质粒的获得
[0031 ] 1、发根农杆菌培养:将低温(-20 °C )忙藏的发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes) A4或1.2556菌株接种于YEB固体培养基(酵母提取物10g/L,蛋白胨10g/L,NaC15g/L，琼脂粉15g/L)上28°C条件下活化2~3次，再挑取单菌落转接到YEB液体培养基(酵母提取物10g/L，蛋白胨10g/L，NaC15g/L)中，于110r/min、25°C下，培养2天得农杆
菌培养液。
[0032]2、Ri质粒的提取步骤:
[0033] 主要试剂:水溶液1:50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl (pH8.0)，IOmM乙二胺四乙酸(EDTA，pH8.0);水溶液 I1:2N NaOHlmL, 10% SDSlmL，加 ddH20 至 10mL，使用前临时配置；溶液II1:醋酸钾(KAc)缓冲液，pH4.8，4°C保存备用；TE缓冲溶液(IOmM Tris-HCl (pH7.8)，ImMEDTA(pH8.0));苯酚/氯仿/异戊醇(V:V:V = 25:24:1);乙醇(无水乙醇、70%乙醇)；溴化乙锭(EB):10mg/mL ;核糖核酸酶 A(RNase A, Sigma)。
[0034]I)取1.5mL上述农杆菌培养液放入微量离心管中，室温8000r/min离心Imin,弃
上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽，得细菌沉淀。
[0035]2)将细菌沉淀重悬于100 μ L预冷(置于冰块表面60min)的水溶液I中，剧烈振荡，使菌体分散混匀(且不至于沉淀)。
[0036]3)经过步骤2)后，加200 μ L新鲜配制的水溶液II，颠倒数次混匀(不要剧烈振荡)，并将离心管放置于冰上2~3min，使细胞膜裂解。
[0037]4)经过步骤3)后，加入150 μ L预冷(置于冰块表面60min)的溶液III，将离心管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，在冰上放置3~5min。
[0038]5)经过步骤4)后，加入450 μ L的苯酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀，4°C、12000r/min 离心 lOmin。
[0039]6)经过步骤5)后，小心移出上清于一新微量离心管中，加入上清2.5倍体积预冷(置于冰块表面60min)的无水乙醇,混匀，室温放置2~5min, 4°C、12000r/min离心15min。
[0040]7)经过步骤6)后，ImL预冷(置于冰块表面60min)的70%乙醇洗涤离心得到的沉淀I~2次，4°C、8000r/min离心7min,弃上清,将沉淀在室温下晾干。
[0041]8)经过步骤7)后，将晾干的沉淀溶于20 μ L TE缓冲溶液(含RNase Α20 μ g/mL)，37°C水浴30min以降解RNA分子，_20°C保存备用。
[0042](三)黄芩毛状根的诱导
[0043]取无菌的黄芩茎段(即碎段)，转接到含100 μ g/mL乙酰丁香酮的MS固体培养基(即在MS固体培养基中额外添加100 μ g/mL乙酰丁香酮)上，于25°C黑暗预培养2天。然后取出黄芩茎段用无菌水冲洗3次，使黄芩茎段表面的培养基冲洗干净，然后置于无菌平皿(90mm)中央并用无菌风吹至表面无水后在黄芩茎段表面轻轻划痕(即在表面形成细小的线状创伤口)。
[0044]划痕后将装有黄芩茎段的无菌平皿放置于离子注入机的真空靶室内，进行离子注入，注入条件为:低能N+作为注入离子，最佳注入剂量为3.0X1016ionS/Cm2，最佳注入能量为30KeV，脉冲时间为10s，间隔时间为10s，真空度为2.0X10_4Pa。
[0045]注入完毕后进行避光温育:用2~3mL含400 μ g/mL Ri质粒(Ri质粒浓度越大则转化率会越高)的TE缓冲溶液浸泡经离子注入后的黄芩茎段(能够全部浸没即可)，对照组黄芩茎段经低能离子注入后用不含Ri质粒的TE缓冲溶液浸泡。于25°C避光温育4h后，分别将浸泡于含有Ri质粒的TE缓冲溶液和不含Ri质粒的TE缓冲溶液中的黄芩茎段接种于含0.3mg/L吲哚-3- 丁酸的MS固体培养基(即在MS固体培养基中额外添加0.3mg/L吲哚-3-丁酸)中，并于25°C黑暗培养诱导毛状根。
[0046]经低能离子注入技术介导Ri质粒转入后的黄芩茎段于21~25天后基部有根长出，大多数具有毛状根的特征:具有白色根毛，多分支，向上或沿培养基水平生长并失去向地性，毛状根的诱导率达20~55% (现有技术中，诱导率最高为10~40%，专利号:ZL201110132376.4)。而对照组在14天左右逐渐褐化、死亡。
[0047](四)诱导出的黄芩毛状根鉴定及其黄芩苷检测
[0048]1、利用ITS和ι.ο1Β基因测序鉴定诱导出的黄芩毛状根:毛状根基因组DNA的提取和ITS基因检测分析方法依据已授权专利(专利号:ZL201110132376.4)中所应用的方法。ITS基因的PCR扩增产物经上海生工有限公司测序分析，并与NCBI上的ITS进行比对分析表明，诱导出的毛状根的ITS与黄芩属黄芩(登录号:AB557593.1)的ITS相似度高达90%以上，表明该毛状根可以分类为黄芩属黄芩。
[0049]2、 利用ι.ο1Β基因鉴定Ri质粒是否重组到诱导出的黄芩毛状根的基因组中:依据ι.ο1Β基因序列信息，设计一对特异性引物:
[0050]roIB-UP:5，-GCTCTTGCACTGCTAGATTT-3，
[0051]roIB-down -GAAGGTGCAAGCTACCTCTC-3’
[0052]PCR 反应体系:2 μ L Taq 聚合酶、3 μ LIOxPCR 缓冲液、I μ L50mmol/LMg2\2yL10mmol/L dNTP、上述两种引物各I μ L，2 μ L毛状根模板基因组DNA，加无菌重蒸水补至终体积30 μ L。
[0053]PCR 反应条件:首先 94°C 5min ;94°C变性 30s:52°C退火 45s ;72°C反应 30s ;共 30次循环；最后72°C延伸反应lOmin。
[0054]PCR扩增产物用1.0% (W/V)琼脂糖凝胶电泳进行分析。rolB基因PCR扩增产物经上海生工有限公司测序分析，并与NCBI上的ι.ο1Β进行比对分析表明，该基因已稳定重组到诱导出的黄芩毛状根的基因组中。
[0055]3、所得毛状根的液体培养:对所得毛状根进行三级扩大培养:1) 一级种子培养:在无菌条件下将50mg毛状根接种于150mL毛状根液体培养基(添加有0.4mmol/L苯丙氨酸以及60g/L蔗糖的MS液体培养基)中，然后在110r/min、26°C条件下避光培养5天；2)二级种子培养:在无菌条件下将经过一级种子培养的150mg毛状根接种于300mL所述毛状根液体培养基中，然后在110r/min、26°C条件下避光培养10天；3)培养基二次补加培养:在无菌条件下将经过二级种子培养的毛状根以5g/L的接种量接种于500mL所述毛状根液体培养基中，然后在110r/min、26°C下避光培养，培养15天后补加300mL所述毛状根液体培养基，然后在110r/min、26°C下继续培养15天后收获黄芩毛状根，然后测定收获的黄芩毛状根的鲜重及其黄芩苷的含量。
[0056]黄芩毛状根生物量(用鲜重表示)的测定:取出毛状根，用布氏漏斗抽滤至无水滴下时称重。
[0057]黄芩毛状根生物量(用干重表示)的测定:取毛状根，蒸馏水洗去表面培养基，于70°C下灭酶并烘至恒重，研磨后过60目筛得黄芩毛状根干粉，称重。
[0058]黄芩毛状根的黄芩苷含量测定:精密称取0.300g黄芩毛状根干粉，加40mL、70%乙醇回流提取3h后定容至IOOmL,然后过0.45 μ m微孔滤膜，得供试品溶液，结合用黄芩苷标准品制作的黄芩苷高效液相色谱标准曲线，采用高效液相色谱法(HPLC)测定供试品溶液中的黄岑苷含量。
[0059]所述黄芩苷的HPLC测定方法:采用2005年药典所制定的方法，色谱柱:化学键合型十八烷基柱(SCiC18色谱柱)，检测器:Pump K-1001，流动相:甲醇:水:磷酸=50:50:0.2(体积比)，检测波长:274nm,柱温:25°C,流速:lmL/min。
[0060]黄芩毛状根的黄芩苷含量=HPLC计算的黄芩苷含量/黄芩毛状根干重X 100%
[0061]经三级扩大培养(45天)后收获黄芩毛状根，测得结果表明所得黄芩毛状根的黄芩苷含量为16.47~19.56%。此外，由图1可知，经低能离子注入介导Ri质粒转化所得的黄芩毛状根从第15天开始进入快速期，至30天进入生长平缓期。[0062]将经低能离子注入介导Ri质粒转化所得的黄芩毛状根经三级扩大培养(45天)后，取150mg毛状根转接到300mL所述毛状根液体培养基中，连续继代培养12个月(26°C、110r/min条件下避光培养)，期间每隔30天继代培养一次，按照上述黄芩苷含量测定方法测定黄芩苷的含量。如图2所示，经继代培养10个月后，仍保持生物合成黄芩苷的稳定性，黄岑苷含量基本稳定。
[0063] 本发明所述诱导黄芩毛状根的方法只与Ri质粒与被诱导植物及其接种部位有关，为打破发根农杆菌仅能浸染绝大多数的双子叶植物、少数单子叶植物及个别裸子植物的局限提供了有效途径。本发明可以进一步与现有的DNA重组技术结合，用于将外源基因与Ri质粒进行重组所构建的重组质粒导入植物体内，对植物基因工程的发展和植物品种改良提供实践依据和理论基础。
【权利要求】
1.一种低能离子注入介导Ri质粒转化诱导黄芩毛状根的方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)将黄芩外植体转接到含50~200μ g/mL乙酰丁香酮的MS固体培养基中，转接后于25~28°C黑暗培养2~3天，培养后用无菌水将黄芩外植体表面的培养基冲洗干净，冲洗干净后将黄芩外植体表面的无菌水用无菌风吹干，吹干后在黄芩外植体上划痕； 2)经过步骤I)后，将黄芩外植体放置于离子注入机的真空靶室内，然后对黄芩外植体进行低能离子注入； 3)将经过低能离子注入的黄芩外植体浸泡入含Ri质粒的TE缓冲溶液中并进行避光温育，温育的时间为2~4h，温育的温度为25~28°C，然后将黄芩外植体接种于含0.1~0.5mg/L吲哚-3- 丁酸的MS固体培养基中，接种后于25~28°C黑暗培养21~25天诱导出毛状根。
2.根据权利要求1所述一种低能离子注入介导Ri质粒转化诱导黄芩毛状根的方法，其特征在于:所述黄芩外植体为切成0.5~1.0cm的黄芩带节茎段的碎段。
3.根据权利要求1所述一种低能离子注入介导Ri质粒转化诱导黄芩毛状根的方法，其特征在于:所述含Ri质粒的TE缓冲溶液中Ri质粒的浓度为> 200 μ g/mL。
4.根据权利要求1所 述一种低能离子注入介导Ri质粒转化诱导黄芩毛状根的方法，其特征在于:所述离子注入的条件为:以N+作为注入离子，注入剂量为2.5X IO16~3.5X1016ions/cm2，注入能量为25~30KeV，脉冲时间为5~10s，间隔时间为5~10s，真空度为 1.5 ~2.0XlO-4Pa0
【文档编号】A01H5/00GK103981213SQ201410216379
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年5月21日 优先权日:2014年5月21日
【发明者】钱卫东, 王婷, 付云芳, 蔡长龙, 毛培宏, 施春阳 申请人:陕西科技大学