专利名称：一种提高黄芩毛状根抗低氧能力的方法
技术领域：
本发明属于黄芩的人工培育技术领域，涉及一种提高黄芩毛状根抗低氧能力的方法。
背景技术：
毛状根培养周期较长，在生物量大量增殖后，其培养液中溶解氧成为限制性因素， 影响毛状根生长与次生代谢产物的合成，不利于工业化生产。气升式生物反应器与鼓泡式生物反应器是毛状根培养常用反应器，但较高的湍流剪切力是损害细胞、抑制毛状根生长的重要原因，因此寻求一种改善毛状根自身供氧状况，促进毛状根生长并提高次生代谢产物含量的方法，消除毛状根培养后期出现的溶解氧限制问题，将会有力推进毛状根生产次生代谢产物的工业化进程。透明颤菌中血红蛋白(VHb)是由透明颤菌产生的一种可溶性血红蛋白，这种血红蛋白能在贫氧条件下被大量诱导合成，使携带该血红蛋白基因的生物能在微氧条件下很好地生存。研究表明，透明颤菌血红蛋白基因(vgb)已在多种植物中表达成功，并表现出细胞生长和产物合成对溶氧的敏感度降低的性状；转的植物能够提高抗涝能力及促进水培植物生长。
发明内容
本发明在于提供一种提高黄芩毛状根抗低氧能力的方法，将Vgb基因在黄芩毛状根中表达，改善黄芩毛状根培养过程中对溶解氧需求。本发明是通过以下技术方案来实现一种提高黄芩毛状根抗低氧能力的方法，包括以下步骤1)将Vgb基因克隆到植物表达载体中，再将该植物表达载体转化农杆菌，筛选获得整合了 Vgb的农杆菌菌株；2)将无菌的黄芩外植体或毛状根接种于MS固体培养基上，25 黑暗条件下预培养2 3d ；在预培养的黄芩外植体或毛状根上划痕，加入经活化的整合了 Vgb的农杆菌，并添加浓度为10 200mg/L乙酰丁香酮，感染10 30min后，将黄芩外植体或毛状根转移到含10 50mg/L乙酰丁香酮的MS固体培养基上，25 黑暗培养2 3d，再转移到含抗菌素的MS固体培养基上，25 ^TC黑暗培养，诱发毛状根；3)待经农杆菌感染的黄芩外植体或毛状根上长出的毛状根达到2 3cm时，在无菌条件下切下毛状根，将其转移到含抗菌素的MS筛选培养基上，25 ^rc黑暗培养，直至农杆菌生长被抑制，然后切取毛状根，获得转Vgb基因黄芩毛状根；4)毛状根的继代培养将切取的转vgb基因黄芩毛状根接种于MS固体培养基上，25 避光培养，每 20天继代培养一次；
5)毛状根的液体培养选取MS固体培养基继代培养2次以上、生长旺盛的毛状根，接种到MS液体培养基上，50 100r/min振荡、25 避光培养。所述的vgb基因的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示。所述的植物表达载体为PBI 121-vgb载体，该载体是vgb基因通过BaMHI和^icI 酶切位点，克隆到植物表达载体PBI 121中而获得；所述的抗菌素为100 500mg/L的头孢和50 100mg/L的卡那霉素。所述的农杆菌为发根农杆菌或根瘤农杆菌，发根农杆菌为R1000、15834、1. 2556、 A49615、A4野生型中的一种，根瘤农杆菌为GV 3101。与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果本发明公开的一种提高黄芩毛状根抗低氧能力的方法，采用基因工程方法，通过农杆菌的转化，将vgb导入黄芩毛状根中，获得的整合有vgb的黄芩毛状根能够在MS培养液中正常生长并有效合成次生代谢产物，同时对溶解氧需求较低。毛状根培养周期较长，利用毛状根工业化生产次生代谢产物时，发酵罐设备耗电与生产成本直接关联。本发明获得的整合有vgb的黄芩毛状根能够在低溶氧环境下正常生长，在工业化生产过程中间歇通气即可满足毛状根需求，降低生产耗电、节约生产成本，本发明对推进毛状根生产次生代谢产物的工业化进程有着重要意义。
图1为双酶切PBI 121-vgb质粒电泳图；图2为筛选的重组农杆菌中PBI 121-vgb质粒的PCR鉴定电泳图；图3为毛状根中vgb基因PCR鉴定电泳图。
具体实施例方式本发明公开一种提高黄芩毛状根抗低氧能力的方法，利用含vgb的农杆菌菌液侵染黄芩外植体或毛状根，诱导黄芩外植体或毛状根获得转vgb的毛状根，以降低黄芩毛状根培养过程中对溶解氧需求。下面结合具体的获得及培养方法对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。1、含有vgb植物表达载体的构建l)vgb片段的克隆vgb基因的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示，可以在含有vgb的质粒载体上进行 PCR扩展，或者直接从商购的含有该基因片段的载体上剪切之后使用。根据vgb的序列设计扩增vgb的上弓丨物5-cgggatccatgttagaccagcaaacca-3,下弓丨物:5-cgagctcttattcaaccgcttgagc-3o2) vgb片段及PBI 121质粒载体的酶切采用双酶切法(BamH I与Mc I限制酶)获得vgb片段及PBI 121质粒载体，电泳，回收DNA。方法在20yL酶切反应体系中，加5yg vgb或0.5 l.Oyg PBI 121质粒载体和2μ L酶切反应缓冲液(由IOmM Tirs-HCl、5mM MgC12、0. 5mM 二硫苏糖醇、50mM KCl组成)，加入2 IOu的限制性内切酶BaMHI 1 μ L，SacIl μ L，37°C保温3h ；65°C保温IOmin, 灭活限制酶；加入适量的加样缓冲液，混勻，离心5s，分别上样于琼脂糖凝胶两个样品槽中，同时与最外侧的样品槽中加入1 μ g分子质量标准DNA样品；3V/cm电泳1 池；切下 vgb片段及PBI 121质粒载体条带，分别回收DNA。在 1.5mL Eppendorf 管中加 AddH2O IlyL, vgb 0. 4μ g, PBI 1210. 1 μ g, 10*buffer 2μ L，T4连接酶Iu ；混勻，瞬时离心；14°C连接4 16h。双酶切检测连接产物，检测电泳结果如图1所示，其中泳道从左到右依次为 Maker、PBI 121-vgb载体、商购的含vgb的质粒载体PCR作为对照，可以看到PBI 121-vgb 载体被双酶切之后，形成了两个目的条带，结果表明vgb片段克隆到了 PBI 121质粒载体预设的位点上，PBI 121-vgb载体构建成功。2、含有vgb植物表达载体发根农杆菌的制备1)将 PBI 121-vgb 载体转化 E. coli，通过培养 E. coli，收集 PBI 121-vgb 载体。方法在100 μ L Ε. coli DH5 α感受态细胞中，加入20ng PBI 121-vgb质粒载体， 轻轻振荡混勻；冰浴30min，42°C热激90s，然后冰浴2 5min ；再加入800 μ L LB培养液， 37°C下振荡培养Ih左右；取200 500 μ L菌液涂布于含有50mg/L卡那霉素的LB平板上，37°C倒置培养 14 施；挑取单菌落接种于含50mg/L卡那霉素的3mL LB培养液中，37°C振荡培养过夜；将过夜培养菌液转移到1. 5mL Eppendorf管中，12000rpm离心30s，收集菌体沉淀，尽量弃净
上清；力口入 IOOyL 溶液 I (50mmol/L Glucose, 25mmol/L Tris-HCl, lOmmol/LEDTA, ρΗ8· 0)，剧烈振荡，室温静置IOmin ；加入200 μ L溶液II (0. 2mol/LNa0H, 1 % SDS)，快速颠倒离心管5次，冰浴静置5min ；加入150 μ L预冷的溶液III(3mol/L KCl,5mol/L HAc, ρΗ5· 2)，混勻，冰浴，静置IOmin ；室温12000rpm离心2min，取上层水相于另一新Eppendorf管中，加入等体积的苯酚氯仿异戊醇05 24 1)，振荡混勻；室温12000rpm离心aiiin，取上层水相于另一新Eppendorf管中，加入0. 8倍体积的异丙醇或2. 5倍体积的乙醇，混勻，静置5min ；室温 12000rpm离心lOmin，弃上清；用70%乙醇洗两次，空气干燥5 IOmin ；收集PBI 121-vgb 载体并溶于50 μ L去离子水或TE (ρΗ8. 0)中备用；2) PBI 121-vgb载体转染农杆菌农杆菌具体采用发根农杆菌或根瘤农杆菌GV 3101，发根农杆菌为R1000、15834、 1. 2556、A49615 或 A4 野生型。挑取农杆菌单菌落，接种于5 IOmL YEB液体培养基中，28°C振荡培养至对数生长期，OD600约0. 5 ；将菌液转移到1. 5mL Eppendorf管中，冰浴静置lOmin, 12000rpm离心 2min,收集菌体；用1. 5mL 0. 5M NaCl悬浮冰浴20min, 12000rpm离心2min，收集菌体；加100 μ L 20mM CaCl2 重悬农杆菌的菌体，加入 10 μ L PBI 121-vgb，冰浴 30min, 液氮中3min，37°C水浴5min，加入0. 5mL YEB培养液IlOrpm培养过夜；取200 500 μ L菌液涂布于含有50mg/L卡那霉素的YEB平板上，倒置培养14 16h ；挑取转化的农杆菌单菌落接种于含50mg/L卡那霉素的YEB液体培养基中，280C IlOrpm摇培16h，直接用菌液做PCR。具体采用双引物扩增vgb片段，合成如下引物对 P的序列上弓I物:cgggatccat gttagaccag CciciciCCci f下弓I物:cgagctctta ttcaaccgct tgagc ；反应体系25 μ L 10氺PCR 反应缓冲液 2. 5 μ L, dNTP (各 IOmM) l.OyL, Taq 酶 1U，引物(10 μ M)各 1. 5 μ L，模板 2. 0 μ L，H2O 15. 5 μ L ；反应程序95"C 5min, 94 "C 30s, 44 "C 30s, 72 "C lmin,循环 30 次，72 "C 5min, 4°C lmin。扩增产物使用琼脂糖凝胶电泳检测；结果如图2所示，可以看到所扩增产物为470bp左右的目的片段，这表明vgb基因已经成功的整合到了农杆菌当中。转染了 PBI 121-vgb载体的农杆菌在-20°C甘油中保存备用。3、农杆菌介导vgb转化黄芩获得转基因黄芩毛状根1)外植体预培养将无菌的黄芩外植体或毛状根接种于MS固体培养基上，25 ^TC黑暗条件下预培养2 3d ；2)毛状根的诱导在预培养的黄芩外植体或毛状根上划痕，加入经活化的整合了 vgb的农杆菌的菌液，并添加浓度为10 200mg/L乙酰丁香酮，感染10 30min后，将黄芩外植体或毛状根转移到含10 50mg/L乙酰丁香酮的MS固体培养基上，25 黑暗培养2 3d，再转移到含100 500mg/L头孢和50 100mg/L卡那霉素的MS固体培养基上，25 黑暗培养，诱发毛状根；3)毛状根的脱菌培养待经农杆菌感染的黄芩外植体或毛状根上长出的毛状根达到2 3cm时，在无菌条件下切下毛状根，将其转移到含100 500mg/L头孢和50 100mg/L卡那霉素的MS筛选培养基上，25 ^TC黑暗培养，直至农杆菌生长被抑制，切取毛状根，获得转基因黄芩毛状根；4)毛状根的继代培养将切取的转基因黄芩毛状根接种于MS固体培养基上，25 ^TC避光培养，每20 天继代培养一次；5)毛状根的液体培养选取MS固体培养基继代培养2次以上、生长旺盛的毛状根，接种到MS液体培养基上，50 100r/min振荡、25 避光培养。4、转染vgb的黄芩毛状根的鉴定提取传代2次以上的黄芩毛状根的DNA并以获得的cDNA为模板，以引物对P为扩增引物，PCR检测转基因黄芩毛状根vgb，检测结果如图3所示，其中泳道从左到右依次为 Maker、黄芩毛状根vgb、含vgb的农杆菌，可以看到vgb的目的条带稳定的整合到黄芩毛状根上。获得的整合有vgb的黄芩毛状根能够在MS培养液中正常生长并有效合成次生代谢产物、同时对溶解氧需求较低。由于毛状根可以在低溶氧环境下正常生长，在发酵罐培养毛状根时间歇通气即可满足毛状根需求，而发酵罐设备耗电与生产成本直接关联，这样重组后的黄芩毛状根的培养就达到了降低生产耗电、节约生产成本的目的。
权利要求
1.一种提高黄芩毛状根抗低氧能力的方法，其特征在于，包括以下步骤1)将Vgb基因克隆到植物表达载体中，再将该植物表达载体转化农杆菌，筛选获得整合了 vgb的农杆菌菌株；2)将无菌的黄芩外植体或毛状根接种于MS固体培养基上，25 ^TC黑暗条件下预培养2 3d ；在预培养的黄芩外植体或毛状根上划痕，加入经活化的整合了 vgb的农杆菌，并添加浓度为10 200mg/L乙酰丁香酮，感染10 30min后，将黄芩外植体或毛状根转移到含 10 50mg/L乙酰丁香酮的MS固体培养基上，25 黑暗培养2 3d，再转移到含抗菌素的MS固体培养基上，25 ^rc黑暗培养，诱发毛状根；3)待经农杆菌感染的黄芩外植体或毛状根上长出的毛状根达到2 3cm时，在无菌条件下切下毛状根，将其转移到含抗菌素的MS筛选培养基上，25 ^TC黑暗培养，直至农杆菌生长被抑制，然后切取毛状根，获得转vgb基因黄芩毛状根；4)毛状根的继代培养将切取的转vgb基因黄芩毛状根接种于MS固体培养基上，25 ^TC避光培养，每20 天继代培养一次；5)毛状根的液体培养选取MS固体培养基继代培养2次以上、生长旺盛的毛状根，接种到MS液体培养基上， 50 100r/min振荡、25 避光培养。
2.如权利要求1所述的一种提高黄芩毛状根抗低氧能力的方法，其特征在于，所述的 vgb基因的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示。
3.如权利要求1所述的一种提高黄芩毛状根抗低氧能力的方法，其特征在于，所述的植物表达载体为PBI 121-vgb载体，该载体是vgb基因通过BaMHI和McI酶切位点，克隆到植物表达载体PBI 121中而获得；所述的抗菌素为100 500mg/L的头孢和50 100mg/L的卡那霉素。
4.如权利要求1所述的一种提高黄芩毛状根抗低氧能力的方法，其特征在于，所述的农杆菌为发根农杆菌或根瘤农杆菌，发根农杆菌为R1000、15834、1. 2556、A49615、A4野生型中的一种，根瘤农杆菌为GV 3101。
全文摘要
本发明涉及一种提高黄芩毛状根抗低氧能力的方法。本发明是通过构建含血红蛋白基因的植物表达载体，经农杆菌介导转化黄芩外植体或毛状根获得转基因黄芩毛状根。本发明获得的整合有vgb的黄芩毛状根能够在低溶氧环境下正常生长，在工业化生产过程中间歇通气即可满足毛状根需求，降低生产耗电、节约生产成本，本发明对培养黄芩毛状根生产黄芩药用成分、推进毛状根生产次生代谢产物的工业化进程有着重要意义。
文档编号C12N15/82GK102352376SQ20111029991
公开日2012年2月15日 申请日期2011年9月29日 优先权日2011年9月29日
发明者李雅, 钱卫东, 齐香君 申请人:陕西科技大学