专利名称：多重pcr和多重酶切检测猪主要肉质基因多态性的方法
技术领域：
本发明涉及一种使用多重PCR方法和多重酶切方法检测猪主要肉质基因多态性的方法，属于基因检测技术领域。
背景技术：
肉质作为猪的数量性状，受许多基因的调控，其中，氟烷、酸肉以及心脏脂肪酸基因是三个重要肉质基因，这三个基因的突变均会对猪的肉质产生很大影响。其中，氟烷基因的突变是由于氟烷基因cDNA中的C1843-G突变为T1843-A，使受体蛋白第615位精氨酸变为半胱氨酸，从而导致表达产物结构和功能的改变，进而引起猪应激综合症的发生；酸肉基因的突变是由于在酸肉基因外显子3中碱基G — A的突变抑制了磷酸蛋白激酶的活性，导致了终PH值低，颜色苍白，有水分渗出的“汉普夏型猪肉”;猪心脏脂肪酸基因上存在限制性内切酶1、Hae \\\、Hinf I的3个酶切多态性位点，这三个位点的多态性均与肌间脂肪含量呈显著相关。
目前，这三个基因已经成为猪DNA标记辅助选择(MAS)育种中的主要DNA标记；检测这三个基因的方法是传统的PCR-RFLP。而传统的PCR-RFLP方法每次只能检测一个基因， 检测效率较低，本发明专利使用双重PCR和双重酶切的方法每次同时扩增和酶切两段DNA 片段，从而大大提高了猪肉质基因多态性检测的效率。发明内容
发明目的本发明针对上述现有技术中存在的各种问题，提出了一种多重PCR和多重酶切检测猪主要肉质基因多态性的方法，克服了上述缺陷，提高了检测效率。
技术方案一种多重PCR和多重酶切检测猪主要肉质基因多态性的方法，其特征在于按以下步骤进行(I)、首先针对氟烷、酸肉以及心脏脂肪酸这三个肉质基因的突变位点选择引物和与酶切多态性位点相对应的内切酶，查找内切酶在各种酶切缓冲液条件下的酶切效率，并据此列出酶切效率较高的多重酶切组合。
(2)、根据步骤(I)中所选择的引物和所有的多重酶切组合，计算各酶切组合针对相应的DNA扩增片段突变前和突变后的酶切片段长度，分析是否能够辨认因突变造成的电泳结果改变。
(3)、筛选出步骤(2)中能够辨认出突变的酶切组合，在这些组合中选择几种，并构建与所选择的能够辨认出突变的酶切组合对应的DNA片段的多重引物PCR扩增体系和多重酶切体系。
上述步骤(3)中采用乂7#211内切酶和历ifl内切酶对氟烷基因和心脏脂肪酸基因5’-上游区的双重PCR扩增产物进行双重酶切；采用没srB rl内切酶和#印1内切酶对酸肉基因和心脏脂肪酸基因第二内含子区的双重PCR扩增产物进行双酶切；最后使用Zfeelll 内切酶对酸肉基因和心脏脂肪酸基因第二内含子区的双重PCR扩增产物进行单酶切。
首先对氟烷基因和心脏脂肪酸基因5’ -上游区的特异性片段进行双重PCR扩增， 然后对酸肉基因和心脏脂肪酸基因第二内含子区的特异性片段进行双重PCR扩增；多重引物PCR反应体系如下(μ L):1.反应体系50 ；2.ddH20 25 ；3.buffer 8 ；4.dNTP 8 ；5.上游引物1:1 ；6.上游引物2:1 ；7.下游引物1:1 ；8.下游引物2:1 ；9.酶2 ;10.DNA 模板3 ；反应条件为-MV /IOmin 预变性；94°C /35sec_61°C /35sec_72°C /35sec 35 个循环；72°C /IOmin延伸；检测结果使用140V电压，2. 5%琼脂糖凝胶电泳，电泳时间为35分钟。
所述多重酶切总反应体系为10μ 1，其中PCR产物5μ 1，两种限制性内切酶各O.5μ 1，双蒸水3μ I，酶切温度为37 °C，酶切时间12h ;检测结果使用140V电压，3%琼脂糖凝胶电泳，电泳时间为22分钟。
上述的两种限制性内切酶为WWll+历/ fl或fcrBrl+i&pl。
优点及效果本发明提出了一种多重PCR和多重酶切检测猪主要肉质基因多态性的方法，与现有技术相比，具有如下优点通过本发明的检测方法，可以同时使用一个反应体系进行两段DNA序列的扩增和酶切，提高了氟烷、酸肉以及心脏脂肪酸基因多态性的检测效率。
图1为氟烷基因和心脏脂肪酸基因5’ -上游区特异性片段双重PCR扩增结果。
图2为酸肉基因和心脏脂肪酸基因第二二内含子区特异性片段双重PCR扩增结果。
图3为氟烷基因 和心脏脂肪酸基因5’-上游区特异性片段双重酶切结果。
图4为酸肉基因和心脏脂肪酸基因第二二内含子区特异性片段双重酶切结果。
图5为酸肉基因和心脏脂肪酸基因第二二内含子区特异性片段ZfeeIII酶切结果。
图6为本发明技术路线示意图。
具体实施例方式术语解释肉质肉的感官品质、深加工品质、营养价值和卫生质量。其中，感官品质是人的视觉、 嗅觉、味觉和触觉等感觉器官对猪肉的综合感受。猪肉的感官品质常用肌肉PH值、肉色、滴水损失、嫩度、多汁性、风味评分等指标进行评定。
肉质基因调控肉质性状的基因，肉质性状一般为数量性状，由多个主效基因和候选基因调控。分子标记辅助选择分子标记辅助选择(MAS,marker—assisted selection) 是随着现代分子生物学技术的迅速发展而产生的新技术，它可以从分子水平上快速准确地分析个体的遗传组成，从而实现对基因型的直接选择，进行分子育种。
多重酶切多重酶切技术(Multiple enzyme digestion technology)是米用多个酶同时切割一个片段或同时切割多个片段，这几种酶的反应条件、缓冲液和反应时间等都是是一样的。
本发明所述的猪主要肉质基因是指氟烷基因、酸肉基因以及心脏脂肪酸基因这三个基因。
下面结合附图和具体的实施方式对本发明做进一步的说明本发明提供了一种使用多重PCR方法和多重酶切方法对猪主要肉质基因氟烷基因、酸肉基因以及心脏脂肪酸基因多态性进行检测的方法，技术路线如图6中所示，其特征在于 首先针对氟烷、酸肉以及心脏脂肪酸这三个肉质基因的突变位点选择引物和与酶切多态性位点相对应的内切酶，查找这些内切酶在各种酶切缓冲液条件下的酶切效率，并据此列出所有酶切效率较高的多重酶切组合，根据实验所选择的引物和所有的多重酶切组合， 使用primer5软件计算各酶切组合针对相应的DNA扩增片段突变前和突变后的酶切片段长度，分析是否能够辨认因突变造成的电泳结果改变。筛选出能够辨认出突变的酶切组合，在这些组合中选择几种，并构建与之对应的DNA片段的多重引物PCR扩增体系和多重酶切体系O
引物的设计具体引物信息如下氟烷基因上游引物5’ -TCCAGTTTGCCACAGGTCCTACCA -3’下游引物5’ -ATTCACCGGAGTGGAGTCTCTGAG -3’片段长度659bp 退火温度61°C酸肉基因上游引物5 ’ -GAGGCCCAAATAAGTCAATGTA-3 ’下游引物5’ -ACCGGGGTCAAATGCTC-3’片段长度616bp退火温度62°C心脏脂肪酸基因上游引物5’ -GGACCCAAGATGCCTACGCCG-3’(5 ’ -上游区) 下游引物5 ’ -CTGCAGCTTTGACCAAGAGG-3 ’片段长度693bp 退火温度59°C 心脏脂肪酸基因上游引物5’ -TTGCTTCGGTGTGTTTGAG-3’(第二内含子区)下游引物5’ -CAGGAATGGGAGTTATTGG-3’片段长度816bp 退火温度 63°C。
内切酶的选择查找本发明所用的内切酶在使用各种不同buffer的情况下的酶切效率，如表一所示表一各内切酶在使用不同buffer情况下的酶切效率(％)
权利要求
1.一种多重PCR和多重酶切检测猪主要肉质基因多态性的方法，其特征在于按以下步骤进行 (1)、首先针对氟烷、酸肉以及心脏脂肪酸这三个肉质基因的突变位点选择引物和与酶切多态性位点相对应的内切酶，查找内切酶在各种酶切缓冲液条件下的酶切效率，并据此列出酶切效率较高的多重酶切组合； (2)、根据步骤(I)中所选择的引物和所有的多重酶切组合，计算各酶切组合针对相应的DNA扩增片段突变前和突变后的酶切片段长度，分析是否能够辨认因突变造成的电泳结果改变； (3)、筛选出能够辨认出突变的酶切组合，在这些组合中选择几种，并构建与之对应的DNA片段的多重引物PCR扩增体系和多重酶切体系。
2.根据权利要求1所述的多重PCR和多重酶切检测猪主要肉质基因多态性的方法，其特征在于步骤(3)中采用内切酶和内切酶对氟烷基因和心脏脂肪酸基因5’ -上游区的双重PCR扩增产物进行双重酶切；采用没srBrl内切酶和#印1内切酶对酸肉基因和心脏脂肪酸基因第二内含子区的双重PCR扩增产物进行双酶切；最后使用Zfeelll内切酶对酸肉基因和心脏脂肪酸基因第二内含子区的双重PCR扩增产物进行单酶切。
3.根据权利要求1所述的多重PCR和多重酶切检测猪主要肉质基因多态性的方法，其特征在于首先对氟烷基因和心脏脂肪酸基因5’-上游区的特异性片段进行双重PCR扩增，然后对酸肉基因和心脏脂肪酸基因第二内含子区的特异性片段进行双重PCR扩增； 多重引物PCR反应体系如下(μ L): 1.反应体系50 ； 2.ddH20 25 ； 3.buffer 8 ； 4.dNTP 8 ； 5.上游引物1:1 ； 6.上游引物2:1 ； 7.下游引物1:1 ； 8.下游引物2:1 ； 9.酶2 ; 10.DNA 模板3 ； 反应条件为-MV /IOmin 预变性；94°C /35sec_61°C /35sec_72°C /35sec 35 个循环；72°C /IOmin延伸；检测结果使用140V电压，2. 5%琼脂糖凝胶电泳，电泳时间为35分钟。
4.根据权利要求1所述的多重PCR和多重酶切检测猪主要肉质基因多态性的方法，其特征在于所述多重酶切总反应体系为10 μ 1，其中PCR产物5 μ 1，两种限制性内切酶各O.5μ1，双蒸水3μ1，酶切温度为37 °C，酶切时间12h ;检测结果使用140V电压，3%琼脂糖凝胶电泳，电泳时间为22分钟。
5.根据权利要求4所述的多重PCR和多重酶切检测猪主要肉质基因多态性的方法，其特征在于所述的两种限制性内切酶为或iferBrl+ife/71。
全文摘要
本发明属于基因检测技术领域，涉及一种多重PCR和多重酶切检测猪主要肉质基因多态性的方法，采用Alw21l内切酶和Hinfl内切酶对氟烷基因和心脏脂肪酸基因5’-上游区的双重PCR扩增产物进行双重酶切；采用BsrBrl内切酶和Mspl内切酶对酸肉基因和心脏脂肪酸基因第二内含子区的双重PCR扩增产物进行双酶切，最后使用Haelll内切酶对酸肉基因和心脏脂肪酸基因第二内含子区的双重PCR扩增产物进行单酶切。通过该检测方法，可以同时使用一个反应体系进行两段DNA序列的扩增和酶切，大大提高了氟烷、酸肉以及心脏脂肪酸基因多态性的检测效率。
文档编号C12Q1/68GK103031363SQ20111029896
公开日2013年4月10日 申请日期2011年9月29日 优先权日2011年9月29日
发明者印崇, 邢沈阳, 孙博兴, 赵志辉 申请人:印崇