专利名称：利用EcoRII酶切图谱库检测细菌整合子中基因盒阵列的方法
技术领域：
本发明属于分子生物学技术及耐药细菌监测领域。具体地说，本发明涉及一种利用限制性内切酶Ec0RII对细菌整合子中基因盒阵列PCR扩增产物进行酶切构建酶切图谱库，通过Ec0RII酶切图谱库实现快速检测细菌整合子中基因盒阵列的方法。
背景技术：
医疗水平的进步，种类繁多的抗生素日益被开发出来并投放市场。大量应用于临床及兽医方面，甚至在畜牧业中，也常使用其促进生长，正是这些抗生素的广泛应用，尤其是不合理地使用，造成细菌的耐药以至多重耐药问题日益严重，耐药机制日趋复杂。其中， 细菌主要的耐用机制有细菌可以通过产生灭活酶或钝化酶，破坏或修饰抗菌药物的活性结构或者降低与作用靶位点结合的能力而使抗菌药物失去效用；膜耐药，通过膜基因的改变而影响膜的通透性；细菌中编码靶位基因的突变导致靶位结构发生改变，使得抗菌药物不能正常识别作用靶位点并与之结合或结合力下降，药物失去抑杀作用；泵的机制，形成一个对抗生素的外排系统。随着对细菌耐药机制研究的深入，1989年，Stokes等通过比对Tn21的aadA 和R46的oxa2、aadA两侧的序列并结合以前做的大量类似实验的限制性酶切图谱，初步确定了 3'保守末端和5'保守末端的范围(Stokes H W，Hall R Μ. A novel family of potentially mobile DNA elements encoding site-specific gene-integration functions :integrons. [J]. Mol Microbiol. 1989,3(12) :1669-1683) 由于保守末端的外缘不具有反向末端重复序列、正向末端重复序列或靶位点重复序列等转座子所具有的结构特点，首次提出了一种新型的基因元件——整合子。1991年，Hall通过分析转座子 Tn7上各种不同的耐药基因，正式提出了整合子-基因盒系统的概念(Hall R Μ, Brookes D Ε, Stokes H W. Site-specific insertion of genes into integrons :role of the 59-base element and determination of the recombination cross-over point. [J] .Mol Microbiol. 1991,5(8) :1941-1959)。整合子(integron)是一个能通过自身编码的整合酶识别、捕获、整合或剪切细胞外游离基因或基因片段，并使之转化为功能性基因的重组表达系统(Rowe-magnus D A, Mazel D.Integrons matural tools for bacterial genome evolution. [J]. Curr Opin Microbiol. 2001,4(5) :565-569 ；Mazel D.Integrons :agents of bacterial evolution. [J]. Nat Rev Microbiol. 2006,4(8) :608-620)。被其捕获和整合的细胞外游离基因或基因片段多为编码耐药性蛋白如β-内酰胺酶(β-lactamase)、氨基糖苷类钝化酶、林可霉素类钝化酶、氯霉素乙酰转移酶、大环内酯类钝化酶、氨基糖甙乙酰转移酶(AAC)、氨基糖甙磷酸转移酶(ANT)核苷转移酶(APH)等的耐药基因。通常整合子根据整合酶(integrase)基因序列的不同进行分类，目前比较公认的是分为五类(Partridge S R，Tsafnat G，Coiera Ε, et al. Gene cassettes and cassette arrays in mobile resistance integrons. [J]·FEMS Microbiol Rev. 2009)与由Tn402衍生的功能性和非功能性转座子有关的1型整合子，这类整合子通常插入到转座子(如Τη21)内，现已报道的类型较多；与衍生的Τη7有关 2型整合子；3型整合子报道较少，其通常位于特征尚不明确的各类质粒上；4型和5型整合子通常与弧菌的甲氧苄啶耐药性相关，4型整合子是霍乱弧菌SXT元件的构成部分，5型整合子位于沙门氏弧菌质粒上的复合转座子内。一般情况下，提到的整合子主要指1型整合子antll)、2型整合子antI2)、3型整合子(IntI3)。由于1型整合子中所含有的基因盒阵列最为丰富，故其携带多样的基因盒阵列通过水平基因转移(horizontal gene transfer, HGT)造成细菌耐药问题也最为突出。1型整合子的典型结构通常包括5 ‘保守末端(5 ‘ -conserved segment, 5' -CS)、3'保守末端(3' -conserved segment，3'-⑶)以及夹在两保守末端之间的可变区(variable region)。在可变区，通常整合有一个或数个基因盒。这些基因盒由于种类、 数量及排列顺序不同可以形成多样的基因盒阵列，故根据1型整合子的结构特点在保守区设计引物可以将可变区中的基因盒阵列扩增出来。整合子广泛分布于各类细菌中尤其是革兰氏阴性细菌。它是细菌的固有结构，在抗菌药物发现和使用以前即已存在，并非由抗生素的滥用引起，但是抗生素的广泛使用使得整合子这种功能性基因的重组表达系统在选择压力下，为了适应环境变得活跃起来。它本身虽然无法移动，但其通常由接合型质粒(plasmid)、转座子(transposon)、整合型噬菌体(kicteriophage)等可移动性元件携带，通过接合、转化及转导等方式进行水平基因转移(HGT)，造成细菌的耐药问题日益严重。急需寻找一种既准确又简便快捷的方法来研究整合子所捕获的各种耐药基因盒。这样就可以实现有效地监测整合子中耐药基因盒的水平转移，快速方便地确定在最近一段时间内耐药细菌中哪类耐药基因盒出现的频率较高，故可通过减少某些抗菌药物的使用，降低该类耐药基因盒水平转移的选择压力，防止耐药细菌的爆发性流行。当前研究中，检测整合子中所含有的基因盒阵列主要通过PCR扩增，直接对扩增产物进行测序再比对测序结果等方法完成。此方法虽结果准确但实验过程耗时长，实验费用高。然而，经检索国内外还没有利用Ec0RII酶切图谱库检测细菌整合子中基因盒阵列的研究报道。
发明内容
针对当前研究中常用方法耗时长、费用高的不足，本发明目的是提供一种利用限制性内切酶Ec0RII对细菌整合子中基因盒阵列PCR扩增产物进行酶切构建酶切图谱库，通过Ec0RII酶切图谱库实现快速检测细菌整合子中基因盒阵列的方法。本发明所述利用Ec0RII酶切图谱库检测细菌整合子中基因盒阵列的方法是1.取医院周围的废水样品，以0. 22 μ m孔径无菌滤膜过滤富集菌体，将膜转接到 LB液体培养基中过夜培养，梯度稀释菌液涂布于含有IOOmgr1氨苄西林(AMP) JOmgr1卡那霉素(KAN)，SOmgF1 四环素(TET)，SOmgF1 头孢他啶(CAZ)，IOmgF1 链霉素(STR)，SOmgF1 氯霉素(CHL)，SOOmgr1磺胺异恶挫(SFX)，200mgr1磷霉素(FOS)，SmgF1加替沙星(GAT)或 SOmgF1甲氧苄啶(TMP)的抗性平板上，常规培养，然后依据菌落鉴定手册规定的指标，挑取单克隆菌落，继续培养，获得耐药细菌；
2.以CTAB法分别提取获得的耐药细菌的基因组DNA;3.分别以筛得的耐药细菌基因组DNA为模板，进行PCR扩增，取扩增后产物采用琼脂糖凝胶电泳检测所述耐药菌中是否含有1型整合酶，以此确定所述菌是否为含1型整合子的耐药细菌；其中上述PCR所用扩增引物为上游引物intll-F :5，-GTTCGGTCAAGGTTCTGG-3，&下游引物intll-R :5，-CGTAGAGACGTCGGAATG-3，；4.选择步骤3确定的含1型整合子的阳性菌株，再分别以其基因组DNA为模板，进行PCR扩增，取扩增后产物采用琼脂糖凝胶电泳检测1型整合子的阳性菌株中是否携带基因盒阵列；其中所述的PCR扩增引物为上游引物h印58 :5，-TCATGGCTTGTTATGACTGT-3，&下游引物h印59 :5，-GTAGGGCTTATTATGCACGC-3，；5.选择携带基因盒阵列的阳性菌株，切胶回收其携带的基因盒阵列DNA片段，以常规方法与PMD19-T Simple Vector连接，然后热激转化法转入感受态细胞Ε. coli T0P10 中，以蓝白斑实验挑选阳性转化子，测序；6.依据所选阳性菌株整合的基因盒阵列的测序结果，选定限制性内切酶EcoRII， 对所述阳性菌株中整合的非重复基因盒阵列DNA片段采用常规酶切体系于37°C消化3 6 小时，然后用琼脂糖凝胶电泳检测酶切片段长度，构建出EcoRII的酶切图谱库如下
权利要求
1. 一种利用Ec0RII酶切图谱库检测细菌整合子中基因盒阵列的方法，步骤是(1)取医院周围的废水样品，以0.22 μ m孔径无菌滤膜过滤富集菌体，将膜转接到LB 液体培养基中过夜培养，梯度稀释菌液涂布于含有IOOmgr1氨苄西林，SOmgr1卡那霉素， SOmgF1四环素，SOmgr1头孢他啶，lOmgl—1链霉素，SOmgl—1氯霉素，SOOmgl—1磺胺异恶挫， 200mgr1磷霉素，Smgr1加替沙星或SOmgl—1甲氧苄啶的抗性平板上，常规培养，然后依据菌落鉴定手册规定的指标，挑取单克隆菌落，继续培养，获得耐药细菌；(2)以CTAB法分别提取获得的耐药细菌的基因组DNA；(3)分别以筛得的耐药细菌基因组DNA为模板，进行PCR扩增，取扩增后产物采用琼脂糖凝胶电泳检测所述耐药菌中是否含有1型整合酶，以此确定所述菌是否为含1型整合子的耐药细菌；其中上述PCR所用扩增引物为上游引物 intll-F :5’ -GTTCGGTCAAGGTTCTGG-3’ &下游引物 intIl-R:5，-CGTAGAGACGTCGGAATG-3，；(4)选择步骤(3)确定的含1型整合子的阳性菌株，再分别以其基因组DNA为模板，进行PCR扩增，取扩增后产物采用琼脂糖凝胶电泳检测1型整合子的阳性菌株中是否携带基因盒阵列；其中所述的PCR扩增引物为上游引物 h印58 :5’ -TCATGGCTTGTTATGACTGT-3’ &下游引物 h印59 :5，-GTAGGGCTTATTATGCACGC-3，；(5)选择携带基因盒阵列的阳性菌株，切胶回收其携带的基因盒阵列DNA片段，以常规方法与PMD19-T SimpleVector连接，然后热激转化法转入感受态细胞E. coli TOPlO中，以蓝白斑实验挑选阳性转化子，测序；(6)依据所选阳性菌株整合的基因盒阵列的测序结果，选定限制性内切酶EcoRIIji 所述阳性菌株中整合的非重复基因盒阵列DNA片段采用常规酶切体系于37°C消化3 6小时，然后用琼脂糖凝胶电泳检测酶切片段长度，构建出Ec0RII的酶切图谱库如下基因盒阵列种类基因盒阵列长度(bp)EcoRll酶切图谱长度(bp)不含基因盒阵列00orfl693433,161,99arr-3748748dfrA25765407,212,146aac(6')-Ib-cr999575,242,182aadA21009674,335aadA231011676,335WaPSE-I12731273dfrAl—orfC1318690,349,176, 102, 21arr-3一dfrA2713931393arr-3一aacA414711047242,182dfrAl—aadAl1662707,690,244, 21dfrA16~aadA21673966,70全文摘要
本发明公开了一种利用EcoRII酶切图谱库检测细菌整合子中基因盒阵列的方法，是在确定新筛选出的基因盒阵列时，先采用限制性内切酶EcoRII对其进行酶切，与已构建的EcoRII酶切图谱库中的酶切图谱比对，来确定新筛选基因盒阵列的新颖程度，若库中无与其匹配图谱，则再选择连接、转化、测序分析，实现了有目的的测序。本发明方法既准确快速又经济节约，也便于信息共享。较适用于医院、检疫、测报、防治等有关部门在抗生素滥用还没有得到很好遏制的情况下，实现有效地监测和防治含整合子耐药细菌通过水平转移传播造成的耐药细菌的爆发性流行。
文档编号C12Q1/68GK102191322SQ20111008054
公开日2011年9月21日 申请日期2011年3月31日 优先权日2011年3月31日
发明者国宪虎, 夏蕊蕊, 徐海 申请人:山东大学