从含酶切位点的融合蛋白中纯化蛋白的方法及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001 ]本申请涉及一种从融合蛋白纯化蛋白的方法，具体涉及一种节约程序与成本的酶 切纯化蛋白的方法。
【背景技术】
[0002] 酶固定化技术在生物技术领域已有使用的先例，比如生物柴油技术，食品工程，废 水处理等，但是在制药领域还没有发现相关的技术报道。融合蛋白技术是为获得大量标准 蛋白而进行的有目的性的基因融合，利用融合蛋白技术，可构建和表达具有多种功能的新 型目的蛋白。例如，有些融合蛋白是含有凝血酶或者肠激酶酶切位点的硫氧还蛋白和目的 蛋白融合表达，在后续纯化中采用凝血酶或者肠激酶将硫氧还蛋白和目的蛋白切开，并采 用多步柱层析将这两种蛋白分开，达到预期的纯化效果。因此要得到目的蛋白需分为两个 步骤:酶切和纯化。目前通过基因工程手段表达有特殊标记的融合蛋白技术已经非常成熟， 现有技术中采用静态酶切法，将目的蛋白置换到相应的酶切溶液内，静态酶切一定的时间， 然后用不同的层析柱达到分离纯化的目的。
[0003] 目前的酶切技术通常采用的静态酶切法，是将酶和底物蛋白充分混匀后，在合适 的酶切条件下酶将融合蛋白切成目的蛋白和融合头，此时，酶只对它周围能接触到的蛋白 产生酶切作用，酶切效率低，酶用量大，另外，酶和蛋白同时溶解在一种溶媒内，后续目的蛋 白纯化中会有酶残留的问题。而且酶切时间长，酶和蛋白同时溶解在一种溶媒内，不仅给后 续目的蛋白纯化带来影响，而且残留的酶对蛋白有进一步的酶切，使酶切终点不好控制，酶 切的变异性增加。经过酶切的蛋白通常需要采用进一步的层析进行纯化，如果接下来纯化 不能有效去除酶，则残留的酶会继续发挥作用，从而引入额外的杂质，无法有效的纯化目的 蛋白。经过酶切的蛋白溶液内成分较复杂，如果按照常规的层析方法，目的蛋白吸附在层析 介质上，然后再根据其不同的表面电荷和疏水性等物理性质将目的蛋白和杂蛋白分开，势 必要经过多步层析，每一步层析柱都需要至少五种溶液来完成层析步骤，整个层析工艺比 较复杂。每增加一步柱层析，会增加很多工作量，同时蛋白的回收率也会下降，因此用尽可 能少的层析步骤达到相同的纯化效果是纯化工艺的最佳境界。
【发明内容】
[0004] 为了克服上述现有技术存在的问题，本申请在蛋白纯化工艺中，发明人巧妙地设 计了一种可以一步纯化的方法:采用串联的两个层析柱一次纯化目的蛋白，大大缩减了成 本和时间。具体而言，首先，将酶固定在介质上，然后将介质装到层析柱内，制成酶切层析 柱，将固定有酶的层析柱和另一根有特定介质的层析柱串联，当融合蛋白在特定的缓冲条 件下流经该串联的装置，目的蛋白直接从串联柱流穿，杂蛋白吸附在层析介质上，这样一步 层析就可以得到高纯度的目的蛋白。
[0005] 在一个实施方式中，本发明提供了一种一步从含有酶切位点的融合蛋白中纯化蛋 白的方法，包括如下步骤：
[0006] 将能够对所述酶切位点特异性酶切的酶固定在第一层析柱内的介质上；
[0007] 将固定有酶的第一层析柱与第二层析柱串联，所述第二层析柱能够吸附所述融合 蛋白的非目的蛋白（下文中也称为融合头)部分，并且不会吸附目的蛋白；
[0008] 将含有所述融合蛋白的样品依次流经第一层析柱和第二层析柱。依照此方法，可 以一步获得高纯度的目的蛋白，大大节省了成本，并且避免了多种杂蛋白的产生。
[0009] 在一个优选的实施方式中，所述酶为凝血酶、肠激酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或胰 蛋白酶。在实际操作中，可以根据这些酶的酶切位点来设计融合蛋白的结构，以便能够利用 上述酶有效切得目的蛋白。
[0010] 在一个进一步优选的实施方式中，所述第一层析柱内的介质选自高交联的琼脂 糖、葡聚糖和纤维素中的一种。采用适当的固定方法，能够将酶固定到这些介质上。
[0011] 在又一个优选的实施方式中，所述第二层析柱选自用于纯化含有标签蛋白的亲和 层析填料、离子交换类填料和分子筛类填料中的一种。具体而言，第二层析柱内的介质的选 择有几种情况：
[0012] 当融合蛋白表达时含有标签的，第二层析柱选择用于纯化标签蛋白的亲和层析填 料，例如，纯化his标签蛋白时，就选择Ni亲和填料，纯化BMP标签蛋白时，选用Dextrin Sepharose系列的填料，纯化Strep(II)标签蛋白时，选择StrepTactin Sepharose系列填 料，纯化GST标签蛋白时选用Glutathione Sepharose FF系列填料；
[0013] 当融合蛋白表达没有标签时，对融合蛋白、目的蛋白和酶切后的非目的蛋白部分 进行分析，当目的蛋白等电点偏碱性，而全长融合蛋白和酶切后的非目的蛋白等电点偏酸 性，则可以选择阴离子交换系列介质作为第二层析柱的介质，（例如强阴离子交换Q sepharose系列、弱阴离子DEAE Sepharose FF);当目的蛋白等电点偏酸性，而全长融合蛋 白和酶切后的非目的蛋白等电点偏碱性，则可以选择阳离子交换系列介质作为第二层析柱 的介质（例如强阳离子层析介质SP Sepharose系列和弱阳离子CMSepharoseFF)。
[0014] 当酶切后的目的蛋白和融合蛋白分子量差异很大时，第二层析柱可以选择分子筛 介质，流动相经过时，收集不同的组分(例如:Superdex系列和Sephacryl系列）。第一层析柱 中所述酶的固定在4±2°C，pH8-8.5条件下进行12-20小时，可以根据具体的酶和第一层析 柱的选择具体优化固定酶的条件，例如可优选4°C，pH8.0，固定16小时。
[0015] 本发明还提供了一种纯化蛋白的试剂盒，包括第一层析柱和第二层析柱，其中第 一层析柱中的介质固定有能够从融合蛋白酶切得到目的蛋白的酶，第二层析柱中的介质能 够吸附所述融合蛋白被酶切后的非目的蛋白部分，并且不会吸附所述目的蛋白，所述试剂 盒在使用时依次串联连接第一层析柱和第二层析柱。酶和层析柱可选的种类如上述方法中 所述。
[0016] 利用所述试剂盒可以实现上述纯化方法，并且，对于特定的融合蛋白，有成套的层 析柱存在于试剂盒中，省略了制备上述特定层析柱的步骤，更进一步节省了纯化的时间。
[0017] 本发明的纯化方法相对于现有技术中的纯化方法具有如下优势：1、提高酶切效 率，降低酶反应时间，酶可以回收利用;2、酶经过固定化，不会对后续工艺造成污染，无需增 加去除残余酶步骤;3;酶切体系和串联的层析柱平衡条件相同，减少了溶液种类和用量;4、 酶切后的柱层析采用穿透模式，目的蛋白直接从柱上流穿，整个纯化工艺简单紧凑。
【附图说明】
[0018] 图1为本发明的示意性流程图；
[0019] 图2为示例性酶与介质偶联的化学方程式；
[0020] 图3为本发明实施例1中酶切效率定量测量的结果，测定了实施例1的方法中不同 流速的酶切效果图，其中各泳道说明如下:pre:酶切前；l、0.5ml/min流速柱上酶切，保留时 间lOmin; 2、lml/min流速柱上酶切，保留时间5min; 3、2ml/min流速柱上酶切，保留时间 2.5min;4、5ml/min流速柱上酶切，保留时间lmin;
[0021 ]图4为实施例1中重复酶切效果图，其中各泳道说明如下:pre:酶切前；1、酶切第一 次;2、酶切第2次;3、酶切第3次；
[0022] 图5为实施例2中不同酶切时间的肠激酶酶切效果图，各泳道说明如下：1、融合蛋 白、2、酶切时间1分钟;3、酶切时间12分钟;4、酶切时间10分钟;5、酶切时间2分钟;6、酶切时 间4分钟;7、酶切时间6分钟;8、酶切时间8分钟；
[0023] 图6为根据实施例3的凝血酶切柱和精纯Q柱串联纯化后样品的电泳图；
[0024] 图7为根据实施例4的肠激酶切柱和Ni柱串联酶切纯化效果图，其中各泳道分别 为：1、分子量标记;2、Ni洗脱杂峰;3、Ni柱穿透的目的蛋白l;4、Ni柱穿透的目的蛋白2;各条 带成分:a、剩余的融合蛋白；b、GH目的蛋白；c、融合头蛋白；
[0025] 图8为PTH融合蛋白常规纯化工艺和固定化酶切与阴离子串联纯化工艺流程图对 比。
【具体实施方式】
[0026] 为了更详细地说明本发明的技术方案，下面通过【具体实施方式】示例性说明本发 明，本领域技术人员应了解，这些实施方式仅仅为说明本发明的实施，并不构成对本发明的 保护范围的限定。
[0027] 在蛋白质工程化表达的现有技术中，能够直接表达出目的蛋白，而不带有其他杂 质的情况很少，很多情况下通常是先表达出融合蛋白，然后通过酶切将融合蛋白上的非目 的蛋白部分酶切掉，再通过纯化步骤得到目的蛋白。由于步骤繁琐，不仅耗