抗牛支原体及巴氏杆菌融合蛋白Md-UF1-Md-AP2的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属生物技术领域，具有设及同时抗牛支原体和牛源英膜血清A型多杀性己 氏杆菌蛋白基因ifoLUFl-ifo^AP2、抗牛支原体、牛英膜血清A型多杀性己氏杆菌蛋白1(1-UFl-Md-AP2〇
【背景技术】
[000引牛源英膜血清A型多杀性己氏杆菌（化S 邸/toci缸化）和牛支原体（ 仿wis，必仿wis)是引起我过牛呼吸系统疾病的主要病原。主要发生在外地引 进的育肥架子牛中，老百姓称之为"烂肺病"，其发病率高达80%，单场死亡率高达60%。该病 的发生已严重制约了东北的肉牛养殖业发展，相关政府部口与养殖户均迫切希望尽快研制 出有效措施W控制发病，从而增强我国畜牧业的国际竞争力。
[0003] 目前，国内外还没有有效的疫苗用于牛呼吸系统疾病的预防，兽医临床主要使用 药物对该病发生进行治疗，但随着抗生素广泛不合理的使用，使牛呼吸系统疾病主要病原 逐渐产生了耐药性，不但给该病的防治工作带来了困难，而且加剧了耐药性问题造成的经 济损失。
[0004] 牛支原体，必/wis)是感染牛的致病性病原体，于1961年首 次从患有乳房炎的病牛中分离出来，1976年被报道与牛呼吸系统疾病有关。近年来，该病原 引起的疾病已在我国普遍发生，给我国畜牧养殖业造成了巨大的经济损失。
[0005] 目前，仅有美国具有商业化的疫苗用于预防牛支原体的感染，而其它国家均采用 抗菌药物对其进行治疗，由于抗生素的广泛使用，甚至滥用，使必出现耐药株，且耐 药率较高，其产生耐药性的直接后果不仅给控制和治疗该病带来困难，也加剧了抗生素在 牛体内的残留，为此，研制新型抗必仿W&?药物已迫在眉睫。
[0006] 上述两种疾病症状有相似之处，临床诊断需要细菌培养等措施，确诊需要一段时 间，而且常常是并发感染。
[0007] 本研究将肺炎支原体、沙口氏菌诱导家蛹幼虫后构建的抑制性消减文库中筛选到 了分别能表达抗牛支原体蛋白的基因ifoLUF1与表达抗牛源英膜血清A型多杀性己氏杆菌 蛋白的基因ifoLAP2构建成融合基因，为抗牛支原体新型药物的研发奠定了试验基础。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供一种同时抗牛支原体和牛源英膜血清A型多杀性己氏杆菌 疾病的药物，抗牛支原体及己氏杆菌融合蛋白Md-UFl-Md-AP2。
[0009] 一种融合蛋白基因ifoLUFi-ifoLAP2,其碱基序列如序列表SEQIDNO. 3所示； 一种融合蛋白Md-UFl-Md-AP2,其氨基酸序列如序列表SEQIDNO. 4所示； 一种融合蛋白基因ifoLUFl-ifo^AP2的制备方法，它包括； 1)人工合成下列引物： P1 ;5'-GGAATTCATGGGGAAAACAGTCT-3' ； P2 ;5'-CGATCCGCCACCGCCAGAGCCTCCACCTCCTGAACCGCCTCCACCCTGAATATAAAACAAG-3'； P3 ; 5'-GGTGGAGGCGGTTCAGGAGGTGGAGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGATGAAATTTTTCACGAACCACC ACCACCA-3'； P4；5' -CGCAGCTCGAGTTACTGAATATAAA-3'； 2)提取家蛹幼虫的总RNA，分离提纯mRNA，反转录合成cDNA ; 3) W cDNA为模板，用PI和P2扩增化神FI基因，用P3和P4扩增化MP2基因； 4) W ifoLUFl基因和MMP2基因为模板，用P3和P4扩增； 一种表达载体，它是在表达载体中插入了如序列表SEQ ID NO. 3所示的基因； 一种工程菌，它是在大肠杆菌中转染了上述的一种表达载体。
[0010] 一种融合蛋白Md-UFl-Md-AP2在制备抗牛支原体和牛源英膜血清A型多杀性己氏 杆菌药物中的应用。
[0011] 本发明提供了抗牛支原体及己氏杆菌融合蛋白Md-UFl-Md- AP2及其编码该融 合蛋基因，它是用肺炎支原体诱导家蛹幼虫，构建了抑制性消减文库，在抑制性消减文库 中筛选出来了的ifo^UFl基因，用鸡源沙口氏菌诱导家蛹幼虫，构建了抑制性消减文库，在 抑制性消减文库中筛选出来了的ifoLAP2基因，采用重叠延伸剪切技术，构建了融合基因 ifoWFl-化/- AP2,表达的抗牛支原体及己氏杆菌融合蛋白Md-UFl-Md- AP2,对牛源英膜血 清A型多杀性己氏杆菌和牛支原体均具有抑制作用，解决了牛己氏杆菌和牛支原体耐药性 的问题。在牛出现肺炎症状时，早期用药，可同时防治牛支原体和己氏杆菌病。
【附图说明】
[001引图1脈UF1基因PCR扩增结果；其中，M: DL2000; 1:脈UF1基因PCR产物； 图2化MP2基因PCR扩增结果；其中，M: DL2000; 1: ifoLAP2基因PCR产物； 图3 ifoLAP2-ifoLUFl基因PCR扩增结果；其中，M: DL2000; 1: ifoLAP2-ifoWFl基因PCR产物； 图4纯化的抗牛支原体、牛源英膜血清A型多杀性己氏杆菌融合蛋白ifoL AP2, SDS-PAGE分析结果。
【具体实施方式】
[0013] 实施例1沙口氏菌诱导家蛹幼虫后抑制性消减文库的构建及抗牛源英膜血清A 型多杀性己氏杆菌蛋白基因筛选 一、诱导菌株的来源 诱导菌鸡源沙口氏菌分离自临床患沙口氏菌病的家禽，采用S.S培养基和分子生物学 方法对所分离菌进行鉴定，结果证明，其是沙口氏菌。
[0014] 二、鸡沙口氏菌诱导家蛹幼虫后抑制性消减文库的构建 选用2、3日龄家蛹（化wcaZ.)幼虫（品种为绿头蛹，蛹卵购买自吉林省迂 源生态养殖厂，由吉林农业大学药理与毒理实验室解育)。采用2号昆虫针薩取鸡沙口氏菌 菌液(浓度为l〇8c化/mL)刺入家蛹幼虫（3日龄)腹部，每虫1针。W薩取菌液针刺的为诱导 组，空针刺作为对照组。将同等数量的诱导组和对照组家蛹幼虫置于人工气候箱中，在相同 条件下（温度为25~35°C，湿度65~75%)培养2化。分别提取实验组及对照组家蛹幼虫的总 RNA，利用磁珠法分离mRNA，反转录获得cDNA，采用S甜技术，构建鸡沙口氏菌诱导家蛹幼虫 后的抑制性消减文库，结合反向Ncxrthern杂交技术筛选出差异基因，并进一步通过RACE技 术获取差异基因的全长。实验结果表明，本研究成功构建了鸡沙口氏菌诱导家蛹幼虫后的 抑制性消减文库，从正向消减文库中得到500个单克隆，通过PCR筛选得到460个单克隆， 随机挑取的阳性克隆的大小均在100~200bp之间。
[0015]S、抗牛源英膜血清A型多杀性己氏杆菌蛋白基因的筛选 通过斑点杂交技术共筛选出169个差异基因片段，对差异基因克隆、测序及同源性分 析后共鉴定出32个无同源序列片段，69个抗菌肤基因片段W及其它编码蛋白的基因片段。 进一步通过cDNA末端快速扩增（rapidamplificationofcDNAends,RACE)对一个家蛹 抗菌肤2基因（MuscadomesticaAntimicrobialpeptide简称化/~AP2)进行扩增，产物测 序分析。通过T-A克隆技术，将全长PCR产物克隆至pMDlS-TVector中，成功构建出阳性 克隆质粒PMD18T-ifoLAP2。结果显示，扩增出化MP2基因全长0RF序列198bp。其碱基序 列SEQIDNO. 2 所示。
[0016] 实施例2肺炎支原体诱导家蛹幼虫后抑制性消减文库的构建及抗牛支原体蛋白 基因筛选 一、 诱导菌株肺炎支原体分离鉴定 采集自患肺炎的猪的肺脏病灶，按支原体分离培养程序分离培养，经菌落形态学观察， 分子生物学方法对分离菌进行鉴定，结果显示，分离菌菌落在40倍普通光学显微镜下观察 其菌落形态具有"油煎蛋"样典型特征，初步证明所分离菌为支原体。
[0017] 采用肺炎支原体16SrRNA全长引物对其进行鉴定(见表1)，扩增出约1. 5化的片 段，与预期片段大小相符，该基因片段测序后使用BLAST对其碱基序列进行分析，其结果显 示，所分离菌株的16SrRNA相应序列与Genbank登陆的肺炎支原体同源性为99%，进一步证 明所分离菌株为肺炎支原体。
[001引表1引物序列
二、 肺炎支原体诱导家蛹幼虫后抑制性消减文库的构建 选用2、3日龄家蛹（化wcaZ.)幼虫来源（品种为绿头蛹，蛹卵购买自吉林 省迂源生态养殖厂，由吉林农业大学药理与毒理实验室解育)。采用2号昆虫针薩取肺炎支 原体菌液(浓度为l0Sccu/mL)刺入家蛹幼虫（3日龄）腹部，每虫1针。W薩取菌液针刺的 为诱导组，空针刺作为对照组。将同等数量的诱导组和对照组家蛹幼虫置于人工气候箱中， 在相同条件下(温度为25~35