Vegf-b和vegf-b融合蛋白及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种使用血管内皮生长因子治疗胰岛素抵 抗及其相关疾病的方法。
【背景技术】
[0002] 胰岛素抵抗是指胰岛素靶组织如肝脏、骨骼肌以及脂肪等对胰岛素敏感性降低， 产生生物效应低于正常水平，导致胰岛素生物作用减弱或者下降，进而引起糖脂代谢稳态 破坏或血管内膜功能紊乱。近年来，由于高脂饮食、不良的生活习惯及外界环境因素的影 响，糖尿病、肥胖等代谢相关的疾病广泛发生，严重影响了人们的生活质量，已成为世界上 最严峻的健康问题之一。胰岛素抵抗是2型糖尿病发生发展的重要环节，并贯穿疾病始终。 此外，胰岛素抵抗是代谢综合征的基础，而代谢综合征直接导致2型糖尿病风险增加。目 前，胰岛素抵抗已成为多学科共同的研究热点。
[0003] 临床上治疗胰岛素抵抗主要使用胰岛素增敏剂。二甲双胍可以抑制肝脏的糖异 生，降低肝糖输出，促进糖原合成并促进外周组织对葡萄糖的摄取和利用从而改善胰岛素 抵抗。但服用二甲双胍可能会出现胃肠道反应、过敏反应等副作用。PPARy激动剂噻唑烷 二酮类药物（TZD)属于胰岛素增敏剂，通过增加外周组织对胰岛素的敏感性改善胰岛素抵 抗，但因其具有提高心血管发病率的副反应，临床使用受到限制。目前，临床上尚无能够显 著改善胰岛素抵抗且不造成明显副作用的药物。因此，研究新型安全有效的抗胰岛素抵抗 药物十分必要。
[0004] 本发明所涉及的VEGF-B属于血管内皮生长因子家族，是VEGF-A的同系物，和 VEGF165有47 %的相似性，和PIGF有37 %的相似性。已经发现人VEGF-B经mRNA选择性剪 切产生2种异构体，分别是含有167个氨基酸残基的VEGF-B167和含有186个氨基酸残基的 分泌形式VEGF-B1S6。VEGF-B大量表达于肌肉、心脏和棕色脂肪组织，具有血管、神经保护作 用，并且能够抑制凋亡，但VEGF-B的其他生物活性未见报道。
[0005] 近年研究人员开始关注VEGF-B在代谢调控中的作用。2010年Nature报道 (HagbergCE等，nature，2010,464 (7290) :917-21)vegfb基因敲除的小鼠与野生型小鼠相 比，在肌肉、心脏和棕色脂肪组织等部位脂质堆积降低，从而可改善代谢内稳态。其原理在 于VEGF-B可以上调脂肪酸转运蛋白（FATPs)的表达，因此采用基因敲除的手段将vegfb基 因沉默，即阻断了VEGF-B的通路可以减少脂质摄入从而达到改善代谢内稳态的效果。基于 此原理，已有专利（US8383112)将VEGF-B作为靶点，保护了可以拮抗体内VEGF-B的抗体， 通过抑制体内的VEGF-B通路作为治疗糖尿病的策略。
[0006] 本发明提供了一种通过增加VEGF-B水平改善代谢疾病的方法，采用高脂饮食诱 导肥胖小鼠模型，给予一定剂量的VEGF-B治疗后，小鼠体重下降，胰岛素抵抗症状显著改 善。本方法与已有的文献和专利报道的治疗策略相反，说明本发明的治疗手段与已有报 道是通过完全不同的作用机制达到近似的治疗效果。采用已有报道的治疗思路，需抑制 VEGF-B通路，在药物的开发应用上存在一定的局限性。而采用本发明的治疗方法更易实 施，另据文献（XuriLi等，TrendsinMolecularMedicine，2012,18 (2) :119-127)报道，VEGF-B分子不易产生毒副作用，因此在糖尿病、肥胖等胰岛素抵抗相关疾病的治疗中有具 有很好的应用前景。
[0007]在 2〇10 年的一篇文章（Md.NazirHossen等，JournalofControlledRelease， 2010,147 :261-268)中提出，多肽"KGGRAKD"能与生物药理活性物质相连接，靶向白色脂肪 组织从而发挥相应的药理活性达到靶向治疗的目的。
【发明内容】
[0008] 鉴于以上所述的治疗胰岛素抵抗药物缺乏，本发明的目的在于提供一种使用血管 内皮生长因子治疗胰岛素抵抗及其相关疾病的方法。
[0009] 为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种使用血管内皮生长因 子治疗胰岛素抵抗及糖尿病、肥胖症等相关疾病的方法。血管内皮生长因子公认的作用为 促进血管生成，但是本发明提供了其在治疗胰岛素抵抗方面的新活性。
[0010] 其中，所述血管内皮生长因子是血管内皮生长因子B(VEGF-B)。
[0011] 其中VEGF-B是由SEQIDNO. 1或者SEQIDN0. 2所示的序列，或其一部分，或由 在所述氨基酸序列中的任何一个中一个或几个氨基酸被删除，添加和/或取代的氨基酸序 列组成。
[0012] SEQIDNO. ：1
[0013] PVSQPDAPGHQRKVVSWIDVYTRATCQPREVVVPLTVELMGTVAKQLVPSCVTVQRCGGCCPDDGLE CVPTGQHQVRMQILMIRYPSSQLGEMSLEEHSQCECRPKKKDSAVKPDSPRPLCPRCTQHHQRPDPRTCRCRCRR RSFLRCQGRGLELNPDTCRCRKLRR
[0014] SEQ ID NO. ：2
[0015] PVSQPDAPGHQRKVVSffIDVYTRATCQPREVVVPLTVELMGTVAKQLVPSCVTVQRCGGCCPDDGLECV PTGQHQVRMQILMIRYPSSQLGEMSLEEHSQCECRPKKKDSAVKPDRAATPHHRPQPRSVPGWDSAPGAPSPADITH PTPAPGPSAHAAPSTTSALTPGPAAAAADAAASSVAKGGA
[0016] 本发明第二方面提供一种包含血管内皮生长因子-B(VEGF-B)和靶向肽的融合蛋 白。
[0017] 上述融合蛋白其特征在于，血管内皮生长因子-B(VEGF-B)经由一个或多个氨基 酸组成的接头肽（Linker)连接于靶向肽（Ba)，其中血管内皮生长因子-B(VEGF-B)、接头肽 (Linker)和靶向肽（Ba)利用肽键从N末端到C末端或C末端到N末端的顺序连接，其结构 通式：
[0018] VEGF-B-接头肽（Linker) -靶向肽（Ba)或者靶向肽（Ba) -接头肽 (Linker)-VEGF-B
[0019] 并且其中，
[0020] 1)VEGF-B是由SEQIDNO. 1或者SEQIDN0. 2所示的序列，或其一部分，或由在所 述氨基酸序列中的任何一个中一个或几个氨基酸被删除，添加和/或取代的氨基酸序列组 成。
[0021] 2)接头肽（Linker)中含有由式（Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n(式中，η是 1 ~10 的整 数），或式Pro-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)η表示的氨基酸序列（式中，η是1~10的整数）。
[0022] 3)靶向肽（Ba)中B表示5~20氨基酸的多肽序列，a表示1~5次基团B 的重复。B的氨基酸序列如下所示：
[0023] X1KGGRAKDX2
[0024] 其中&包含为天然氨基酸或非天然氨基酸的单个及多个氨基酸组合。
[0025] 其中X2包含为天然氨基酸或非天然氨基酸的单个及多个氨基酸组合。
[0026]优选的，其氨基酸序列如SEQ ID N0. 3, SEQ ID N0. 4, SEQ ID N0. 5, SEQ ID N0. 6 所示。
[0027] SEQIDNO. 3
[0028] PVSQPDAPGHQRKVVSffIDVYTRATCQPREVVVPLTVELMGTVAKQLVPSCVTVQRCGGCCPDDGLECV PTGQHQVRMQILMIRYPSSQLGEMSLEEHSQCECRPKKKDSAVKPDSPRPLCPRCTQHHQRPDPRTCRCRCRRRSFL RCQGRGLELNPDTCRCRKLRRGGGGSGGGGSGGGGSKGGRAKD
[0029] SEQIDNO. 4
[0030] KGGRAKDGGGGSGGGGSGGGGSPVSQPDAPGHQRKVVSffIDVYTRATCQPREVVVPLTVELMGTVAKQL VPSCVTVQRCGGCCPDDGLECVPTGQHQVRMQILMIRYPSSQLGEMSLEEHSQCECRPKKKDSAVKPDSPRPLCPRC TQHHQRPDPRTCRCRCRRRSFLRCQGRGLELNPDTCRCRKLRR
[0031] SEQ ID NO. 5
[0032] PVSQPDAPGHQRKVVSffIDVYTRATCQPREVVVPLTVELMGTVAKQLVPSCVTVQRCGGCCPDDGLECV PTGQHQVRMQILMIRYPSSQLGEMSLEEHSQCECRPKKKDSAVKPDRAATPHHRPQPRSVPGWDSAPGAPSPADITH PTPAPGPSAHAAPSTTSALTPGPAAAAADAAASSVAKGGAGGGGSGGGGSGGGGSKGGRAKD
[0033] SEQ ID NO. 6
[0034] KGGRAKDGGGGSGGGGSGGGGSPVSQPDAPGHQRKVVSffIDVYTRATCQPREVVVPLTVELMGTVAKQL VPSCVTVQRCGGCCPDDGLECVPTGQHQVRMQILMIRYPSSQLGEMSLEEHSQCECRPKKKDSAVKPDRAATPHHRP QPRSVPGWDSAPGAPSPADITHPTPAPGPSAHAAPSTTSALTPGPAAAAADAAASSVAKGGA
[0035] 本发明第三方面提供一种多核苷酸，所述多核苷酸编码能编码一种融合蛋白的氨 基酸。
[0036] 本发明第四方面提供一种表达载体，所述表达载体是含有所述多核苷酸的表达载 体。
[0037] 优选的，pET表达系统如pET28a。
[0038] 本发明第五方面提供一种重组的宿主细胞，所述宿主细胞含有表达载体、或者染 色体中整合有所述的多核苷酸。
[0039] 宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞（大肠杆菌）；真核细胞，如酵母细胞或者 哺乳动物细胞。
[0040] 本发明第六方面提供一种融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：
[0041] 1.将靶向性血管生成剂编码序列克隆到表达载体中；<