经il-12/cd62l融合蛋白改造的肿瘤治疗剂及其制法和用图
【技术领域】
[0001] 本发明设及医药领域，具体地设及一种经IL-12/CD6化融合蛋白改造的肿瘤治疗 剂及其制法和用途。本发明提供了一类IL-12/CD6化基因修饰的、具有增强抗瘤效果的T 细胞。
【背景技术】
[0002] 比-12是一种非常重要的免疫刺激因子。比-12是由共价键链接的异质性二聚体 细胞因子，由p35和p40亚基组成，在体内由激活的免疫细胞分泌。比-12是重要的细胞免 疫调控因子，在抗感染免疫及恶性肿瘤的免疫中通过NK细胞W及CTL发挥作用。
[0003] 先天性缺失IL-12或对IL-12不反映的个体，其抗感染免疫存在严重缺陷。一系 列的临床前实验模型证实，比-12的介入可W显著地延长荷瘤动物模型的生存期。
[0004] 虽然IL-12具有显著的抑瘤效果，但是由于其系统性全身给药会引起全身性毒副 反应，因而受到极大的限制。在本发明之前，比-12的临床应用由于其所诱导的全身性毒副 作用，W及早期临床试验通过全身系统性给药引起的两例患者的意外死亡，使其临床应用 受到大大的限制。 阳0化]为了避免全身性给药的毒副作用从而实现临床应用的目的，临床科研工作者们通 过肿瘤局部注射、瞬时表达及多点注射等途径应用于肿瘤的临床试验，但是由于IL-12的 治疗效果同回输的IL-12的剂量直接相关，上述局部的临床方案并未有取得显著的抑瘤效 果。
[0006] 为了解决运一问题，本发明人曾经试图通过基因修饰抗肿瘤T细胞持续分泌 比-12来实现抗肿瘤效果的最大化，但是由于未知的原因（一种可能的原因是IL-12的毒 副作用）通过持续分泌IL-12方案基因修饰的T细胞在体外不能有效扩增，并引起大量的 T细胞调亡。
[0007] 为了解决运一问题，本发明人亦通过TCR活化特异性调控IL-12的表达的基因修 饰方案，取得了T细胞体外有效扩增的难题，也取得了一定的抑瘤效果，但同时存在IL-12 脱离调控所引发的毒副作用，无法有效应用于临床应用。
[000引综上所述，本领域尚缺乏高效且毒副作用不明显的基于IL-12的抗肿瘤药物。因 此，本领域迫切需要开发高效且毒副作用低的肿瘤治疗药物。
【发明内容】
[0009] 本发明目的就是提供了一种高效且毒副作用低的肿瘤治疗药物及其制法和应用。
[0010] 在本发明的第一方面，提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包括融合在一起的W 下元件： W11]a)任选的位于N端的信号肤和/或前导肤；
[0012] (ii)第一蛋白元件；
[0013](iii)第二蛋白元件；化及
[0014] (iv)任选的位于第一蛋白元件和第二蛋白元件之间的连接肤元件；
[0015] 其中，所述信号肤可操作地连于由（ii)、（iii)和（iv)所构成的融合元件；
[0016] 并且第一蛋白元件为IL-12蛋白元件；第二蛋白元件为CD62L的蛋白元件。
[0017] 在另一优选例中，所述的"可操作地连于"指所述信号肤可引导所述融合元件的表 达或跨膜转移（定位）。
[0018] 在另一优选例中，所述的融合蛋白具有选自下组的结构：
[0019] (1)式Ia所述结构：
[0020] D-A-B(Ia)，或
[0021] 似式IIa所述结构：
[0022] D-A-C-B(IIa), 阳02引 其中，
[0024] A为比-12蛋白元件；
[0025] B为CD6化蛋白元件；
[0026] C为任选的连接肤元件；
[0027] D为任选的信号肤信号肤和/或前导肤序列；
[0028]表示连接上述元件的肤键或肤接头。
[0029] 在另一优选例中，所述的连接肤元件包括序列如SEQ ID NO. :7所示的连接肤。
[0030] 在另一优选例中，所述的IL-12蛋白来源于人或非人哺乳动物。
[0031] 在另一优选例中，所述的IL-12蛋白包括野生型和突变型。
[0032] 在另一优选例中，所述的IL-12蛋白包括全长的、成熟形式的IL-12,或其活性片 段。
[0033] 在另一优选例中，所述的第一蛋白元件包括IL-12蛋白的一个或两个亚基。
[0034] 在另一优选例中，所述的IL-12蛋白的亚基选自下组：P40和P35亚基。
[0035] 在另一优选例中，所述的第一蛋白元件包括连接在一起的IL-12蛋白P40和P35 亚基。
[0036] 在另一优选例中，所述的P40和P35亚基为"头-头"、"头-尾"、"尾-尾"相连。
[0037] 在另一优选例中，所述的P40和P35亚基之间存在或不存在接头（linker)。较佳 地，所述的接头为柔性的4-20个氨基酸的接头，更佳地，所述的接头为GGGGGGS(Ge巧（SEQ IDNO. : 8) 阳03引在另一优选例中，所述的IL12蛋白元件的序列如SEQIDNO. :4所示。
[0039] 在另一优选例中，所述的CD62L蛋白元件中具有K283-S284的切割位点。
[0040] 在另一优选例中，所述的CD62L蛋白来源于人或非人哺乳动物。
[0041] 在另一优选例中，所述的CD62L蛋白包括野生型和突变型。
[0042] 在另一优选例中，所述的CD62L蛋白包括全长的、成熟形式的CD62L或其活性片 段。
[0043] 在另一优选例中，所述的CD62L蛋白元件的序列如SEQ ID NO.:6所示。 阳044] 在另一优选例中，所述的肤接头的长度为0-15个氨基酸，较佳地1-10个氨基酸。
[0045] 在另一优选例中，所述融合蛋白还包括信号肤元件D。
[0046] 在另一优选例中，所述的融合蛋白中，第一蛋白元件为单链IL-12,在所述单链 IL-12中，在P40亚基及P35亚基设有连接肤GeS(沈QIDNO. : 7)。
[0047] 在另一优选例中，所述的融合蛋白中，在单链IL-12 (第一蛋白元件）和CD62L(第 二蛋白元件）之间设有连接肤，优选218肤段（SEQIDNO. :8)。
[0048] 在另一优选例中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示。
[0049] 在另一优选例中，所述融合蛋白具有W下多种特征：
[0050] a)所述融合蛋白被ADAM17蛋白切割，从而释放IL-12 ;
[0051]b)所述融合蛋白包含IL-12的两条亚基，即P40和P35亚基，并由GGGGGGS(G6巧 连接。
[0052] 在另一优选例中，所述的融合蛋白为单体、或二聚体。
[0053]在本发明的第二方面，提供了一种分离的多核巧酸，所述的多核巧酸编码第一方 面所述的融合蛋白。
[0054] 在另一优选例中，所述的多核巧酸的序列如SEQ ID NO.:1所示。 阳化5] 在本发明的第=方面，提供了一种载体，它含有本发明第二方面所述的多核巧酸。
[0056] 在另一优选例中，所述的载体包括质粒、病毒载体。
[0057] 在另一优选例中，所述的病毒载体包括：慢病毒载体、腺病毒载体、黄热病毒载体。
[0058] 在另一优选例中，所述的载体包括表达载体。
[0059] 在本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，它含有本发明第=方面所述的载体 或基因组中整合有第二方面所述的多核巧酸。
[0060] 在另一优选例中，所述的宿主细胞包括原核细胞和真核细胞。
[0061] 在另一优选例中，所述的宿主细胞包括哺乳动物细胞。
[0062] 在另一优选例中，所述的宿主细胞包括免疫细胞，较佳地T细胞、
[0063] 在本发明的第五方面，提供了一种产生第一方面所述的的蛋白的方法，它包括步 骤：
[0064](1)在适合表达的条件下，培养本发明第四方面所述的宿主细胞，从而表达出第一 方面所述的的融合蛋白；和 阳0化](2)任选地分离所述融合蛋白。
[0066] 在本发明的第六方面，提供了一种药物组合物，所述组合物包含：
[0067] 第一方面所述的的融合蛋白，W及
[0068] 药学上可接受的载体。
[0069] 在本发明的第屯方面，提供了一种免疫细胞，所述的免疫细胞携带（或在其细胞 表面存在）第一方面所述的的融合蛋白。
[0070] 在另一优选例中，所述的免疫细胞为至少IO3个（较佳地IO3-IO9个，更佳地较佳 地IO4-IQS个）所述免疫细胞的细胞群。
[0071] 在另一优选例中，至少一部分或全部所述的融合蛋白位于所述免疫细胞的细胞膜 上，并且所述的第一蛋白元件即IL-12蛋白元件位于胞外。
[0072] 在另一优选例中，所述的免疫细胞包括T细胞。
[0073] 在另一优选例中，所述的T细胞表面携带MRT-1TCR。
[0074] 在本发明的第八方面，提供了一种药物组合物，所述的组合物包含：
[0075] 本发明第屯方面所述的免疫细胞，W及
[0076] 药学上可接受的载体。
[0077] 在另一优选例中，所述的药物组合物为液态。
[0078] 在另一优选例中，所述的药物组合物含有1XIO3-IXIO7个所述的免疫细胞/ml。
[0079] 在本发明的第九方面，提供了如第一方面所述的的融合蛋白和/或第屯方面所述 的免疫细胞的用途，用于制备治疗肿瘤的药物。
[0080] 在另一优选例中，所述肿瘤包括：脑肿瘤、大肠癌肿瘤、肺癌肿瘤、肝癌肿瘤、乳腺 癌肿瘤、胃癌肿瘤、膜腺癌肿瘤。
[0081] 在本发明的第十方面，提供了一种治疗肿瘤的方法，包括步骤：给需要的对象施用 第一方面所述的的融合蛋白和/或第屯方面所述的免疫细胞。
[0082] 在另一优选例中，所述的融合蛋白W单体和/或二聚体形式施用。
[0083] 在另一优选例中，所述的对象是人。
[0084] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可W互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附图说明】 阳0化]图1显示了CD62L/l-selectin通过抗原特异性活化诱导的膜表面切割及释放。
[0086] 其中，图IA和图IB显示了膜分子CD6化切割及释放的分子机制示意图。如图所 示，T细胞表面CD6化在接受抗原等特异性激活剂的作用下，细胞内的微丝（actin等）发 生定向聚集，导致细胞膜表面的切割酶（Adaml7等）特异性剪切