稳定的TNFR:Fc融合蛋白药物组合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明提供一种稳定的药物组合物，其包括肿瘤坏死因子受体Fe融合蛋白 (TNFR:Fc)。本发明还涉及该组合物的制备方法、给药方法和包含该组合物的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 肿瘤坏死因子（TNF) α是一种细胞因子，其通过与受体结合促进炎症及相关症 状。肿瘤坏死因子通过巨噬细胞和许多其它免疫细胞产生的，它涉及许多炎性疾病的 发病机理，如类风湿性关节炎、牛皮癣关节炎、SLE、克罗恩氏疾病等。Hohmann等人鉴定 了在TNF-α上的两个不同的受体，其存在于不同的细胞类型上，即骨髓细胞和上皮细 胞（Hohmann et al. 1989J Biol Chem. 25, 14927 ~34)。Brockhaus 等人利用单克隆 抗体证明了 TNF-α和β都能与这两个具有高度亲和力的受体相结合（Brockhaus et al. 1990ProcNatlAcadSci U S A.，87(8)，3127 ~31)。
[0003] 肿瘤坏死因子-a (TNF- α )是炎症的中心调节器，TNF- α拮抗剂可有效地治疗炎 性疾病，其中TNF-α起重要的致病作用。TNF的抑制已被证明是一种能有效治疗患有类风 湿性关节炎和其它形式的炎性疾病的患者治疗方法，炎性疾病还包括银肩病、牛皮癣关节 炎和强直性脊柱炎、炎性肠病等。这样的TNF-α拮抗剂有依那西普。
[0004] 依那西普（Etanerc印t)是通过重组DNA技术产生的二聚体融合蛋白，其中可溶性 基因、TNF受体2的配体结合部分与人体IgGl的Fc组分基因融合，从而得到所需的融合蛋 白（US 7648702)。依那西普在CHO细胞中表达。依那西普的Fc成分缺少CHl结构域但具 有CH2、CH3结构域和铰链区。该融合蛋白的分子量接近150KD，且由934个氨基酸组成。依 那西普干扰TNF并充当TNF抑制剂，这是由于它可用作生物药物以治疗自身免疫疾病。它 防止对患有类风湿性关节炎和牛皮癣关节炎的患者关节产生进行性破坏。
[0005] 由于其独特的结构，依那西普与TNF-α的结合较内源受体更有效50~100倍 (Gofeeet al.2003J Am AcadDermatol. 49,S105 ~111，Strober 2005SeminCutan Med Surg. 24 ;28~36)。另外，由于二聚体特性，相比内源受体而言，其可以结合2个TNFa分 子，而内源受体只能结合一个。与内源性可溶形式相比，该分子与IgG的Fc区域的结合提 高了半衰期。市售的依那西普有冻干和液体两种形式。
[0006] 该组合物的最重要的特征是在于帮助蛋白质保持其结构构象或其活性。该组合物 中蛋白质的稳定性可长期保持。也就是说，与刚开始存储时的药物组合物相比，药物组合物 的多肽基本上不会失去其活性。
[0007] 所有多肽都具有等电点（Pl)，其通常被定义为PH，其中多肽不携带净电荷。本领 域已经熟知的是，当溶液的PH等于该蛋白的等电点（pi)时，蛋白溶解度通常是最低。
[0008] 蛋白质的Fab结构域的Tm是蛋白质热稳定性的良好指示器，且其还可以指示保存 期限。蛋白质的Tm值由差示扫描量热法测定，从而能够了解蛋白质构象中的热-诱导变化， 蛋白质解折叠机制和在溶液中的稳定性。较低的Tm表明给定溶液中蛋白质的稳定性较低， 而较高Tm表示蛋白质的稳定性较好。蛋白质的Tm值基于所配制组合物而变化，其反过来 反映在相应配方中的稳定性。
[0009] 在长期储存期间，由于聚集或降解，蛋白质的含水和冻干组合物会失去蛋白质活 性。蛋白质的聚集可导致免疫原性，而这并不是所期望的。由于在组合物中使用的依那西 普浓度高，有可能在长期储存过程中使得蛋白质聚集。为了提高蛋白质的稳定性，可以改变 现有的赋形剂的浓度，或者添加新的赋形剂来修饰该组合物。
[0010] 美国专利 US5, 215, 743、US7, 648, 702,美国申请 US20070053906 和 W02011141926 公开了药物组合物，其包含水溶性组合物，水溶性组合物包含了 TNF结合蛋白、缓冲液和等 渗剂。
【发明内容】
[0011] 在一实施例中，本发明是涉及一种稳定的药物组合物，其包含TNFR:Fc融合蛋白 和磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液。
[0012] 在另一个实施方案中，本发明涉及一种稳定的药物组合物，其包含TNFR:Fc融合 蛋白、磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液和选自L-甘氨酸、尿素和2-羟丙基β-环糊精（HPB⑶）的 抗聚集剂。
[0013] 在另一个实施方案中，本发明涉及一种稳定的药物组合物，其包含TNFR:Fc融合 蛋白、磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液、选自L-甘氨酸、尿素和HPBCD的抗聚集剂、以及张力剂和 稳定剂。
[0014] 在另一个实施方案中，本发明涉及采用本发明稳定的药物组合物治疗疾病的方 法。该疾病可以是类风湿性关节炎、多关节幼年型特发性关节炎、牛皮癣性关节炎、强直性 脊柱炎或斑块状银肩病。
[0015] 在另一个实施方案中，本发明涉及一种含有本发明的药物组合物的试剂盒或容 器。
[0016] 下面通过一个或多个实施例来具体阐述本发明，该具体阐述不用于限制于本发明 的范围。本发明的其它特征、目的和优点将体现在说明书和权利要求书中。
【具体实施方式】
[0017] 本发明提供了一种稳定的药物组合物，其包含了与人免疫球蛋白的Fc部分融合 的TNFR分子（TNFR:Fc融合蛋白）。更具体地，本发明涉及一种在磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液 中的稳定的依那西普药物组合物，该组合物具有较低的降解可能性。
[0018] 在本发明的一个实施例中，TNFR = Fc融合蛋白是依那西普。
[0019] 在美国专利US 7648702和W02011141926申请中报道称：在依那西普药物组合物 中，采用磷酸盐缓冲液，且以L-甘氨酸作为抗聚集剂的依那西普的稳定性不如采用磷酸盐 缓冲液及以其它氨基酸，如精氨酸、脯氨酸、赖氨酸、天冬氨酸作为抗聚集剂的依那西普的 稳定性。W02011141926申请披露了所述组合物包括磷酸盐缓冲液、依那西普和作为抗聚集 剂的L-甘氨酸，其表现出聚集和分裂产物。
[0020] 研宄在不同的缓冲液和使用不同的抗聚集剂中的依那西普组合物时发现：在5°C 和40°C，包含了磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液和以L-甘氨酸作为抗聚集剂的依那西普组合物与 包含了磷酸盐缓冲液和以L-甘氨酸作为抗聚集剂的依那西普组合物相比，前者表现出良 好的稳定性。
[0021] 如在具体的实施例中阐述的，对基本上由磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液和作为抗聚集 剂的L-甘氨酸形成的依那西普的稳定性进行了评估，该组合物在5°C条件下经过了 6个月 稳定性试验和在40°C条件下存储2周后试验（应力条件下稳定性的研宄）。通过SEC测定 表明：相对于聚集产品％和降解产物可以确定，相比包含了磷酸盐缓冲液的组合物，包含 了磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液系统的组合物被确定为更优良。
[0022] 此处所用的稳定药物组合物是指TNFR:Fc融合蛋白，其具有以下特征：
[0023] 1、相比包含了磷酸盐缓冲液、精氨酸和氯化钠的依那西普组合物，包含了磷酸 盐-柠檬酸盐缓冲液的TNFR = Fc融合蛋白的稳定药物组合物表现出改善的稳定性。在40°C 条件下存储2周后，通过SEC测定表明：包含了磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液和作为抗聚集剂 的L-甘氨酸的依那西普组合物的聚集％较少。
[0024] 2、在40°C条件下存储2周后，通过SEC测定表明：类似于包括磷酸盐缓冲液、精氨 酸和氯化钠的新型的组合物依那西普，包含了磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液的TNFR:Fc融合蛋 白的稳定药物组合物表现出小于5%左右分子量杂质。
[0025] 3、在40°C条件下储存2周后，通过SEC测定表明：包含了磷酸盐-柠檬酸盐缓冲 液、甘氨酸的TNFR = Fc融合蛋白的稳定药物组合物表现出约8%的左右分子量杂质。而包括 磷酸盐缓冲剂，以甘氨酸作为抗聚集剂的依那西普组合物显示出有15%的杂质。
[0026] 在另一个实施方案中，本发明涉及磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液中的依那西普药物组 合物及其他抗聚集剂磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液，所述其他抗聚集剂为尿素、HPBCD。
[0027] 在获得了改进了稳定性的包含了磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液的依那西普组合物后， 对来自其他化合物（除了氨基酸以外）的其他抗聚集剂进行了试验。
[0028] 可以观察到：包含了磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液的依那西普稳定药物组合物还包 含尿素和HPBCD。可以理解，这意味着相比开始存储时的状态，依那西普药物组合物基本上 不丧失其活性。术语"基本上"是指相比开始处存储时组合物的活性，其活性失去不会超过 20 %，或更优选不超过15 %，或甚至更优选不超过10 %，最优选不超过5 %。本发明的药物 组合物适合长期存储。这里所使用"长期存储的"是指该药物组合物可以稳定存储1个月 以上、优选超过6个月或12个月，更优选超过24个月。
[0029] 肿瘤坏死因子a (TNF-α )是细胞因子组的成员，该细胞因子可以刺激急性期反 应，因此是参与全身性炎症的细胞因子。TNF-α能