用于破坏Mas受体和PSD95相互作用的融合肽TAT-MAS9C的制作方法
【专利摘要】本发明涉及用于破坏Mas受体和PSD95相互作用的融合肽TAT?MAS9C，它的全长为20个氨基酸，其序列包括两部分，所述融合肽的氨基端为HIV?1Tat蛋白的跨膜结构域的11个氨基酸YGRKKRRQRRR，能够将融合肽引入细胞质；所述融合肽的羧基端为Mas羧基末端9个氨基酸NTVSIETVV，能够破坏Mas与PSD95的相互作用；所述融合肽的氨基酸序列为YGRKKRRQRRRNTVSIETVV。本发明的融合肽在破坏Mas与PSD95相互作用的同时，又保证了PSD95本身的突触功能，能够较好的研究PSD95对Mas功能的调控作用。
【专利说明】
用于破坏Mas受体和PSD95相互作用的融合肽TAT-MAS9C
技术领域
[0001 ]本发明涉及一种用于破坏Mas受体和PSD95相互作用的融合肽。
【背景技术】
[0002] mas基因由Wigler博士研究小组于1986年首次克隆出。它所编码的蛋白质含有325 个氨基酸，有7个疏水的跨膜结构域，是一种G蛋白偶联受体。Mas蛋白的组织学分布比较广 泛，在脑、睾丸、心脏、肾脏以及大脑血管内皮细胞中均有表达。Mas具有多种生理功能，它能 够有效调节肾素-血管紧张素系统；同时它对于神经可塑性、记忆和焦虑也有重要的调节作 用;此外，它还对肿瘤的发生有重要的影响。目前关于Mas的研究集中在功能和信号通路上， 很少有关于Mas调节蛋白的研究报道。
[0003] Mas蛋白序列的羧基端(ETVV)是典型的PDZ蛋白结合序列(ES/TXI/L/V)，推测PDZ 蛋白可能会与Mas结合而调节其生理作用。PDZ蛋白是具有H)Z结构域的蛋白质超级家族，目 前已经发现有200多个成员。其名称来源于最初发现的含有此结构域的3个蛋白质的英文名 称首字母缩写：P〇st_synaptic density protein-95(PSD_95)、Discs large(DLG)、Zonula occludens UZO-lhPDZ结构域长度在90个氨基酸左右，能够与靶蛋白羧基端特异模序结 合。PDZ蛋白通过与G蛋白偶联受体羧基端的相互作用，对G蛋白偶联受体的功能有重要的调 控作用，如多种PDZ蛋白：？3095、嫩61-2、？02-6￡?、0六1以及嫩61-3等可以分别与匕6七 &1肾上 腺素受体(WAR)特异结合而分别调节其多种生理功能。
[0004] PSD95(postsynaptic density protein 95,突触后致密物质-95)是在谷氨酸能 突触的突触后密集区发现的一种脚手架蛋白，是膜结合鸟苷酸激酶GK超家族的成员之一。 PSD95具有3个PDZ结构域，目前已经报道它可以通过其各个PDZ结构域与多种受体相互作 用，进而调节受体的功能。如可以通过其H)Zl-2结构域与Kvl受体结合而调节钾离子通道的 电流，可以通过其roz3结构域与m肾上腺素受体结合而抑制war减敏。作为突触后致密物 质，PSD95的一个重要功能是通过不同的结构域与NMDA受体、KA受体等蛋白的羧基末端相结 合，募集谷氨酸受体及其下游多种特异的信号分子，促使特异性信号模块的形成，从而在突 触后水平对兴奋性信号进行整合，调节兴奋性突触及棘突的形成、成熟、维持和可塑性。
[0005] 本人前期研究发现，血管紧张素（1-7)受体Mas和突触后致密物质95 (PSD95)在脑 组织和细胞中存在相互作用。相关成果已发表在Biochem J.杂志上。Mas羧基末端可以特异 性地与PSD95的PDZ1-2结构域相结合。Mas羧基末端的四个氨基酸决定了与PSD95相互作用 的特异性，四个氨基酸中的任何一个突变都会导致Mas与PSD95相互作用的消失。既然PSD95 与Mas存在相互作用，因此我们推测PSD95会对Mas的功能进行调节。
[0006] 已知PSD95能调节多种受体的功能。目前研究比较清楚的是PSD95对丽口六以. methyl-D-aspartic acid receptor，N-甲基-D-天冬氨酸受体）的调控，PSD95参与NMDAR介 导的脑缺血损伤。破坏PSD95与NMDAR的相互作用，可以起到对脑缺血损伤的保护作用，根据 与卩509 5相互作用的丽041?的羧基端设计的小分子穿膜肽了&1冊289(3(4&^8 6七 al. Science 2002)能够破坏NMDAR和PSD95的相互作用，对NMDAR介导的脑缺血损伤起到保 护作用。既然Mas与PSD95存在相互作用，PSD95很可能对Mas介导的功能进行调节。
[0007] 由于Mas与PSD95都在神经细胞中表达，但是神经细胞转染效率很低，而且PSD95本 身具有一定的突触功能，因此采用改变PSD95表达量的方法来研究PSD95对Mas的调控作用 不仅有一定的技术难度，而且也不适用于对PSD95调控功能的研究。
【发明内容】
[0008] 本发明旨在提供一种既能够穿透细胞膜，又能破坏Mas与PSD95的相互作用的融合 肽TAT-MAS9C。所述融合肽在破坏Mas与PSD95相互作用的同时，又保证了 PSD95本身的突触 功能，能够较好的研究PSD95对Mas功能的调控作用。
[0009] 本发明借鉴Tat-NR2B9c的设计原理，根据与PSD95相互作用的Mas蛋白的羧基端设 计融合肽TAT-MAS9C，该融合肽可以竞争Mas与PSD95的结合，从而破坏Mas与PSD95的相互作 用。
[0010] 鉴于此，本发明所采用的技术方案是：
[0011] 用于破坏Mas受体和PSD95相互作用的融合肽TAT-MAS9C，其特殊之处在于
[0012]它的全长为20个氨基酸，其序列包括两部分，所述融合肽的氨基端为HIV-1 Tat蛋 白的跨膜结构域的11个氨基酸YGRKKRRQRRR，能够将融合肽引入细胞质;所述融合肽的羧基 端为Mas羧基末端9个氨基酸NTVSIETVV，能够破坏Mas与PSD95的相互作用。
[0013] 所述融合肽的氨基酸序列为YGRKKRRQRRRNTVSIETVV。
[0014] 为了某些研究需要，可以在融合肽氨基酸K上接上罗丹明，进行荧光标记。用于生 产本融合肽的方法是众所周知的，一般的多肽合成公司都能够利用固相合成法合成。
[0015] 本发明融合肽TAT-MAS9C的合成采用Fmoc/PyBOP方法，主要合成方法如下：
[0016] 融合肽合成在多肽自动合成仪上进行，称取Fmoc-val-wang resin树脂到砂芯过 滤反应器中，然后在合成仪中依次加入各种Fmoc-氨基酸。反应过程中加入的FM0C-氨基酸 并不是一次全部加入反应容器，而是按照多肽的序列顺序从C端逐渐加入，每接完一个氨基 酸，需要用30%六氢吡啶脱除Fmoc保护基团。接完多肽的树脂经过甲醇清洗后干燥。然后全 部转移至玻璃茄形瓶中，制备粗品，经过纯化、冻干得到融合肽。
[0017] 用于破坏Mas受体和PSD95相互作用的融合肽TAT-MAS9C可用于研究PSD95对Mas功 能的调控作用，同时可将本发明的融合肽TAT-MAS9C用于制备肽类药物，所述肽类药物用于 治疗神经系统相关疾病;尤其用于治疗脑卒中以及缺备、缺氧相关的神经系统的疾病；
[0018]融合肽TAT-MAS9C的应用方法，其特殊之处在于，具体步骤如下：
[0019] 将一定浓度的融合肽TAT-MAS9C(通常为10-5M-10-7M)加入细胞培养基中孵育30- 60min，融合肽就可以进入细胞中，达到干扰效果。
[0020] 为了能够追踪融合肽TAT-MAS9C在细胞内的动态变化，可以在融合肽氨基酸K上接 上罗丹明，进行荧光标记。
[0021] 本发明的融合肽，可以竞争Mas与PSD95的结合，从而破坏Mas与PSD95的相互作用， 该融合肽在破坏Mas与PSD95相互作用的同时，又保证了PSD95本身的突触功能，能够较好的 研究PSD95对Mas功能的调控作用。由于Mas能够介导血管紧张素（1-7)的脑缺血保护作用， 所以此融合肽可在细胞水平和动物水平研究PSD95对Mas介导的脑缺血保护作用的调控作 用和分子机制，为中风等脑缺血疾病治疗提供潜在的药物靶标。用神经元建立氧糖剥夺 (oxygen-glucose deprivation，OGD)模型模拟脑缺血缺氧环境，研究结果初步显示，此融 合肽能够加强血管紧张素（1-7)的脑缺血保护作用，因此，此融合肽具有重要的临床应用价 值，有可能应用于治疗神经系统相关疾病;尤其用于治疗脑卒中以及缺血、缺氧相关的神经 系统的疾病;在医疗领域研究中具有极其重要的理论意义和潜在的应用前景。
【附图说明】
[0022]图1A:用阴性对照孵育神经元30分钟，融合肽在神经元中的穿膜效果图；
[0023]图1B:用1(T5M融合肽孵育神经元30分钟，融合肽在神经元中的穿膜效果图；
[0024]图2A:在转染的293细胞中，融合肽能够破坏Mas与PSD95的相互作用的干扰效果 图；
[0025]图2B:在转染的293细胞中，融合肽不能破坏NR2B和PSD95的相互作用的干扰效果 图；
[0026] 图3:在神经元氧糖剥夺(oxygen-glucose deprivation，0GD)模型中，融合肽能够 增强0GD神经元活性、加强血管紧张素(1-7)保护作用的效果图；
[0027] 在图1A-图1B中，为了证明TAT-MAS9C的穿膜效果，用罗丹明标记的TAT-MAS9C及罗 丹明标记的阴性对照孵育神经元30min，然后在荧光显微镜下观察，实验结果发现TAT-MAS9C的穿膜效果良好。
[0028] 在图2A-图2B中，293细胞中转染Flag-Mas和PSD95,并加入融合肽TAT-MAS9C孵育 30min，收取细胞裂解液，进行免疫共沉淀，初步证明了融合肽的干扰效果（图2A)。为了证实 TAT-MAS9C的特异性，在293细胞中转染了与脑缺血关系密切的，目前被广泛研究的两种蛋 白的质粒:NMDA受体的亚单位NR2B和PSD95，并进行免疫共沉淀，结果发现TAT-MAS9C不能破 坏NR2B与PSD95的相互作用（图2B)，证实了融合肽TAT-MAS9C的特异性。
[0029] 在图3中，利用原代培养的海马神经元建立0GD模型，模拟脑缺血缺氧环境，分别用 血管紧张素（1-7)(4叫-(1-7))，1^ 8受体拮抗剂4779及融合肽14!'-1^59(：处理细胞，利用 CCK8试剂盒检测神经元活性。结果发现0⑶后神经元活性降低，Ang-(l-7)能够提高神经元 活性;加入A779后神经元活性降低，说明Ang-(l-7)的保护作用是通过Mas受体实现的。而融 合肽TAT-MAS9C能够增加0GD神经元活性，加强Ang-( 1-7)-Mas介导的保护作用。
【具体实施方式】
[0030] 下面就附图对本发明作以下详细说明。
[0031] 实施例1本发明融合肽的设计与合成
[0032] 用于破坏Mas受体和PSD95相互作用的融合肽TAT-MAS9C，它的全长为20个氨基酸， 其序列包括两部分，所述融合肽的氨基端为HIV-1 Tat蛋白的跨膜结构域的11个氨基酸 YGRKKRRQRRR，能够将融合肽引入细胞质；所述融合肽的羧基端为Mas羧基末端9个氨基酸 NTVSIETVV，能够破坏Mas与PSD95的相互作用。所述融合肽的氨基酸序列为 YGRKKRRQRRRNTVSIETW。
[0033] 为了某些研究需要，可以在融合肽氨基酸K上接上罗丹明，进行荧光标记。用于生 产本融合肽的方法是众所周知的，一般的多肽合成公司都能够利用固相合成法合成。
[0034]用于破坏Mas受体和PSD95相互作用的融合肽TAT-MAS9C的合成方法，主要步骤如 下：
[0035]合成采用Fmoc/PyBOP方法。融合肽合成在多肽自动合成仪上进行，称取Fmoc-val-wang resin树脂到砂芯过滤反应器中，然后在合成仪中依次加入各种Fmoc-氨基酸。反应过 程中加入的FM0C-氨基酸并不是一次全部加入反应容器，而是按照多肽的序列顺序从C端逐 渐加入，每接完一个氨基酸，需要用30%六氢吡啶脱除Fmoc保护基团。接完多肽的树脂经过 甲醇清洗后干燥。然后全部转移至玻璃茄形瓶中，制备粗品，经过纯化、冻干得到融合肽。 [0036]实施例2利用荧光显微镜验证TAT-MAS9C的穿膜效果 [0037]方案：
[0038] 实验分为两组:A组为罗丹明标记的阴性对照组;B组为TAT-MAS9C组。原代培养神 经元7天，待突触长成后，分别用罗丹明标记的阴性对照和10,的TAT-MAS9C孵育神经元 30min，将阴性对照和TAT-MAS9C洗掉，利用荧光显微镜拍照，观察他们的穿膜效果。
[0039] 结果：
[0040] 洗掉肽以后，发现A组阴性对照穿膜效果很差，荧光强度很弱（图1A)。而B组神经元 胞浆内，可见大量荧光标记的TAT-MAS9C(图1B)，说明TAT-MAS9C具有很好的穿膜效果。 [0041] 实施例3利用CoIP(免疫共沉淀)结合western blot(免疫蛋白印迹)方法验证TAT- MAS9C的干扰效果及特异性：
[0042]方案：
[0043] 实验分为三组，将293细胞接种在90mm细胞培养皿中，待密度为70 %左右时，同时 用Flag-Mas和PSD95质粒转染293细胞。转染24h后，A组培养基中加入阴性对照，孵育30min; B组加入终浓度为10-5M的TAT-MAS9C，孵育30min;C组加入10-6M的TAT-MAS9C，孵育30min。用 蛋白裂解液收取细胞，4°C持续混和lh，离心收集上清。lmL上清中加入50此的Anti-Flag M2Affinity Ge 1，4°C持续混和3h。离心lmin收集沉淀，用洗涤液洗涤沉淀，所得的沉淀物即 为免疫共沉淀复合物。在沉淀复合物中加入适量的蛋白上样缓冲液，95 °C保温5min，离心后 取上清，进行Western blot鉴定。
[0044] 为了证明TAT-MAS9C不会破坏PSD95与NMDAR等其他蛋白的相互作用，在293细胞中 转染了与脑缺血关系密切的，目前被广泛研究的两种蛋白的质粒:NMDA受体的亚单位NR2B 和PSD95,并进行免疫共沉淀，实验也分为两组:转染24h后，A组培养基中加入阴性对照，孵 育30min;B组加入终浓度为10- 5M的TAT-MAS9C，孵育30min。每组用lmL蛋白裂解液收取细胞 到离心管中，4°C持续混和lh，离心收集上清。每组上清中加入1 OyL anti-NR2B抗体，4°C持 续混和2h，在两管中分别加入50iiL的proteinA/G，4 °C持续混和过夜。离心lmin收集沉淀，并 用洗涤液洗涤沉淀，所得的沉淀物即为免疫共沉淀复合物。在沉淀复合物中加入适量的蛋 白上样缓冲液，95°C保温5min，离心后取上清，进行western blot鉴定。
[0045]结果：
[0046] 在细胞裂解液中Flag-Mas和PSD95表达基本一致的前提下，用Anti-Flag M2 Affinity Gel进行免疫沉淀，加入TAT-MAS9C后，沉淀复合物中的PSD95的含量降低。与加入 10一6M TAT-MAS9C组相比，加入10-5M的TAT-MAS9C组的沉淀复合物中，检测到的PSD95含量更 少（图2A)。说明TAT-MAS9C能够破坏Mas和PSD95的相互作用，TAT-MAS9Ci^度越高，破坏作用 越强。
[0047] 在细胞裂解液中NR2B和PSD95表达基本一致的前提下，用NR2B抗体进行免疫沉淀， 与未加TAT-MAS9C组相比，加入TAT-MAS9C后，沉淀复合物中的PSD95的含量并没有减少（图 2B)。说明TAT-MAS9C不能破坏NR2B和PSD95的相互作用，TAT-MAS9C具有一定的特异性。 [0048] 实施例4CCK8试剂盒检测TAT-MAS9C对0GD神经元活性的影响
[0049] 方案：
[0050] 在96孔板中接种神经元，按照实验分组每组设定6个复孔。原代培养神经元约7天 左右，待突触长成后，吸弃Neurobasal培养基，加入EBSS缓冲液(5.36mM KC1，0.116M NaCl， l.OmM NaH2P〇4,0.81mM MgS〇4，10mM HEPES，1.8mM CaCl2，14.7mM NaHC03)，将培养皿放到厌 氧培养箱(85 %N2、10 %H2、5 %⑶2)中，进行缺氧缺糖培养4h，然后在EBSS中直接加入终浓 度为5mM的葡萄糖，复氧复糖培养18小时。然后向每孔加入CCK8溶液，继续培养2小时，用酶 标仪检测450nm处的吸光度。实验分为五组:A，正常对照组(NC):不对神经元进行00)处理； B，实验对照组(0GD):对神经元进行0⑶处理4h;C，Angl-7组:在EBSS中加入终浓度为10-7M的 Angl-7进行0GD处理。D，A779+Ang-(l-7)组:在EBSS中加入终浓度为10-5M的A779和10- 7M的 Angl-7进行0GD处理。E，融合肽+Ang-( 1-7)组:在EBSS中加入终浓度为10-5M的融合肽和10-7M的Ang-(l-7)进行0GD处理。
[0051] 结果：
[0052] CCK8实验检测结果显示:0⑶组细胞活性明显降低，与NC组相比，差异具有统计学 意义(P〈0.01)，说明0GD模型造模成功。加入Ang-( 1-7)后，神经元活性增加，与0GD组比较差 异具有统计学意义(P〈〇. 01)，说明Ang-( 1-7)对0⑶神经元起到保护作用。加入Mas受体的拮 抗剂A779后神经元活性降低，说明Ang-(l-7)的保护作用是通过Mas受体实现的。最后一组， 加入融合肽TAT-MAS9C后，0⑶神经元活性仅次于NC组，与Ang-(l-7)组比较，差异具有统计 学意义(P〈〇.〇5)，说明TAT-MAS9C能够加强Ang-(l-7)-Mas介导的对0GD神经元的保护作用 (图 3)。
[0053]目前，对于本发明的实施方式，主要是可以将不同浓度的TAT-MAS9C加入所研究的 细胞培养基中孵育不同时间段，寻找针对于不同细胞进行TAT-MAS9C孵育的合适浓度的和 孵育时间。进一步研究TAT-MAS9C对细胞功能的影响，探讨PSD95对Mas功能的影响。
[0054] 在细胞水平的基础上，TAT-MAS9C可以用于动物实验，方法和注意事项同肽类药 物。由于Mas和PSD95都与神经功能密切相关，并且利用0GD神经元模型，已在神经元水平初 步证实破坏Mas和PSD95相互作用的TAT-MAS9C能够加强Ang-(l-7)-Mas介导的脑缺血保护 作用，因此TAT-MAS9C可用于研究治疗神经系统相关疾病，尤其用于治疗脑卒中以及缺血、 缺氧相关的神经系统的疾病。在动物实验中，可以利用缺血再灌等模型，利用ALZET微型渗 透栗侧脑室内缓慢灌注TAT-MAS9C等药物。缺血一定时间后，可以拔出线栓，分别再灌不同 时间，进行相关指标研究，以进一步研究TAT-MAS9C的作用，探讨PSD95对Mas功能的影响。
[0055] 如果在动物水平上发现TAT-MAS9C具有很好的治疗作用，可以进一步用于临床。可 以将本发明的融合肽和药用载体、佐剂等制成药物组合物。这些药用载体、佐剂等并不破坏 融合肽的药理活性，包括:离子交换剂、氧化铝、卵磷脂、山梨酸、胶体氧化硅、聚乙二醇等。 可以以口服用剂型、栓剂、注射等形式通过口服、肠胃外给药、局部给药、直肠给药或经由植 入性药盒等途径来实施治疗过程。
【主权项】
1. 用于破坏Mas受体和PSD95相互作用的融合肽TAT-MAS9C，其特征在于 它的全长为20个氨基酸，其序列包括两部分，所述融合肽的氨基端为HIV-1 Tat蛋白的 跨膜结构域的11个氨基酸YGRKKRRQRRR，能够将融合肽引入细胞质;所述融合肽的羧基端为 Mas羧基末端9个氨基酸NTVSIETVV，能够破坏Mas与PSD95的相互作用;所述融合肽的氨基酸 序列为 YGRKKRRQRRRNTVSIETW。2. 用于破坏Mas受体和PSD95相互作用的融合肽TAT-MAS9C的合成方法，其特征在于， 采用Fmoc/PyBOP方法在多肽自动合成仪上进行，称取Fmoc-val-wang resin树脂到砂 芯过滤反应器中，然后在合成仪中依次加入各种Fmoc-氨基酸;反应过程中加入的FM0C-氨 基酸并不是一次全部加入反应容器，而是按照多肽的序列顺序从C端逐渐加入，每接完一个 氨基酸，需要用30%六氢吡啶脱除Fmoc保护基团；接完多肽的树脂经过甲醇清洗后干燥;然 后全部转移至玻璃茄形瓶中，制备粗品，经过纯化、冻干得到融合肽。3. 用于破坏Mas受体和PSD95相互作用的融合肽TAT-MAS9C用于研究PSD95对Mas功能的 调控作用。4. 用于破坏Mas受体和PSD95相互作用的融合肽TAT-MAS9C在制备肽类药物中的应用， 所述肽类药物用于治疗神经系统相关疾病，尤其用于治疗脑卒中以及缺血、缺氧相关的神 经系统的疾病。5. 用于破坏Mas受体和PSD95相互作用的融合肽TAT-MAS9C的应用方法，其特征在于，具 体步骤如下： 将浓度为10-5Μ-10-7Μ的融合肽TAT-MAS9C加入细胞培养基中孵育30-60min，融合肽就可 以进入细胞中，达到干扰效果。
【文档编号】C07K1/04GK105820253SQ201610202332
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年3月31日
【发明人】卞伟华
【申请人】滨州医学院