一种抗肿瘤融合蛋白EL-defensin、其编码基因和用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于药用蛋白技术领域。具体而言，本发明涉及一种抗肿瘤融合蛋白、其编 码基因、以该融合蛋白为活性成分的药物以及其制药用途。
【背景技术】
[0002] 人的防御素（defensin)由粒细胞和上皮细胞产生，从遗传学上分为a -防御素和 3-防御素。它们在天然免疫方面主要表现为杀死病原微生物和带有包膜的病毒，而在获 得性免疫方面主要表现作为化学诱导剂和激活免疫细胞。a-防御素（HNP1-3)在肿瘤细 胞中超表达，而0 -防御素（HBD)在肿瘤细胞中极少表达，并且最近研究表明hBD-1可以作 为肿瘤的抑制基因。尤其近年来研究表明HBD-1与肿瘤细胞的增殖、分化和转移有重要的 联系。例如，诱导前列腺癌细胞中HBD-1的超表达，能够抑制前列腺癌细胞系DU145和PC3 的增殖，裂解细胞并且启动caspase蛋白介导的细胞凋亡；HBD-1刺激口腔鳞癌细胞BHY，使 BHY细胞中HBD-3表达量增加，并且抑制细胞的增长；小肠基底HIF-1a是DEFB1能够表达 所必需的，DEFB1是肠上皮细胞中HIF-la的靶点，而HIF-la的超表达会导致肿瘤的转移 和肿瘤血管的增生。
[0003] 辅基蛋白（LDP)是力达霉素LDM的蛋白部分，可以通过基因工程的方法制备。先 前报道LDP可以与肿瘤组织特异性结合，其本身在体内也具有中等程度的抗肿瘤作用，并 且物理性质和化学性质比较稳定。因此，LDP以其独特的分子结构及抗肿瘤特性，可以作为 开发新型抗肿瘤药物的支架载体。
[0004] 表皮生长因子受体（eipermal growth factor receptor, EGFR)是跨膜受体酪氨 酸激酶家族（ErbB)的一员，其配体有EGF、TGF-a、Amphiregulin、HB-EGF等，配体和受体 结合，进而活化一系列的胞内信号通络，最终促进细胞的增殖、分化和迁移。EGF是EGFR 的天然配体之一，由53个氨基酸组成，含有6个保守的半胱氨酸残基，形成3对二硫键， Cysl_Cys3形成A环，Cys2_Cys4形成B环，Cys5_Cys6形成C环，EGF与受体结合的区段位 于C环。
[0005] 基于上述，本发明研发了以辅基蛋白LDP为支架的新型抗肿瘤融合蛋白，其具有 EGFR靶向性和防御素HBD-1杀伤肿瘤细胞的功能。
【发明内容】
[0006] 本发明的一个目的是提供一种以LDP为支架具有靶向EGFR的防御素（HBD-1)的 融合蛋白，该融合蛋白为具有抗肿瘤作用的分子量较小的药用蛋白。
[0007] 本发明的另一个目的是提供该融合蛋白的编码基因。
[0008] 本发明的还有一个目的是提供以上述融合蛋白为活性成分的药物以及上述融合 蛋白的制药用途。
[0009] 本发明通过以下技术方案实现上述目的：
[0010] 迄今为止，在国外文献报道的相关防御素（defensin)抗肿瘤的研究中，防御素 (defensin)主要是通过真核表达系统获得的。但是，防御素含有三个二硫键，不易可溶性 表达，并且表达量极少，难以获得高纯度的防御素分子。可能是因为防御素分子难以表达， 关于防御素的融合蛋白的报道极少，目前尚无关于防御素的融合蛋白的报道，更没有将防 御素与具有靶向性的部分或分子相融合的报道。本发明人通过基因工程技术构建了以LDP 为支架的、具有靶向EGFR特异性的防御素（HBD-1)融合蛋白（本文命名为EL-defensin)重 组载体，将其转化到工程菌BL21star TM(DE3)中表达，并经纯化获得了一种多功能的具有抗 肿瘤作用的药用蛋白。其中，除表达的蛋白含量外，关于EGFR靶向性，发明人选取了与EGFR 受体结合的EGF重要结构C环，其上22个氨基酸残基作为导向分子，由此形成的较小分子 的蛋白也更容易穿透组织的细胞外间隙，到达实体肿瘤的深部。
[0011] 因此，一方面，本发明提供一种抗肿瘤融合蛋白，所述融合蛋白具有以下一级氨基 酸序列结构：
[0012] EGFR特异性靶向寡肽-连接肽1-辅基蛋白LDP-连接肽2-防御素（HBD-1);
[0013] 其中，所述EGFR特异性靶向寡肽具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列，共22个氨 基酸；所述辅基蛋白LDP具有SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列，共110个氨基酸；所述防御 素HBD-1具有SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列，共36个氨基酸。
[0014] 在该融合蛋白中，连接EGFR特异性靶向寡肽与辅基蛋白LDP的连接肽1以及连 接辅基蛋白LDP与防御素HBD1的连接肽2可以相同或不同。优选地，所述连接肽1为 (GGGGS)2，所述连接肽2为（GGGGS) 2。在选择连接肽时，需考虑如连接肽太短，则刚性大， 不利于蛋白分子伸展，容易造成蛋白分子构想相互遮掩，影响蛋白功能；并且考虑到作为 支架的辅基蛋白LDP共有110个氨基酸，具有a螺旋和0折叠，结构较复杂，因此，选用 (GGGGS)2。
[0015] 优选地，所述融合蛋白具有SEQIDN0:4所示的氨基酸序列；或者，所述融合蛋白 具有SEQIDN0:5所示的氨基酸序列；
[0016] 进一步优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示或SEQ ID N0:5。
[0017] SEQ ID N0:4为本发明提供的一个具体融合蛋白的氨基酸序列，共188个氨基 酸。从氨基端至羧基端，该融合蛋白包括：EGFR特异性靶向寡肽（Ec)，共22个氨基酸；连 接肽1，为（GGGGS) 2柔性肽，共10个氨基酸；辅基蛋白LDP，共110个氨基酸；连接肽2,为 (GGGGS)2柔性肽，共10个氨基酸；防御素HBD-1 (HBD-1)，共36个氨基酸。
[0018] SEQ ID N0:5为本发明提供的另一个具体融合蛋白的氨基酸序列，共192个氨基 酸。相比于SEQ ID N0:4,该融合蛋白在EGFR特异性靶向寡肽之前具有Met和Ala，在防御 素的C端具有Leu和Glu。
[0019] 另一方面，本发明提供上述融合蛋白的编码基因。
[0020] 优选地，所述编码基因具有SEQ ID N0:6或7所示的核苷酸序列；
[0021] 进一步优选地，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:6或7所示。
[0022] 另一方面，本发明还提供一种抗肿瘤药物，所述药物以本发明提供的上述融合蛋 白为活性成分。优选地，所述抗肿瘤药物用于治疗或预防鳞癌、肺癌或胰腺癌，优选肺癌。
[0023] 又一方面，本发明还提供上述融合蛋白在制备抗肿瘤药物中的用途。优选地，所述 抗肿瘤药物用于治疗或预防鳞癌、肺癌或胰腺癌，优选肺癌。
[0024] 综上，本发明应用基因工程的方法提供了一种新型的具有杀伤性、靶向性的融合 蛋白。该融合蛋白为靶向EGFR (表皮生长因子受体)、且含有LDP和defensin的新型蛋白。 与现有技术相比，本发明的融合蛋白具有以下实质性区别和效果：
[0025] 在现有技术中，尚无将防御素与其它部分或分子、特别是具有靶向性的部分或分 子相融合形成融合蛋白的报道。其原因可能在于，人的防御素分子HBD-1含有三个二硫键， 因此在原核细胞中极其难以表达，且常常以包涵体的形式表达，并且由于其分子空间结构 复杂，其不易和其它蛋白融合表达。
[0026] 而在本发明提供的融合蛋白中，以LDP作为支架，将防御素与EGFR的配体寡肽融 合，其中EGFR的配体寡肽为靶向分子，防御素HBD-1为弹头，从而构建了一个靶向EGFR的 弹头小分子药物。这样就实现了直接表达获得包含防御素的蛋白分子。实验证明，所得到 的融合蛋白不仅保留了 defensin杀伤肿瘤细胞的作用，而且能更特异地靶向肿瘤组织，因 此具有更好的杀伤肿瘤的优点，在动物体内具有良好的抗肿瘤效果，相比于单独应用各部 分，其技术效果更显著。并且，即使本领域已有一些将LDP作为支架构建融合蛋白的报道， 但是，现有的此类融合蛋白往往是使LDP起组装弹头分子AE的作用，与本发明提供的融合 蛋白具有本质区别，并且往往具有毒性大、无靶向性等缺点。