专利名称：基于单链抗体融合蛋白的夹心抗体芯片检测系统的构建方法
技术领域：
本发明涉及基因融合和蛋白芯片技术领域，更具体地涉及一种基于单链抗体融合蛋白的夹心抗体芯片检测系统的构建方法，采用基因融合技术构建单链抗体融合蛋白用于夹心抗体芯片；建立两种基于单链抗体融合蛋白的夹心抗体芯片检测系统。该系统的模式不仅可用于朊病毒的检测，还适用于其他疾病的病原检测，该模式在病原检测领域具有很好的应用价值。
背景技术：
将抗体分子片段与其它蛋白融合，可以得到具有抗体活性和其它生物活性或功能的抗体融合蛋白，抗体融合蛋白能改善免疫分析、免疫治疗和抗体纯化。抗体融合蛋白的构建形式主要有两种，即根据其抗体的可变片段和恒定片段的两大功能进行分别利用，使抗体融合蛋白具有抗体的某项特性，形成两大类抗体融合蛋白。一类是将功能蛋白和抗体的可变片段融合，另一类是将功能蛋白和抗体的恒定片段融合。以前的抗体融合蛋白的构建是采用化学交联的方法，但这样的抗体交联蛋白组成不均一，性能不稳定，分子大，穿透能力低，免疫源性大。随着基因工程和基因工程抗体技术的迅速发展，特别是90年代以来噬菌体抗体技术的发展，不仅使抗体片段的筛选和制备越来越方便，而且由于基因工程抗体片段的分子小、功能强、稳定性高、易于基因融合的特点，抗体融合蛋白的构建也越来越方便。采用基因融合的方法包括以一段多肽链连接抗体分子和功能蛋白而构建的抗体融合蛋白结构稳定性高，性能也更为可靠。目前应用于抗体融合蛋白较多的抗体分子是Fab和scFv。它们与具各种特征的短肽标记融合，如与E-tag，C-myc，His-tag等融合，可用于对抗体的快速纯化和抗原的分析检测；与其他特征标记的蛋白融合，其主要用于对目标抗原的分析检测和抗体抗原结合后性质的研究，如Fab、scFv与碱性磷酸酶、链霉抗生物素蛋白、金黄色葡萄球菌蛋白A(spA)等融合构建的抗体融合蛋白可改善免疫分析，简化分析过程。
目前，对于疾病标志物的检测和蛋白组分析中的蛋白芯片主要分为正向芯片(forward phase array)(或抗体芯片，antibody array)、反向蛋白芯片(reverse-phase protein array，RPA)和夹心蛋白芯片，正向芯片是在芯片上固定抗体，再加入通过标记的待检的样品混合物，进行信号检测，主要用于蛋白谱的研究；反相蛋白芯片是待检的样品混合物直接固定在芯片的特定固相支持物上，然后加标记的蛋白或抗体进行检测，主要用于蛋白的功能分析。夹心蛋白芯片是首先将捕获抗体固定在芯片基片上，捕获要检测的分析物，然后加带有标记的检测抗体，捕获抗体和检测抗体要求针对目标分析物不同的抗原表位，主要用于目标分析物的特异性检测。目前的双抗体夹心蛋白芯片用于分析物的检测主要采用两个单克隆抗体。虽然单克隆抗体具有较高的亲和力，但单克隆抗体的筛选和制备比较烦琐和昂贵以及朊病毒检测灵敏度仍然满足不了实际检测要求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于单链抗体融合蛋白的夹心抗体芯片检测系统的构建方法，通过DNA重组构建了带有链霉亲和素亲和肽(SBP)的单链抗体融合蛋白用于蛋白的定向固定，构建的单链抗体融合蛋白scFv-Fc，亲和力有了明显提高。基于双单链抗体融合蛋白的夹心抗体芯片是完全通过DNA重组构建单链抗体融合蛋白组成的检测系统，单链抗体融合蛋白分子和夹心抗体检测系统，不仅为解决疯牛病快速、灵敏的检测提供了技术途径，而且还为其他疾病的病原检测提供新的模式。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施A、构建了三个单链抗体融合蛋白Z186-L-SBP、Z163-L-SBP、Z163-Fc(Z1030-Fc在夹心ELISA过程中被淘汰)。
单链抗体融合蛋白Z163-L-SBP和Z186-L-SBP表达载体的构建利用上游引物SBP15’ATATAGCGGCCGCTTCGAGCTCAGGAG3’和下游引物SBP25’TGACCGGATCCTGGTTCACGTTGACCTT3’扩增N端带Linker(SSSGGSGSG)的SBP片段(L-SBP)(KEEFEAD.et al.2001，Protein Expression and Purification，23(3)440-446)，双链两端分别为NotI和BamHI限制性酶切位点。然后双链序列与经NotI和BamHI双酶切的线性化质粒pOPE101-215(Yol)片段混合(Wang T.et al.2003，ZhonghuaShi Yan He Lin Chuang Bing Du Xue Za Zhi.17(2)116-20)，经T4DNA连接酶于16℃下连接过夜，连接产物为载体pOPE-L-SBP。将筛选到的阳性克隆用NcoI和NotI双酶切进行线性化，与经同样双酶切的pCANTAB5E-Z163(pCANTAB 5EPharmacia公司产品)和pCANTAB5E-Z186胶回收的产物Z163和Z186，以1∶3的摩尔用T4DNA连接酶于16℃下连接过夜，连接产物为pOPE-Z163-L-SBP和pOPE-Z186-L-SBP。
单链抗体融合蛋白Z163-Fc表达载体的构建用BamHI和NotI从载体pPICZaFc(Eeckhout D.et al.2004.J ImmunolMethods 294181-187)上切下Fc基因片断，然后和同样双酶切的载体pOPE以3∶1的摩尔比连接，用T4DNA连接酶于16℃条件下连接过夜，连接产物为编码有Fc的pOPE-Fc。
用NcoI和NotI双酶切pCANTAB5E-Z163，与同样双酶切的载体pOPE-Fc以3∶1的摩尔比连接，用T4DNA连接酶于16℃条件下连接过夜，连接产物为编码有scFv和Fc的pOPE-Z163-Fc。
用夹心ELISA(酶联免疫吸附实验)对单链抗体融合蛋白及抗牛朊蛋白单克隆抗体KG9进行配对实验，Z186-L-SBP/Z163-Fc和KG9/Z163-L-SBP配对显示明显的阳性结果。
B、通过夹心ELISA，筛选到配对抗体Z186-L-SBP/Z163-Fc和KG9/Z163-L-SBP，在此基础上发展了两种高特异性和灵敏度的夹心抗体芯片基于单抗和单链抗体融合蛋白的夹心抗体芯片和基于双单链抗体融合蛋白的夹心抗体芯片，对重组牛朊蛋白检测限可达1pg/mL，并可以检测鼠脑中天然朊蛋白。两种夹心抗体芯片可以发展成为新的高灵敏度和高特异性的朊病毒检测系统。
本发明的目的是构建基于单链抗体融合蛋白的夹心抗体芯片，发展新的高灵敏度和高特异性的朊病毒检测系统，并为其它疾病的病原检测提供新的模式。
本发明与现有技术相比，有以下优点和效果SBP融合于scFv的C端，既能用于纯化，又能与Streptavidin修饰的荧光纳米颗粒或量子点特异结合，作为检测抗体用于目标蛋白检测。scFv-L-SBP融合蛋白在本研究中的另一个突出的特点是可以与链霉亲和素包被的芯片进行结合，实现scFv-L-SBP融合蛋白的定向固定，作为捕获性抗体，用于目标蛋白的捕获和检测。融合蛋白Z163-Fc既保持了scFv的专一性，又保持了完整抗体的亲和力。在实际应用中，通过proteinA、protein G进行纯化和定向固定，又可以作为检测性抗体。
目前，使用的抗体都为单克隆抗体，单克隆抗体有很高的专一性，但常常出现交差反应，而专一性很强的重组抗体，特别是单链抗体表现出明显的优点。本研究采用单克隆抗体和单链抗体融合蛋白配对构建了夹心抗体芯片，它结合了单克隆抗体的高亲合力和单链抗体的专一性。
本发明的另一种夹心抗体芯片是基于单链抗体融合蛋白(scFv-L-SBP)定向固定和scFv-Fc的双单链抗体融合蛋白的夹心抗体芯片，具有很强的专一性和灵敏度，该蛋白芯片检测限可达1pg/mL，比目前灵敏度高的时间分辨加强荧光的定量夹心ELISA方法(50pg/mL)更灵敏。
图1为一种单链抗体融合蛋白Z163-L-SBP和Z186-L-SBP表达载体的构建示意2.为一种单链抗体融合蛋白Z163-Fc和Z1030-Fc表达载体的构建示意3.夹心ELISA筛选单克隆抗体与单链抗体融合蛋白配对1.KG9/Z163-L-SBP配对，rb-PrPc(灰色矩形)；2.TrxA(阴性对照，白色矩形)；3.KG9/Z1030-Fc配对，rb-PrPc(灰色矩形)；4.TrxA(阴性对照，白色矩形)；5.KG9/Z186-L-SBP配对，rb-PrPc(灰色矩形)；6.TrxA(阴性对照，白色矩形)。
图4.为一种基于单克隆抗体和单链抗体融合蛋白的夹心抗体芯片的模式图(I)多聚赖氨酸包被的芯片；(II)单克隆抗体KG9包被在多聚赖氨酸芯片上；(III)加rb-PrPc；(IV)加scFv-L-SBP；(V)加QD635nm-streptavidin conjugate。
图5.基于单抗和单链抗体融合蛋白的夹心抗体芯片检测牛朊蛋白的专一性Aa1-3rb-PrPc(10ng/mL)；b1-3TrxA(10ng/mL)；c1-3BSA(10ng/mL)；d1-3OVA(10ng/mL)。
B635nm荧光强度。黑色矩形对应rb-PrPc，条纹矩形对应TrxA，灰色矩形对应BSA，空白矩形对应OVA。每个矩形表示三个重复。
图6.基于单抗和单链抗体融合蛋白的夹心抗体芯片检测牛朊蛋白灵敏度。
A定量检测rb-PrPc(a1-a3)，100pg/mL rb-PrPc；(b1-b3)，10pg/mLrb-PrPc；(c1-c3)，1pg/mL rb-PrPc；阴性对照，(d4-d6)，100pg/mL TrxA；(e4-e6)，10pg/mLTrxA；(f4-f6)1pg/mL TrxA。
B635nm荧光强度，灰色矩形对应rb-PrPc，条纹矩形对应TrxA，每个矩形表示三个重复。
图7.基于单抗和单链抗体融合蛋白的夹心蛋白芯片检测鼠朊蛋白Aa1-a3鼠脑PrPc；b1-b3TrxA，10ng/mL。
B635nm荧光强度，灰色矩形对应鼠脑PrPc；条纹矩形对应阴性对照，每个矩形表示三个重复。
图8.夹心ELISA筛选单链抗体融合蛋白配对1.Z186-L-SBP/Z163-Fc配对，rb-PrPc(灰色矩形)；2.TrxA(阴性对照，白色矩形)；3.Z186-L-SBP/Z1030-Fc配对，rb-PrPc(灰色矩形)；4.TrxA(阴性对照，白色矩形)；5.Z163-L-SBP/Z1030-Fc配对，rb-PrPc(灰色矩形)；6.TrxA(阴性对照，白色矩形)。
图9.基于双单链抗体融合蛋白的夹心抗体芯片的模式图。
I)streptavidin修饰的芯片；II)通过SBP-streptavidin相互作用固定Z186-L-SBP的抗体芯片的固定；III)通过抗体芯片固定rb-PrPc；IV)检测抗体Z163-Fc-Cy3与捕获的rb-PrPc结合，检测荧光信号。
图10.基于双单链抗体融合蛋白夹心抗体芯片检测牛朊蛋白的专一性Aa1-3rb-PrPc(10ng/mL)；b1-3TrxA(10ng/mL)；c1-3BSA(10ng/mL)；d1-3OVA(10ng/mL)。
B532nm荧光强度。黑色矩形对应rb-PrPc，条纹矩形对应TrxA，灰色矩形对应BSA，空白矩形对应OVA。每个矩形表示三个重复。
图11.基于双单链抗体融合蛋白的夹心蛋白芯片检测牛朊蛋白的灵敏度A定量检测rb-PrPc(a1-a3)，100pg/mL rb-PrPc；(b1-b3)，10pg/mLrb-PrPc；(c1-c3)，1pg/mL rb-PrPc；(d1-d3)，阴性对照，100pg/mL TrxA。
B532nm荧光强度，灰色矩形对应rb-PrPc，条纹矩形对应TrxA，每个矩形表示三个重复。
图12.基于单链抗体融合蛋白的夹心抗体芯片检测鼠朊蛋白Aa1-a3鼠脑PrPc；b1-b3TrxA，10ng/mL。
B532nm荧光强度，灰色矩形对应鼠脑PrPc；条纹矩形对应阴性对照，每个矩形表示三个重复。
具体实施例方式
实施例1单链抗体融合蛋白Z163-L-SBP和Z186-L-SBP表达载体的构建根据图1可知利用上游引物SBP15’ATATAGCGGCCGCTTCGAGCTCAGGAG3’和下游引物SBP25’TGACCGGATCCTGGTTCACGTTGACCTT3’扩增N端带Linker(SSSGGSGSG)的链霉亲和素结合肽(SBP)片段(L-SBP)(KEEFE A D.et al.2001，Protein Expression and Purification，23(3)440-446)，双链两端分别为NotI和BamHI限制性酶切位点。然后双链序列与经NotI和BamHI双酶切的线性化质粒pOPE101-215片段混合(Wang T.et al.2003，Zhonghua Shi Yan He Lin Chuang Bing Du Xue Za Zhi.17(2)116-20)，经T4DNA连接酶于16℃下连接过夜，连接产物为载体pOPE-L-SBP。将筛选到的阳性克隆用NcoI和NotI双酶切进行线性化，与经同样双酶切的pCANTAB5E-Z163(pCANTAB 5EPharmacia公司产品)和pCANTAB5E-Z186胶回收的产物Z163和Z186，以1∶3的摩尔用T4DNA连接酶于16℃下连接过夜，连接产物为pOPE-Z163-L-SBP和pOPE-Z186-L-SBP。
实施例2单链抗体融合蛋白Z163-Fc和Z1030-Fc表达载体的构建用BamHI和NotI从载体pPICZaFc(Eeckhout D.et al.2004.JImmunol Methods 294181-187)上切下Fc基因片断，然后和同样双酶切的载体pOPE-215以3∶1的摩尔比连接，用T4DNA连接酶于16℃条件下连接过夜，连接产物为编码有Fc的pOPE-Fc。
根据图2可知，用NcoI和NotI双酶切pCANTAB5E-Z163和pCANTAB5E-Z1030，与同样双酶切的载体pOPE-Fc以3∶1的摩尔比连接，用T4DNA连接酶于16℃条件下连接过夜，连接产物为编码有scFv和Fc的pOPE-Z163-Fc和pOPE-Z1030-Fc。
实施例3基于单抗和单链抗体融合蛋白的夹心抗体芯片的构建1.单克隆抗体与单链抗体融合蛋白配对根据图3可知，用1μg/mL单克隆抗体KG9包被96孔酶标板，用4％的PBSM于37℃封闭2h，PBS洗三遍，加10μg/mL rb-PrPc，同时，用10μg/mL TrxA为阴性对照，37℃温育2h；分别加25μg/mL的scFv-L-SBP和scFv-Fc，37℃温育2h；PBS洗三次，在scFv-L-SBP组中加入streptavidin-AP耦联物，37℃温育1h，加100μL/孔碱性磷酸酶底物pNPP显色，于405nm处测定吸光值；在scFv-Fc组中，加带HRP的马抗人Fc抗体，37℃温育1h，加100μL/孔底物TMB显色，于450nm处测定吸光值，以上反应复合物的OD值/阴性对照的OD值(S/N)＞2时判为阳性，每组配对设3个重复。
在单克隆抗体与单链抗体融合蛋白进行的配对实验中，以单克隆抗体KG9作为捕获抗体，分别以单链抗体融合蛋白Z163-L-SBP、Z1030-Fc和Z186-L-SBP为检测抗体，组合为KG9/Z163-L-SBP、KG9/Z1030-Fc和KG9/Z186-L-SBP，夹心ELISA结果显示3组配对的rb-PrPc/TrxA OD450nm比值分别为3.4、2.0和1.1，KG9/Z163-L-SBP组配对显示明显的阳性反应，KG9/Z1030-Fc显示阳性反应，但比值较低，因此选用KG9/Z163-L-SBP组配对用于夹心蛋白芯片检测牛朊蛋白的研究。
2.基于单抗和单链抗体融合蛋白的夹心抗体芯片的构建图4为基于单克隆抗体和单链抗体融合蛋白的夹心抗体芯片产生的模式图。在包被有单克隆抗体KG9的多聚赖氨酸芯片上按阵列点0.1μL/点的rb-PrPc或鼠脑组织细胞膜的提取物，室温(20-25℃)下温育1h，用PBST和PBS各洗三次，同时，以TrxA设为阴性对照，夹心抗体芯片特异性实验分别用硫氧还蛋白(TrxA)，牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)作为阴性对照，然后在每个点上加10μg/mL的Z163-L-SBP，室温(20-25℃)下温育1h，用PBST和PBS各洗三次，风干后加streptavidin耦联的量子点，37℃温育30min，用PBST和PBS各洗三次洗去未结合的量子点，量子点在635nm(Geho D，et al.2005，Bioconjug Chem，16(3)559-66)的荧光信号检测使用GenePix 4000B(Axon Instrument)荧光扫描仪。所有的信号分析使用GenePix Pro 4.0分析软件(Axon Instruments)，检测限规定为信噪比(S/N)≥3时被检朊蛋白的浓度(Cretich M.et al.2004，Anal Biochem，332(1)67-74)。
3.基于单抗和单链抗体融合蛋白的夹心抗体芯片的专一性为了研究基于单克隆抗体和单链抗体融合蛋白的夹心抗体芯片检测牛朊蛋白的专一性，在包被有单克隆抗体KG9的多聚赖氨酸芯片上按阵列点0.1μL/点的样品加10ng/mL rb-PrPc，同时，以TrxA、BSA和OVA为阴性对照，其然后在每个点上加10μg/mL的Z163-L-SBP，以streptavidin耦联的量子点作为检测信号结果显示rb-PrPc与阴性对照在635nm的荧光强度的信噪比(S/N)分别为5.6、4.2和3.5，表明该夹心蛋白芯片采用不同的蛋白作为阴性对照均能显示明显的阳性结果，具有很强的的专一性(图5A，B)。
4.基于单抗和单链抗体融合蛋白的夹心抗体芯片的灵敏度为了研究基于单抗和单链抗体融合蛋白的夹心抗体芯片检测牛朊蛋白的灵敏度，加入不同稀释度的rb-PrPc(购自德国Roboscreen公司)进行比较，rb-PrPc稀释度分别为100pg/mL、10pg/mL和1pg/mL，信噪比(S/N)分别为4.0、3.4和3.2，结果表明检测限可达1pg/mL(图6A，B)。
5.基于单抗和单链抗体融合蛋白的夹心抗体芯片检测鼠朊蛋白在包被有单克隆抗体KG9的多聚赖氨酸芯片上，按阵列点0.1μL/点鼠脑组织细胞膜的提取物，以TrxA作为对照同步检测测，检测结果显示鼠脑组织细胞膜的提取物与阴性对照在635nm的荧光强度的信噪比(S/N)为3.1，显示明显的阳性结果，表明该夹心抗体芯片能够检测鼠脑中天然的朊蛋白(图7A，B)。
实施例4基于双单链抗体融合蛋白的夹心抗体芯片的构建1.单链抗体融合蛋白配对用Z186-L-SBP和Z163-L-SBP(10μg/mL in PBS)分别包被96孔酶标板，用4％的PBSM于37℃封闭2h，PBS洗三遍，加10μg/mL rb-PrPc，同时，用10μg/mL TrxA为阴性对照，37℃温育2h；加1μg/mL的Z163-Fc或Z1030-Fc 37℃温育2h；PBS洗三次，加入马抗人Fc-HRP抗体，37℃温育1h，加底物TMB显色，1M H2SO4终止反应，于450nm处测定吸光值，以上反应复合物的OD值/阴性对照的OD值(S/N)＞2时判为阳性，每组配对设3个重复。
通过单链抗体融合蛋白配对，对四个单链抗体融合蛋白进行了两两配对，两个Z186-L-SBP和Z163-L-SBP作为捕获抗体，两个Z163-Fc和Z1030-Fc作为检测抗体，单链抗体融合蛋白配对的组合为Z186-L-SBP/Z163-Fc、Z186-L-SBP/Z1030-Fc和Z163-L-SBP/Z1030-Fc，结果显示三组配对的rb-PrPc/TrxA OD450nm比值分别为4.2、1.3和1.1，Z186-L-SBP/Z163-Fc组配对显示明显的阳性反应，该配对用于夹心蛋白芯片检测牛朊蛋白的研究(图8)。
2.基于双单链抗体融合蛋白的夹心抗体芯片的构建图9为基于双单链抗体融合蛋白的夹心抗体芯片产生的模式图。在定向固定有单链抗体融合蛋白Z186-L-SBP的Streptavidin包被的芯片上按阵列点0.1μL/点的rb-PrPc或鼠脑的匀浆液，室温(20-25℃)下温育1h，用PBST和PBS各洗三次，同时，以TrxA设为阴性对照，夹心抗体芯片特异性实验分别用TrxA，BSA和OVA作为阴性对照，然后在每个点上加1ug/mL Cy3荧光标记的蛋白Z163-Fc，室温(20-25℃)下温育1h，用PBST和PBS各洗三次，风干后，未洗去的Cy3荧光标记的蛋白Z163-Fc在532nm的荧光信号检测使用GenePix 4000B(Axon Instrument)荧光扫描仪。所有的信号分析使用GenePix Pro 4.0分析软件(Axon Instruments)，检测限规定为信噪比(S/N)≥3时，被检朊蛋白的浓度。
3.基于双单链抗体融合蛋白夹心抗体芯片的专一性按照图10A，B所示，在定向固定有单链抗体融合蛋白Z186-L-SBP的Streptavidin包被的芯片(Nallur G，et al.2001.Nucleic Acids Res.29(23)118)上按阵列点0.1μl/点rb-PrPc，同时，以10ng/mL TrxA、BSA和OVA为阴性对照，然后在每个点上1μg/mL的Cy3荧光标记的蛋白Z163-Fc，在532nm的rb-PrPc组与阴性对照组的荧光强度的信噪比(S/N)分别为6.8，8.5和13.3，表明该夹心蛋白芯片采用不同的蛋白作为阴性对照均能显示明显的阳性结果，也具有很强的的专一性。
4.基于双单链抗体融合蛋白的夹心抗体芯片的灵敏度按照图11A，B所示，在定向固定有单链抗体融合蛋白Z186-L-SBP的Streptavidin包被的芯片上按阵列点浓度分别为100pg/mL、10pg/mL和1pg/mL的rb-PrPc，以TrxA作为对照同步检测，检测结果显示在532nm荧光强度的信噪比(S/N)分别为6.1，3.8和3.1，结果表明检测限也可达1pg/mL。
5.基于双单链抗体融合蛋白的夹心抗体芯片检测鼠朊蛋白按照图12A，B所示，在定向固定有单链抗体融合蛋白Z186-L-SBP的Streptavidin包被的芯片上，按阵列点0.1μL/点鼠脑组织细胞膜的提取物，以TrxA作为对照同步检测，检测结果显示鼠脑组织细胞膜的提取物组与阴性对照组在532nm的荧光强度的信噪比(S/N)为13，显示明显的阳性结果，表明该夹心抗体芯片也能够检测鼠脑中天然的朊蛋白。
权利要求
1.一种基于单链抗体融合蛋白的夹心抗体芯片检测系统的构建方法，该系统包括下列步骤A、构建三种单链抗体融合蛋白Z163-L-SBP、Z186-L-SBP和Z163-Fc首先是单链抗体融合蛋白Z163-L-SBP和Z186-L-SBP表达载体的构建，利用上游引物SBP1 5’ATATAGCGGCCGCTTCGAGCTCAGGAG3’和下游引物SBP2 5’TGACCGGATCCTGGTTCACGTTGACCTT3’扩增N端带Linker的SBP片段，双链两端分别为NotI和BamHI限制性酶切位点，然后双链序列与经NotI和BamHI双酶切的线性化质粒pOPE101-215片段混合，经T4 DNA连接酶于16℃下连接过夜，连接产物为载体pOPE-L-SBP，将筛选到的阳性克隆用NcoI和NotI双酶切进行线性化，与经同样双酶切的pCANTAB5E-Z163和pCANTAB5E-Z186胶回收的产物Z163和Z186，以1∶3的摩尔用T4 DNA连接酶于16℃下连接过夜，连接产物为pOPE-Z163-L-SBP和pOPE-Z186-L-SBP；其次是单链抗体融合蛋白Z163-Fc表达载体的构建，用BamHI和NotI从载体pPICZaFc上切下Fc基因片断，然后和同样双酶切的载体pOPE-215以3∶1的摩尔比连接，用T4 DNA连接酶于16℃条件下连接过夜，连接产物为编码有Fc的pOPE-Fc，然后用NcoI和NotI双酶切pCANTAB5E-Z163，与同样双酶切的载体pOPE-Fc以3∶1的摩尔比连接，用T4 DNA连接酶于16℃条件下连接过夜，连接产物为编码有scFv和Fc的pOPE-Z163-Fc；B、通过夹心ELISA，筛选配对抗体Z186-L-SBP/Z163-Fc和KG9/Z163-L-SBP，两种高特异性和灵敏度的夹心抗体芯片基于单抗和单链抗体融合蛋白的夹心抗体芯片和基于双单链抗体融合蛋白的夹心抗体芯片，对重组牛朊蛋白检测达1pg/mL，并检测鼠脑中天然朊蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种基于单链抗体融合蛋白的夹心抗体芯片检测系统的构建方法，其特征在于基于单抗和单链抗体融合蛋白的夹心抗体芯片的构建，首先在包被有单克隆抗体KG9的多聚赖氨酸芯片上按阵列点0.1μL/点的rb-PrPc或鼠脑组织细胞膜的提取物，室温下温育1h，用PBST和PBS各洗三次，以硫氧还蛋白设为阴性对照，夹心抗体芯片特异性实验分别用硫氧还蛋白，牛血清白蛋白和卵清白蛋白作为阴性对照；其次是在点上加10μg/mL的Z163-L-SBP，室温下温育1h，用PBST和PBS各洗三次，风干后加streptavidin耦联的量子点，37℃温育30min，用PBST和PBS洗去未结合的量子点，量子点在635nm的荧光信号检测使用GenePix 4000B荧光扫描仪。
3.根据权利要求1所述的一种基于单链抗体融合蛋白的夹心抗体芯片检测系统的构建方法，其特征在于基于双单链抗体融合蛋白的夹心抗体芯片的构建，首先在定向固定有单链抗体融合蛋白scFv-L-SBP的Streptavidin包被的芯片上按阵列点0.1μL/点的rb-PrPc或鼠脑的匀浆液，室温下温育1h，用PBST和PBS各洗三次，同时，以TrxA设为阴性对照，夹心抗体芯片特异性实验分别用硫氧还蛋白，牛血清白蛋白和卵清白蛋白作为阴性对照，然后在点上加1μg/mLCy3荧光标记的蛋白Z163-Fc，室温下温育1h，用PBST和PBS各洗三次，风干后，未洗去的Cy3荧光标记的蛋白Z163-Fc在532nm的荧光信号检测使用GenePix 4000B荧光扫描仪。
全文摘要
本发明公开了一种基于单链抗体融合蛋白的夹心抗体芯片检测系统的构建方法。本发明首先是单链抗融合蛋白Z186－L－SBP和Z163－L－SBP表达载体的构建，设计上下游引物，双链两端分别为NotI和BamHI限制性酶切位点，连接产物；其次是单链抗体融合蛋白Z163－Fc表达载体的构建。通过夹心ELISA方法筛选用于夹心抗体芯片配对的单链抗体融合蛋白，并在此基础上建立了特异性和灵敏度更高的夹心抗体芯片检测系统，该系统的模式不仅适合朊病毒的检测，还适用于其他疾病的病原检测。
文档编号G01N21/64GK1866022SQ20061001936
公开日2006年11月22日 申请日期2006年6月15日 优先权日2006年6月15日
发明者张先恩, 张吉斌, 周亚凤, 毕利军, 张治平, 汪世华, 陈媛媛, 郭永超, 文继开, 喻子牛 申请人:中国科学院武汉病毒研究所