CD20特异性嵌合抗原受体及其应用的制作方法

本发明涉及生物遗传领域，尤其是一种编码CD20特异性嵌合抗原受体的核酸和表达嵌合抗原受体的T细胞，可用于B细胞淋巴瘤、B细胞淋巴细胞白血病的过继细胞治疗(adoptive cell therapy,ACT)领域。

背景技术：

嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor,CAR)是人工合成的T细胞受体，由胞外靶向连接区，以及T细胞的激活信号结构域(铰链区、跨膜区、胞内信号转导区)组成。胞外靶向连接区由单链抗体或配体构成，具有特异性结合靶抗原的功能。铰链区往往采用CD8、CD4或IgG4分子的铰链区。跨膜区由亲脂性的氨基酸序列组成，往往采用CD8、CD28的跨膜区段。胞内信号转导区由CD3ζ链或FcεRⅠγ链以及共刺激信号分子CD28、CD137(4-1BB)、CD134(OX40)、CD27、ICOS、CD244等构成。仅含有CD3ζ链或FcεRⅠγ链为第一代CAR，包含1个共刺激信号分子为第二代CAR，含有2个及以上共刺激信号分子的CAR为第三代。CAR修饰的T细胞通过胞外靶向连接区识别肿瘤表面抗原，然后通过胞内信号转导区将识别信号传递到细胞内，激活T细胞并发挥杀伤肿瘤细胞作用。

CAR能够识别细胞表面未经加工处理的蛋白，不受MHC限制；且CAR与配体之间的结合力较正常T细胞受体与肽-MHC间的结合力更大；CAR的识别也不受共刺激分子协同表达的限制。因此，CAR修饰T细胞过继治疗可较好地克服肿瘤细胞的下调MHC分子或者减少共刺激因子表达等免疫逃避机制。

除了B细胞发育的最早期和最晚期，CD20表达在包括晚期前体B细胞到记忆B细胞几乎所有阶段的B细胞表面。并且发现CD20在90％以上B细胞淋巴瘤和1/3急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)中表达。因此，CD20是治疗B细胞淋巴瘤和B淋巴细胞白血病的有针对性的肿瘤靶抗原。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是，提供一种CD20特异性嵌合抗原受体及其应用，所述CAR特异性结合到靶抗原上，并发挥针对B细胞淋巴瘤、B细胞淋巴细胞白血病的细胞毒效应。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种CD20特异性嵌合抗原受体，该嵌合抗原受体由小鼠抗人CD20的单链抗体scFv、CD8铰链区和跨膜区、CD28和/或CD137T细胞共刺激信号分子及CD3ζ的胞内信号结构串联构成；该嵌合抗原受体含有CD20特异性的单链抗体，其氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NO.3所示，该嵌合抗原受体的氨基末端含有一个信号肽，其氨基酸序列如表中的SEQ ID NO.4所示，该嵌合抗原受体的轻链和重链之间由氨基酸序列如表中的SEQ ID NO.6所示的连接肽连接而成。

优选，所述嵌合抗原受体以CD8α铰链区和跨膜区以及CD137和CD3ζ的胞内信号结构域串联而成的结构域为T细胞刺激信号传导结构，其氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NO.5所示。

所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。所述嵌合抗原受体的核酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

上述的CD20特异性嵌合抗原受体在抗B细胞淋巴瘤、B细胞淋巴细胞白血病药物中的应用。

本发明的有益效果是：本发明在既往专利《抗CD20嵌合抗体突变体基因及应用》(专利号：ZL 02158550.4)的序列中扩增出抗体的重链可变区和轻链可变区，并经重叠延伸PCR技术加入linker形成CD20特异性scFv。并将构建的scFv片段克隆到含有信号肽和CD8α-CD137-CD3ζ的慢病毒表达载体中，包装成携带CD20 scFv-CD8α-CD137-CD3ζ编码基因的慢病毒载体。利用慢病毒感染T细胞，使T细胞表达该嵌合抗原受体。通过流式细胞术、脱颗粒分析实验、以及ELISA检测T细胞分泌的细胞因子，证明该嵌合抗原受体修饰的T细胞对表达CD20的淋巴瘤细胞具有特异杀伤作用。因此本发明所述的嵌合抗原受体CD20 scFv-CD8α-CD137-CD3ζ可在B细胞淋巴瘤、B细胞淋巴细胞白血病的治疗中应用。

附图说明

图1是本发明的CD20单抗的轻链可变区(V_L)、重链可变区(V_H)、以及两者连接后的单链抗体片段的PCR扩增电泳图(1泳道：2kb核酸分子量标准；2泳道：V_L；3泳道：V_H；4泳道：CD20 scFv)。

图2是本发明的慢病毒表达载体CD20 scFv-CD8α-CD137-CD3ζ限制性内切酶酶切片段电泳鉴定图(1泳道：15kb核酸分子量标记；2泳道：用核酸内切酶XbaⅠ和NotⅠ双酶切慢病毒表达质粒CD20 scFv-CD8α-CD137-CD3ζ所得到的编码CD20 scFv-CD8α-CD137-CD3ζ的DNA片段(732bp)和载体片段(7985bp)；3泳道：未酶切的CAR载体)。

图3是本发明的慢病毒表达载体示意图(其中逆时针序列是正向基因片段，顺时针为反向基因片段)。

图4是流式细胞术检测本发明构建的CD20 scFv-CD8α-CD137-CD3ζ修饰T细胞中CAR分子的表达图(A为转染空载体的T细胞；B转染CAR的T细胞)。

图5是流式细胞术检测B细胞淋巴瘤细胞系Raji和Namalwa细胞中CD20靶抗原分子的表达水平图(A为CD20靶抗原分子表达水平的流式细胞结果，B为CD20特异荧光强度(SFI)的统计结果)。

图6是本发明的CD20 scFv-CD8α-CD137-CD3ζ修饰T细胞与CD20阳性的Raji细胞系和CD20弱阳性的Namalwa细胞系按效靶比1:1、1:2、1:4、1:8共培养48小时后残留的B细胞淋巴瘤细胞图(CAR-T为CD20 scFv-CD8α-CD137-CD3ζ修饰T细胞的实验组；VEC-T为转染空载体T细胞的对照组)。

图7是本发明的CD20 scFv-CD8α-CD137-CD3ζ修饰T细胞对Raji和Namalwa细胞系按效靶比1:1杀伤作用4h的脱颗粒检测图(CAR-T为CD20 scFv-CD8α-CD137-CD3ζ修饰T细胞的实验组；VEC-T为转染空载体的T细胞的对照组)。

图8是本发明的CD20 scFv-CD8α-CD137-CD3ζ修饰T细胞与Raji和Namalwa细胞系按效靶比1:1共培养48小时后，T细胞释放的细胞因子IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-6水平图(A:FN-γ、B:IL-2、C:TNF-α、D:IL-6；CAR-T为CD20 scFv-CD8α-CD137-CD3ζ修饰T细胞的实验组；VEC-T为转染空载体的T细胞的对照组)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：

本发明CD20特异性嵌合抗原受体，该嵌合抗原受体由小鼠抗人CD20的单链抗体(single chain variable fragment,scFv)、CD8铰链区和跨膜区、CD28和/或CD137T细胞共刺激信号分子及CD3ζ的胞内信号结构串联构成；该嵌合抗原受体含有CD20特异性的单链抗体，其氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NO.3所示，该嵌合抗原受体的氨基末端含有一个信号肽，其氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NO.4所示，该嵌合抗原受体的轻链和重链之间由氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NO.6所示的连接肽连接而成。

优选，所述嵌合抗原受体以CD8α铰链区和跨膜区以及CD137和CD3ζ的胞内信号结构域串联而成的结构域为T细胞刺激信号传导结构，其氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NO.5所示。

所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。所述嵌合抗原受体的核酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

上述的CD20特异性嵌合抗原受体在抗B细胞淋巴瘤、B细胞淋巴细胞白血病药物中的应用。

该嵌合抗原受体中的T细胞的激活信号结构域除了可以是CD8α-CD137-CD3ζ，还可以是CD8α-CD28-CD3ζ和CD8α-CD28-CD137-CD3ζ。

本发明以既往制备的分泌抗CD20单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞系的Fab序列为基础，设计合成抗CD20-scFv序列。

实施例1：嵌合抗原受体CD20特异性单链抗体的构建

(一)PCR扩增CD20单克隆抗体V_L、V_H的基因片段：

P1：5’GCTAGCGACATCGAGCTCACTCAG3’

P2：5’AGAACCACCACCACCGGAGCCGCCGCCGCCAGAACCACCACCACCCCGTTTGATCTCCACCTTGG3’

P3：5’GGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGT TCTCAGGTGAAGCTGCAGCAGTC3’

P4：5’CCG GAATTCTGAGGAGACGGTGACCGTGA3’

配制V_L、V_H PCR反应体系(20μl)如下：2×Taq PCR Master Mix(TianGen公司):10μl；10μM P1/P2(V_L):1μl；10μM P2/P4(V_H):1μl；Fab plasmid:1μl；ddH₂O:补足至20μl。反应条件：94℃预变性5分钟；重复如下循环33次：94℃30秒，52℃30秒，72℃1分钟；最后，72℃延伸10分钟。琼脂糖凝胶电泳分离并回收V_L、V_H片段。将回收后的V_L、V_H片段与pMD19-T(simple)载体(Takara公司)通过T4连接酶(Takara公司)进行连接，送检测序。保留测序正确克隆。连接反应体系及反应条件如下：V_L PCR产物/V_H PCR产物各50ng，pMD19-T(simple)载体1μl，Solution I连接反应液5μl；ddH₂O补足至10μl，16℃连接过夜。连接产物转化入E.coli DH5α感受态细菌中，37℃过夜培养后，挑取单个菌落，扩大培养后，用质粒提取试剂盒(Takara公司)提取阳性克隆质粒，经酶切和测序检测，将正确的质粒名称分别命名为L和H。

(二)构建V_L-linker-V_H方向anti-CD20 scFv片段

配制第二步重叠延伸PCR反应体系(25μl):2×Taq PCR Master Mix(TianGen公司)；10μM P1引物:1μl；10μM P4引物:1μl；V_L、V_H片段：各200ng；ddH₂O：补足至20μl。反应条件：94℃5分钟预变性；重复如下循环28次：94℃30秒，58℃1分钟，72℃1分钟30秒；然后，72℃延伸10分钟。琼脂糖凝胶电泳分离并回收CD20 scFv片段(如图1)。将回收后的scFv片段与pMD19-T(simple)载体(Takara公司)通过T4连接酶(Takara公司)进行连接，连接反应体系及反应条件如下：CD20 scFv PCR产物50ng，pMD19-T(simple)载体1μl，Solution I连接反应液5μl；ddH₂O补足至10μl，16℃连接过夜。连接产物转化入E.coli DH5α感受态细菌中，37℃过夜培养后，挑取单个菌落，扩大培养后，用质粒提取试剂盒(Takara公司)提取阳性克隆质粒，经酶切和测序检测，将正确的质粒名称命名为CD20 scFv。得到的CD20 scFv的蛋白序列为SEQ ID NO.3，其中V_L和V_H的连接序列为SEQ ID NO.6。

(三)构建CD20 scFv-CD8α-CD137-CD3ζ目的载体：1.采用Nhe I、EcoR I核酸内切酶酶切前期构建的含有CD8α-CD137-CD3ζ片段的质粒(质粒中包含信号肽序列SEQ ID NO.4，跨膜结构域和T细胞激活结构域SEQ ID NO.5)，获得CD8α-CD137-CD3ζ片段。2.设计两端分别带有NheI、EcoRI酶切位点的引物，扩增CD20 scFv片段。3.将CD20 scFv片段与目的载体进行连接，将构建的CD20 scFv-CD8α-CD137-CD3ζ目的载体用NheI和EcoRI进行酶切鉴定(如图2酶切结果表明阳性克隆含有目的条带，且测序鉴定正确)。得到的CD20 scFv-CD8α-CD137-CD3ζDNA序列为SEQ ID NO.2，经翻译后的蛋白序列为SEQ ID NO.1，

实施例2：嵌合抗原受体CD20 scFv-CD8α-CD137-CD3ζ慢病毒修饰T细胞的制备

(一)采用EndoFree Plasmid Maxi质粒抽提试剂盒(QIAGEN公司)提取CD20 scFv-CD8α-CD137-CD3ζ转移质粒和包装质粒psPAX2、PMD.2G。三种质粒用4：3：1比例用Turbofect转染试剂(Thermo公司)进行转染(具体方法见Turbofect转染试剂说明书)。转染后24小时、48小时分别收取病毒上清，于4℃，3000rpm，离心10分钟，经0.45μm滤器过滤后，采用50000g，4℃，3小时超速离心后浓缩10倍，后转入-80℃保存。

(二)T细胞的制备：取新鲜健康人外周血10ml，采用RosetteSep T cell enrichment Cocktail(Stemcell公司)和Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare公司)提取T细胞(具体步骤按照RosetteSep T cell enrichment Cocktail说明书)。按细胞：磁珠＝1：1比例加入抗CD3/CD28磁珠(Gibco公司)，培养24小时即为转染前的T细胞。

(三)慢病毒感染T细胞及感染后T细胞的培养：从-80℃中取出病毒上清，室温下融化，按每1×10⁶T细胞加入100μl病毒上清，加入Polybrene至终浓度为8μg/ml。32℃，1800rpm，离心1.5h，转入5％CO₂，37℃孵箱培养。

(四)流式细胞术检测CAR修饰T细胞膜表面CAR的表达：使用Alexa Fluor 647标记的山羊抗小鼠IgG(Fab’)₂抗体(Jackson ImmunoResearch公司)染色，冰上孵育30分钟后，进行流式细胞术分析T细胞表面CAR的表达效率为50-60％(见图4)。

实施例3：嵌合抗原受体CD20 scFv-CD8α-CD137-CD3ζ慢病毒修饰T细胞对B细胞淋巴瘤细胞的杀伤作用。

(一)B细胞淋巴瘤细胞系中CD20表达水平：Raji、Namalwa细胞系均购自美国ATCC。分别培养后，各吸取5×10⁵细胞悬液，PBS洗2次后，标记APC抗人CD20单抗(Biolegend公司)，以标记APC-isotype为对照组，冰上孵育30分钟。运用流式细胞术检测各种细胞系的CD20表达的水平。Raji和Namalwa细胞系表达CD20的百分率分别为100％和0.21％(图5A)；特异荧光强度(specific fluorescence intensity,SFI)分别为33.4和0.744(图5B)。

(二)CAR修饰的T细胞与Raji、Namalwa细胞系共培养后流式细胞术检测残留的淋巴瘤细胞：将细胞按1×10⁵细胞/孔接种24孔培养板，分别加入1×10⁵(1:1)、5×10⁴(1:2)、2.5×10⁴(1:4)、1.25×10⁴(1:8)、CAR修饰的T细胞，转染空载体的T细胞(VEC-T)设为对照组。将共培养后的细胞标记APC抗人CD20单抗(Biolegend公司)，流式细胞术检测残留细胞。结果显示在CAR-T与Raji以效靶比1:1、1:2、1:4和1:8共培养48小时，共培养体系中表型为CD3^-的Raji细胞分别剩余30％、57％、85％和91％，在VEC-T与Raji共培养48小时，存在CD3^-的Raji细胞为86％、95％、102％、99％；而CAR-T与Namalwa以效靶比共培养48小时，共培养体系中表型为CD3^-的Namalwa细胞分别存在101％、127％、121％和118％，在VEC-T与Namalwa共培养48小时，存在CD3^-的Namalwa细胞为136％、141％、123％、111％(见图6)。

(三)脱颗粒实验分析CAR修饰的T细胞的激活：

将CAR-T及VEC-T细胞分别与Raji和Namalwa细胞按照效靶比1:1进行共培养，并在共培养体系中加入anti-CD107a抗体和monensin；4h后应用流式细胞仪检测CD3⁺细胞表面CD107a的表达水平。CAR-T与Raji共培养体系中，CD3⁺细胞激活百分率为14％、VEC-T与Raji共培养体系中，CD3⁺细胞激活百分率为0.4％,，两者具有显著性差异(P＝0.007)。CAR-T与Namalwa共培养体系中，CD3⁺细胞激活百分率为3％、VEC-T与Namalwa共培养体系中，CD3⁺细胞激活百分率为3％，两者没有差异(见图7)。

(四)ELISA检测淋巴瘤细胞系与CAR-T细胞共培养上清中细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-2以及IL-6的水平：

分别将Raji和Namalwa细胞系按照6.3×10⁵细胞/孔接种24孔板。按每孔6.3×10⁵细胞分别加入CAR-T、VEC-T细胞，补充培养液至1.5mL，在孵箱中共培养12小时后。采用人IFN-γ、TNFα、IL-2和IL-6ELISA检测试剂盒(R&D公司)，对共培养上清进行检测(具体步骤见ELISA检测试剂盒说明书)。表达CD20的Raji在与CAR-T共培养上清中IFN-γ、IL-2、TNF-α和IL-6细胞因子水平均较VEC-T组有显著性升高(P<0.001)，但在不表达CD20的Namalwa细胞的共培养上清中的IFN-γ、IL-2、TNF-α和IL-6细胞因子水平没有显著性的升高。(图8)结果表明，嵌合抗原受体CD20 scFv-CD8α-CD137-CD3ζ修饰的T细胞在表达CD20的淋巴瘤细胞系刺激下，能够分泌Th1类细胞因子。

综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。