一种定性检测car?t产物中vsvg序列污染的方法

一种定性检测car?t产物中vsvg序列污染的方法
【专利摘要】本发明涉及一种应用在细胞免疫CAR?T治疗的中的质量控制方法，具体涉及一种定性检测CAR?T产物中VSVG序列污染的方法。本发明针对慢病毒生产现有技术的不足，根据CAR?T生产的实际需要，设计了HIV中VSVG基因序列的Real?Time PCR引物。使用此引物对CAR?T产物进行Real?Time PCR分析，能够有效监测CAR?T中VSVG基因序列存在与否，为CAR?T免疫细胞治疗技术应用的安全性提供了保障。
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及一种应用在细胞免疫CAR-T治疗的中的质量控制方法，具体涉及一种 定性检测CAR-T产物中VSVG序列污染的方法。 一种定性检测CAR-T产物中VSVG序列污染的方法
【背景技术】
[0002] CAR-T，全称是Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，嵌合抗原受 体T细胞免疫疗法。这是一个出现了很多年，但是近几年才被改良使用到临床上的新型细胞 疗法。在急性白血病和非霍奇金淋巴瘤的治疗上有着显著的疗效，被认为是最有前景的肿 瘤治疗方式之一。正如所有的技术一样，CAR-T技术也经历一个漫长的演化过程，正是在这 一系列的演化过程中，CAR-T技术逐渐走向成熟。
[0003] CAR-T治疗是一种专一性的靶向治疗，因为它是按照经由抗体，针对抗原的结合， 或者是特殊结合的一个靶点，它有专一性的，所以CAR-T的治疗效果有专一性的一个特殊的 靶向。相比较而言，传统的细胞免疫治疗方面CIK还有NK多半都是属于不是靶向特异的，属 于比较普遍性的免疫治疗方案。所以说相对的讲起来，CAR-T的效果是比较明确的，比起 CIK、NK，是更直接的一种手段。
[0004] 然而，因为制备过程中需要使用到慢病毒感染T细胞，而生成CAR-T，因此对质量控 制有着更高的要求。虽然慢病毒包装的进展已经历经数代，安全性有了极大的提高，但因其 来源为HIV，所以严格的质检必不可少。
[0005] 姜丽翠等在《嵌合体抗原受体修饰的T细胞对CD19~+套式淋巴瘤细胞的杀伤》一 文中发现经CD 19嵌合抗原受体修饰的T细胞可特异性识别CD 19分子，对CD 19阳性的套式淋 巴肿瘤细胞的杀伤效率显著高于未被基因修饰的T细胞，显示出CD19-CAR-T在套式淋巴细 胞肿瘤免疫治疗的巨大潜力。

【发明内容】

[0006] 因 CAR-T生产时需要使用HIV来源的重组型无致病性病毒一一慢病毒，所以需要在 注射到患者体内之前，对CAR-T中的HIV进行检测，以保证CAR-T使用的安全性。本发明针对 慢病毒生产现有技术的不足，根据CAR-T生产的实际需要，设计了 HIV中VSVG基因序列的 Real-Time PCR引物。使用此引物进行Real-Time PCR分析，能够有效监测CAR-T中VSVG的存 在与否，为CAR-T免疫细胞治疗技术应用的安全性提供了保障。
[0007] 本发明通过下述技术方案实现上述技术目的：
[0008] 本发明提供一种定性检测CAR-T产物中VSVG序列污染的方法，其具体包括如下步 骤：
[0009] (I)Real-Time PCR设计及选择:使用Primer Premier 5软件针对VSVG基因序列设 计一组Real-Time PCR引物和探针;并使用慢病毒包装系统中的pMD2.G质粒对引物和探针 进行效率和特异性评估，选取荧光效果较好的一组Real-Time PCR引物和探针进行后续检 测；
[0010] (2)标准曲线样品的制作:使用pMD2.G质粒作为标准品母液，提取感染前的淋巴细 胞DNA稀释pMD2 · G质粒，分别制成拷贝数1 · 600E+08，1 · 600E+07，1 · 600E+06，1 · 600E+05， 1.600E+04，1.600E+03，1.600E+02的一组标准品溶液；向反应管内加入荧光剂，使用选取的 Real-Time PCR引物对CAR-T产物和阴性对照进行Real-Time PCR，确定各反应管荧光信号 到达设定阈值所经历的循环数Ct;
[0011] (3)CAR-T产物基因组提取及Real-Time PCR:选取CAR-T产物作为待测样品，提取 基因组DNA，并进行DNA浓度和纯度分析，同时，提取原始T细胞的基因组DNA，定量至90ngAiL 作为阴性对照；向反应管内加入荧光剂，使用选取的Real-Time PCR引物对CAR-T产物和阴 性对照进行Real-Time PCR，确定各反应管荧光信号到达设定阈值所经历的循环数Ct;
[0012] ⑷定性判定CAR-T产物是否存在VSVG污染：比较待测样品的Ct值，各标准曲线的 Ct值以及阴性对照的Ct值，若待测样品与阴性对照的扩增曲线一致，且Ct值大于阳性对照 时，认为该样品中无 VSVG污染存在;若待测样品与阴性对照的扩增曲线存在明显差异，且待 测样品Ct值小于阴性对照认为该样品中VSVG存在污染。
[0013] 所述的VSVG基因序列为序列4，其核苷酸编码为：
[0014] GCAAGGAAAGCATTGAACAAACGAAACAAGGAACTTGGCTGAATCCAGGCTTCCCTCCTCAAAGTTGTGGATATGCA ACTGTGACGGATGCCGAAGCAGTGATTGTCCAGGTGACTCCTCo
[0015] 上述所述的定性检测方法中，所选取的VSVG_F引物为序列1，其核苷酸序列为 GCAAGGAAAGCATTGAACAA，VSVG_R 引物为序列 2，其核苷酸序列为 GAGGAGTCACCTGGACAATCACT， VSVG_Probe 探针为序列 3，其核苷酸编码为:AGGAACTTGGCTGAATCCAGGCTTCC。
[0016] 上述所述的定性检测方法中，所述的pMD2.G质粒包括VSVG基因序列。
[0017] 上述所述的定性检测方法中，所述的基因组DNA通过使用基因组DNA提取试剂盒进 行提取。所提取得到的基因组DNA浓度为44.3ng/yL，纯度260/280在1.80-1.90之间。
[0018] 上述所述的定性检测方法中，所述的焚光剂为2 X SuperReal PreMix。
[0019] 上述所述的定性检测方法中，所述的Real-Time PCR反应中的反应体系包括 Template2yL，10yM的Primer Mix 1.5yL，2XSuperReal PreMix 12.5yL，探针0.5ul，ddH2〇 8.5yL。所述的Real-Time PCR反应中的反应程序为:第一阶段，95°C，900s，I个循环;第二阶 段:依次为94°C，60s; 70 °C，30s; 72，60s;共进行40个循环。
[0020] 本发明还请求保护一种应用于细胞免疫CAR-T治疗的质量控制方法，其包括权利 要求1-7任一所述的定性检测CAR-T产物中VSVG序列污染的方法。
[0021] 本发明与现有技术相比所取得的优异的技术效果在于：
[0022] 1)针对新一代免疫治疗技术CAR-T生产过程可能出现的野生型病毒问题，设计了 高效率、高特异性的Real Time PCR反应引物，很好实现了质检目的，填补了技术空白。 [0023] 2)本发明所述的定性检测CAR-T产物中VSVG序列污染的方法操作简便，结果直观 快速，具有很好的临床应用前景。
【附图说明】
[0024]图1采用本发明定性检测CAR-T产物中VSVG序列污染的方法的曲线图。
【具体实施方式】
[0025] 以下通过具体实施例进一步描述本发明的技术方案，但本领域技术人员应能知 晓，所述的实施例并不以任何方式限定本发明的保护范围。
[0026] 实施例一种定性检测CAR-T产物中VSVG序列污染的方法
[0027] 1.仪器设备
[0028] 超净工作台、Real-Time PCR仪、台式离心机、旋祸混悬器、Nanodrop超微量分光光 度计等。
[0029] 2.试剂
[0030] 基因组DNA提取试剂盒(Axygen)，PAGE纯化的PCR引物(GeneScript)，阳性对照 pMD2 · G质粒(含VSVG基因），2 X SuperReaI PreMiX(天根）等。
[0031] 3.检验操作
[0032] (1)模板的制作:在无菌环境中选取CAR-T最终产物作为待测样品，使用Axygen生 产的基因组DNA提取试剂盒，提取基因组DNA。提取后使用Nanodrop仪器进行DNA浓度和纯度 分析。经测定，所述的基因组DNA浓度为44.3ng/yL.纯度260/280在1.80-1.90之间。
[0033] (2)Real_Time PCR反应：
[0034] Real-Time PCR反应的VSVG_F引物为GCAAGGAAAGCATTGAACAA，VSVG_R引物为 GAGGAGTCACCTGGACAATCACT，VSVG_Probe 探针：AGGAACTTGGCTGAATCCAGGCTTCC 〇
[0035] 表1Real-Time PCR反应体系（单位:yL)
[0037]表2Real-Time PCR反应程序
[0039] 4.检测方法
[0040] l)Real-Time PCR设计及选择:使用Primer Premier 5软件针对VSVG基因序列设 计一组Real-Time PCR引物和探针;并使用慢病毒包装系统中的pMD2.G质粒对引物和探针 进行效率和特异性评估，选取荧光效果较好的一组Real-Time PCR引物和探针进行后续检 测；
[0041] (2)标准曲线样品的制作:使用pMD2.G质粒作为标准品母液，提取感染前的淋巴细 胞DNA稀释pMD2 · G质粒，分别制成拷贝数1 · 600E+08，1 · 600E+07，1 · 600E+06，1 · 600E+05， 1.600E+04，1.600E+03，1.600E+02的一组标准品溶液；向反应管内加入荧光剂，使用选取的 Real-Time PCR引物对CAR-T产物和阴性对照进行Real-Time PCR，确定各反应管荧光信号 到达设定阈值所经历的循环数Ct;
[0042] (3)CAR-T产物基因组提取及Real-Time PCR:选取CAR-T产物作为待测样品，提取 基因组DNA，并进行DNA浓度和纯度分析，同时，提取原始T细胞的基因组DNA，定量至90ngAiL 作为阴性对照；向反应管内加入荧光剂，使用选取的Real-Time PCR引物对CAR-T产物和阴 性对照进行Real-Time PCR，确定各反应管荧光信号到达设定阈值所经历的循环数Ct;
[0043] (4)定性判定CAR-T产物是否存在VSVG污染：比较待测样品的Ct值，各标准曲线的 Ct值以及阴性对照的Ct值，若待测样品与阴性对照的扩增曲线一致，且Ct值大于阳性对照 时，认为该样品中无 VSVG污染存在;若待测样品与阴性对照的扩增曲线存在明显差异，且待 测样品Ct值小于阴性对照认为该样品中VSVG存在污染。
[0044]根据上述实验方法，检测待测样品的是否存VSVG污染。图1为采用本发明定性检测 CAR-T产物中VSVG序列污染的方法的曲线图。具体实验结果如表3所示:结果显示，D09所对 应的CAR-T产物没有VSVG污染。
[0045] 表3CAR-T产物是否污染VSVG实验结果
【主权项】
1. 一种定性检测CAR-T产物中VSVG序列污染的方法，其具体包括如下步骤： (1) Real-Time PCR设计及选择:使用Primer Premier 5软件针对VSVG基因序列设ir| 组Real-Time PCR引物和探针;并使用慢病毒包装系统中的pMD2.G质粒对引物和探针进行 效率和特异性评估，选取荧光效果较好的一组Real-Time PCR引物和探针进行后续检测； (2) 标准曲线样品的制作：使用pMD2.G质粒作为标准品母液，提取感染前的淋巴细胞 DNA稀释pMD2 · G质粒，分别制成拷贝数1 · 600E+08，1 · 600E+07，1 · 600E+06，1 · 600E+05， 1.600E+04，1.600E+03，1.600E+02的一组标准品溶液；向反应管内加入荧光剂，使用选取的 Real-Time PCR引物对CAR-T产物和阴性对照进行Real-Time PCR，确定各反应管荧光信号 到达设定阈值所经历的循环数Ct; (3) CAR-T产物基因组提取及Real-Time PCR:选取CAR-T产物作为待测样品，提取基因 组DNA，并进行DNA浓度和纯度分析，同时，提取原始T细胞的基因组DNA，定量至90ngAiL作为 阴性对照；向反应管内加入荧光剂，使用选取的Real-Time PCR引物对CAR-T产物和阴性对 照进行Real-Time PCR，确定各反应管荧光信号到达设定阈值所经历的循环数Ct; (4) 定性判定CAR-T产物是否存在VSVG污染：比较待测样品的Ct值，各标准曲线的Ct值 以及阴性对照的Ct值，若待测样品与阴性对照的扩增曲线一致，且Ct值大于阳性对照时，认 为该样品中无 VSVG污染存在;若待测样品与阴性对照的扩增曲线存在明显差异，且待测样 品Ct值小于阴性对照认为该样品中VSVG存在污染。2. 根据权利要求1所述的定性检测CAR-T产物中VSVG序列污染的方法，其特征在于，所 选取的VSVG_F引物如序列1所示，VSVG_R引物为如序列2所示，VSVG_Probe探针如序列3所 不。3. 根据权利要求1所述的定性检测CAR-T产物中VSVG序列污染的方法，其特征在于，所 述的pMD2 .G质粒包括VSVG基因序列。4. 根据权利要求1所述的定性检测CAR-T产物中VSVG序列污染的方法，其特征在于，所 述的基因组DNA通过使用基因组DNA提取试剂盒进行提取，所提取得到的基因组DNA浓度为 44 · 3ng/yL，纯度 260/280在 1 · 80-1 · 90之间。5. 根据权利要求1所述的定性检测CAR-T产物中VSVG序列污染的方法，其特征在于，所 述的焚光剂为2XSuperReal PreMix〇6. 根据权利要求1所述的定性检测CAR-T产物中VSVG序列污染的方法，其特征在于，所 述的Real-Time PCR反应中的反应体系包括Template 2μL，10μΜ的Primer Mix 1.5yL，2 X SuperReal PreMix 12.5yL，探针0.5ul，ddH2〇 8.5yL〇7. 根据权利要求1所述的定性检测CAR-T产物中VSVG序列污染的方法，其特征在于，所 述的Real-Time PCR反应中的反应程序为:第一阶段，95°C，900s，1个循环;第二阶段:依次 为94°C，60s; 70 °C，30s; 72，60s;共进行40个循环。8. -种应用于细胞免疫CAR-T治疗的质量控制方法，其特征在于，其包括权利要求1-7 所述的任一所述的定性检测CAR-T产物中VSVG序列污染的方法。
【文档编号】C12Q1/70GK106086235SQ201610457173
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月22日
【发明人】孙秀莲, 李欣, 徐鸿
【申请人】宜明细胞生物科技有限公司