一种与IgA肾病辅助诊断相关的血浆miRNA标志物及其应用

一种与IgA肾病辅助诊断相关的血浆miRNA标志物及其应用
【专利摘要】本发明公开一种与IgA肾病辅助诊断相关的血浆miRNA标志物及其应用，该标志物为miR?148a?3p,miR?150?5p,miR?20a?5p和miR?425?3p中的一种或多种。血浆miRNA作为新型的生物标志物，具有稳定性好、微创易获取、灵敏性和特异性高的特点。这类分子标志物的开发利用将为包括IgA肾病在内的各种疾病的诊断以及进一步治疗提供新的方向。本研究将更有针对性的得出具有临床诊断潜能的IgA肾病血浆miRNA标记物。研究证实了这组miRNA作为诊断IgA肾病的无创标记物的可靠性以及可重复性。
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程肾脏病学领域，涉及一种与IgA肾病辅助诊断相关的血浆 miRNA标志物及其应用。 一种与I gA肾病辅助诊断相关的血浆m i RNA标志物及其应用
【背景技术】
[0002] IgA肾病（Immunoglobulin A nephropathy, IgAN)是最常见的原发性肾小球肾炎， 特点是肾小球系膜细胞增生，基质增多，伴广泛IgA沉积。目前IgA肾病须经肾活检证实方可 诊断。但是肾活检是一种侵入性的检查方法，不能在同一病人身上反复进行。IgA肾病早期 诊断预后良好，但病程超过20年，会有40%以上的患者进入不可逆的终末期肾衰。因此，非 侵入性的生物标志物的发现对临床上早期诊断IgA肾病具有重大意义。
[0003] 微小RNA(miRNAs)是一类长度在22个左右的核苷酸的小非编码RNA分子，其通过转 录后调控广泛参与了各种生命活动过程。研究发现，miRNA的表达在IgA肾病中有不同程度 的上调和下调，而且miRNA易获取，存在形式相对稳定，并能够抵抗体内核酸酶的溶解作用， 为其能够作为一种新兴的标志物奠定了基础。但由于研究方法及纳入人群的差异，导致研 究结果不完全一致。目前也没有一致的适合临床上miRNA检测的方法。
[0004] 本研究利用Exiqon miRNA qPCR panel芯片以及基于qRT-PCR的相对定量法，通过 对大样本的IgA肾病血浆的研究，旨在寻找对IgA肾病具有潜在诊断价值的血浆miRNA。若根 据这类miRNA设计针对于IgA肾病的诊断试剂盒，将会推动我国IgA肾病的诊治水平，也为将 来对IgA肾病的进一步研究提供思路。

【发明内容】

[0005] 本发明的目的在于提供一种与IgA肾病辅助诊断相关的血衆miRNA标志物。
[0006] 本发明的另一目的在于提供上述血浆miRNA标志物及其引物在制备IgA肾病辅助 诊断试剂盒以及在制备治疗IgA肾病的药物中的应用。
[0007] 本发明的又一目的在于提供用于IgA肾病辅助诊断和治疗的试剂盒及药物。
[0008] 本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
[0009] 一种与I gA肾病辅助诊断相关的血浆mi RNA标志物，该血浆mi RNA标志物为mi Κι 48a-3p (UCAGUGCACUACAGAACUUUGU) ， mi R-150-5p (UCUCCCAACCCUUGUACCAGUG) ， mi R-20a-5p (UAAAGUGCUUAUAGUGCAGGUAG)和 miR-425-3p (AUCGGGAAUGUCGUGUCCGCCC)中的一种或多种。 该血衆 miRNA 标志物优选为 miR-148a-3p，miR-150-5p，miR-20a-5p 和 miR-425-3p 中两种或 两种以上的组合，进一步优选为miR-148a_3p，miR-150_5p，miR-20a_5p和miR-425_3p四种 miRNA所组成的组合。
[0010] 上述的血浆miRNA标志物在辅助诊断IgA肾病中的应用。
[0011] 上述的血衆miRNA标志物在制备IgA肾病辅助诊断试剂盒或治疗IgA肾病药物中的 应用。
[0012] -种与IgA肾病辅助诊断相关的血衆miRNA标志物的引物，该引物包含miR-148a- 3p，miR-150-5p，miR-20a-5p和miR-425-3p中的一种或多种miRNA的引物;优选为包含血浆 miRNA 中 miR-148a-3p，miR-150-5p，miR-20a-5p 和 miR-425-3p 中两种或两种以上 miRNA 的弓丨 物；进一步优选为包含血衆 miR-148a-3p，miR-150-5p，miR-20a-5p 和 miR-425-3p 四种 miRNA 的引物。
[0013]上述的引物在辅助诊断IgA肾病或制备IgA肾病辅助诊断试剂盒中的应用。
[0014] -种IgA肾病辅助诊断试剂盒，该试剂盒用于检测血衆miR-148a-3p，miR-150-5p, miR-20a_5p和miR-425_3p中的一种或多种miRNA;优选为用于检测血楽_111丨1?-148&-3。，11111?- 150-5p，miR-20a-5p和miR-425-3p中两种或两种以上miRNA;进一步优选为用于检测血浆 miRNA 中的 miR-148a-3p，miR-150-5p，miR-20a-5p 和 miR-425-3p 四种 miRNA。
[0015] -种IgA肾病辅助诊断试剂盒，该试剂盒中含有血衆miRNA中miR-148a-3p，miR-150-5p，miR-20a-5p和miR-425-3p中的一种或多种miRNA的引物;优选为含有血衆miRNA中 miR-148a-3p，miR-150-5p，miR-20a-5p和 miR-425-3p 中两种或两种以上 miRNA的引物；进一 步优选为含有血衆 miRNA 中 miR-148a-3p，miR-150-5p，miR-20a-5p 和 miR-425-3p 四种 miRNA 的引物。
[0016] 该试剂盒还可以包括PCR技术常用试剂，如逆转录酶，缓冲液，dNTPs ,MgCl2，DEPC 水和Taq酶等;还可以含有标准品和/或对照品。
[0017] 本发明所涉及的与IgA肾病诊断相关的血衆miRNA标志物miR-148a-3p，miR-150-5p，miR-20a_5p和miR-425_3p中的每种miRNA的序列均已公开，但是将各miRNA标志物单独 进行组合作为IgA肾病辅助诊断标志物需要本领域技术人员付出创造性劳动。各miRNA标志 物的扩增引物均可通过市场购买获得，本发明实施例中使用的血衆miRNA标志物的引物为 购自广州锐博公司所合成生产的特异性miRNA茎环RT-PCR引物。
[0018] 具体地说，本发明解决问题的技术方案包括：（1)建立统一标准的标本库和数据 库：以标准操作程序(S0P)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料和临床资 料。（2)血衆miRNA差异表达谱分析:分析IgA肾病和正常对照人群中差异表达的血衆miRNA， 并对差异表达miRNAs进行进一步大样本多阶段验证。（3)通过多阶段的验证，明确这些 miRNA诊断IgA肾病的能力。（4)血楽;miRNA诊断试剂盒的研制:根据IgA肾病患者与正常人群 血衆中的差异表达miRNA开发miRNAs诊断试剂盒，实现对IgA肾病患者的无创辅助诊断。（4) 分析这些miRNA在IgA肾病患者血浆中的表达情况，揭示这些miRNA与IgA肾病的关系，为将 来研制可能与这些miRNA相关的治疗IgA肾病的药物提供依据。
[0019] 本发明人以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口 学资料、临床资料，并采用了Exiqon miRNA qPCR panel芯片以及qRT-PCR方法等。
[0020] 具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：
[0021] 1.研究样本选择:经病理确认为IgA肾病的患者。正常对照为在医院进行体检的正 常人群。
[0022] 2.Exiqon miRNA qPCR panel芯片初筛：利用TRIZ0L-LS试剂对血浆混合样本进行 RNA提取，并进行qRT-PCR操作获得初筛结果。
[0023] 3.训练集、验证集:利用AMl556试剂盒(ABI公司）对每个血浆样本进行RNA提取，通 过逆转录反应得到cDNA样品，加入PCR引物和SYBR Green荧光染料进行PCR反应。通过比对 标准品的Ct值，得出样本中的miRNA含量。
[0024] 4.统计分析:运用X2检验、配对t检验以及非参数秩和检验比较miRNA表达水平在 不同研究组中的差异。通过计算ROC曲线分析证实血衆miRNA的诊断价值。
[0025]本发明研究组目前通过对IgA肾病病人的外周血浆中的miRNA进行系统的表达分 析，现已发现了一组4个具有临床诊断潜能的IgA肾病血衆microRNA标记物(miR-148a-3p, miR-150_5p，miR-20a_5p和miR-425_3p)。
[0026]本发明的有益效果：
[0027] 1.相较于传统的IgAN的标志物，血浆miRNA作为新型的生物标志物，具有稳定性 好、微创易获取、灵敏性和特异性高的特点。这类分子标志物的开发利用将为包括IgAN在内 的各种疾病的诊断以及进一步治疗提供新的方向。
[0028] 2.研究者通过Exiqon miRNA qPCR panel芯片以及基于qRT-PCR的相对定量法，对 IgAN和正常对照人群血浆中的差异表达miRNA进行严密、多阶段的验证和评价。证实了这组 miRNA作为诊断IgA肾病的无创标记物的可靠性以及可重复性。
[0029] 3.研究者发现 miR-148a-3p，miR-150-5p，miR-20a-5p 和 miR-425-3p在 I 级 IgA 肾病 (根据Lee分级）患者中的表达明显高于II-V级的IgA肾病患者。显示了这组miRNA对早期IgA 肾病诊断价值更高。这些结果将给未来研究这些miRNA对于IgA肾病的机制以及针对这些 miRNA对于IgA肾病的治疗提供新的思路。
【附图说明】
[0030] 图1:实验流程图。
[0031] 图2:在IgA肾病血浆中高表达的4个miRNA。
[0032] 图3:对所获得的miRNA进行ROC曲线分析。
[0033] a:训练集;b:验证集;c:训练集与验证集的合集。
[0034] 图4:对4个miRNA在不同Lee分级的IgA肾病进行ROC曲线分析。
[0035] a: IgAN I级;b: IgAN II级；c: IgAN III级；d: IgAN IV-V级。
【具体实施方式】
[0036]发明人于2013年至2015年从南京医科大学第一附属医院收集了大量的IgA肾病患 者和正常体检人群的静脉血浆样品，通过对样品资料的整理，从中最终选择了83例IgA肾病 和82例正常对照的样本作为Exiqon miRNA qPCR panel芯片初筛和后续一系列qRT-PCR验 证的实验样品。所选择的患者血浆样本均经病理确认为IgA肾病的患者。并系统采集了这些 样本的人口学资料、临床资料。
[0037]参照流程图（图1)，从IgA肾病以及正常对照血浆样本中随机选择了20例IgA肾病 样本以及10例正常对照，并且分别混合成了 2例IgA肾病血浆混合样本和1个正常混合样本 (一个混合样本由10例200ul血浆样本汇合形成2ml的样本）。对这3例混合样本进行Exiqon miRNA qPCR panel芯片初筛和分析，具体步骤参照Exiqon miRNA qPCR panel芯片的说明 书：
[0038] 1.血浆抽提
[0039] 取出血浆样品，样品化冻后3000x g离心5min去除一些碎片及一些不溶成分。转移 250ul上清至新的1.5ml管中，加入750ul TRIZ0L-LS后，剧烈震荡5s。
[0040] 2.两相分离
[00411 匀浆后样品于15到30°C孵育5分钟。每1ml的TRIZ0L-LS试剂匀浆的样品中加入 0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30°C孵育2到3分钟。4°C下13,000g 离心15分钟。
[0042] 3 .RNA 沉淀
[0043] 将水相转移到新离心管中。水相与异丙醇混合以沉淀其中的RNA，加入异丙醇的量 为：Iml TRIZ0L-LS试剂匀浆的样品中加0.5ml的异丙醇和5ul的糖元。4°C静置半小时，让 RNA尽可能的析出。于4 °C 13，OOOg离心15分钟。
[0044] 4. RNA 清洗
[0045] 移去上清液，每1ml TRIZ0L-LS试剂匀浆的样品中加入至少Iml的75% (v/v)乙醇， 清洗RNA沉淀。静置10分钟，然后4°C下1000 Og离心5分钟。
[0046] 5.重新溶解RNA沉淀
[0047]去除乙醇溶液，空气中干燥RNA沉淀5-10分钟，加入无 RNA酶的水用枪反复吹打几 次，然后55到60°C孵育10分钟。
[0048] 6.测量浓度：
[0049] 通常能得到~5yg RNA/50ml血浆。
[0050] 7.cDNA 合成
[0051 ] (1)稀释模板RNA:使用DEPC水将20 - 25ng模板RNA稀释至Hul (终浓度为1.492 - 1.786ngAU)。
[0052] (2)准备反应液:将5 X Reaction Buffer以及DEPC水置于冰上溶解，并震荡混匀。 Enzyme mix置于-20°C冰盒，使用前轻弹混匀后置于冰上。所有试剂均离心后使用。
[0053] (3)配置反应液:配置下表中的反应液
[0055] (4)混合并离心试剂:震荡或者抽吸混匀反应液后离心，以保证所有溶液彻底混合 均匀。
[0056] (5)逆转录反应及热失活:将反应液于42°C温育60分钟后，于95°C温育5分钟以失 活逆转录酶。
[0057] 8.ReaI-Time PCR
[0058]试剂：
[0059] Nuclease free water(Exiqon)
[0060] SYBR? Green master mix(Exiqon)
[0061 ] cDNA 模板
[0062] ROX(Invitrogen)
[0063] miRNA PCR ARRAY(Exiqon)
[0064] 仪器：
[0065] ABI PRISM7900system(Applied Biosystems)
[0066] (I)准备Real-time PCR试剂：将制备的cDNA模板，DEPC水和SYBR? Green master mix置于冰上溶解15-20分钟。
[0067] (2)稀释cDNA模板:将RT反应获得的cDNA模板用nuclease free water稀释110倍 (例如，向反应液中加入2l8〇ul nuclease free water)。
[0068] (3)混合所有反应试剂：
[0069] A.将PCR板简单离心后，移去封膜。
[0070] B.将110倍稀释的cDNA模板与2 X SYBR Green master mix按照1:1体积比混合。
[0071 ] C.倒置混匀反应液并离心
[0072] D.将混合反应液加入板中的每个孔
[0073] E.重新封好PCR板
[0074] (4)将PCR板简单低温离心
[0075] (5)Real_time PCR扩增:根据下表中的反应条件进行Real-time PCR扩增和溶解 曲线分析。
[0076] Real-time PCR循环条件如下表：
[0078]数据分析:采用Δ Δ Ct方法
[0079] 使用PCR仪器附带的软件进行初步数据分析，获得原始的Cq值(Cp或Ct，依仪器不 同名称可能不同）。
[0080] 我们建议使用GenEx qPCR分析软件(www.exiqon.com/mirna-pcr-analysis)对数 据进行标准和深入的数据分析。
[0081] a.计算每个处理组中的每个通路相关基因的ACt。
[0082] Δ Ct(group I)=average Ct-average of HK genes'Ct for group larray
[0083] Δ Ct(group 2)=average Ct-average of HK genes'Ct for group 2array
[0084] b.计算2个PCR Array(或两组）中每个基因的Δ Δ Ct。
[0085] Δ ACt= ACt(组2)-ACt(组I)
[0086] 备注:通常组1是对照，组2是实验组。
[0087] c.通过计算组2与组1对应基因的表达差异。
[0088]在芯片初筛后，得到了如下表中的48个差异表达miRNA(2个IgA肾病血浆混合样本 中相对于正常样本都超过了 1.5倍差异）。
[0091] 对于初筛得到的48个差异表达miRNA，通过训练集和验证集，采用基于qRT-PCR的 相对定量法进行验证，具体步骤为：
[0092] 1.血浆RNA提取:选用ABI公司血浆RNA提取试剂盒(AM1556)，参照试剂盒说明，每 个样本吸取200ul进行提取RNA，并最后用IOOul DEPC水进行溶解。
[0093] 2.CDNA的制备：
[0094] 1)采用50yL反应体系进行逆转录实验
[0103]反应体系混匀，瞬时离心后，放置于实时定量PCR仪中，以下列程序进行反应：
[0105] 反应结束后添加溶解曲线。
[0106] 数据分析:利用SPSS 16.0软件进行统计分析，得到了一组在训练集和验证集中均 一致于 IgA 肾病血衆中高表达的 4 个 miRNA:miR-148a_3p，miR-150_5p，miR-20a_5p 和 miR-425-3p(4个miRNA在IgAN患者中的表达明显高于正常对照组，P〈0.05,图2)。对所获得的 miRNA进行ROC曲线分析（在训练集、验证集和两者的合集中P值都小于0.05,图3)，这4个 miRNA组成的分子标志物能够很好的区分IgA肾病患者和正常人群。并且通过亚组分析，发 现这4个mi RNA在Lee分级I级的I gA肾病患者中的表达明显高于II-V级的I gA肾病患者（图 4)〇
[0107] 试剂盒包括一批血浆miRNA qRT-PCR引物，还可以有相应PCR技术所需的常用试 剂，如:逆转录酶，缓冲液，dNTPs，MgCl 2，DEPC水，荧光探针，RNA酶抑制剂，Taq酶等，可根据 具体采用的实验方法选用，这些常用试剂都是本领域技术人员熟知的，另外还可以有标准 品和对照（如定量标化的正常人样本等）。此试剂盒的价值在于只需要血浆而不需要其它组 织样品，通过最精简的荧光法检测血浆样本中miRNA的表达含量，来辅助诊断该样本来源患 者的罹患IgA肾病的可能性。血衆miRNA检测方便，且定量精确，大大提高疾病诊断的敏感性 和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以帮助指导诊断以及进一步的个体化治疗。
【主权项】
1. 一种与IgA肾病辅助诊断相关的血浆miRNA标志物，其特征在于该血浆miRNA标志物 为 miR-148a-3p，miR-150-5p，miR-20a-5p 和 miR-425-3p 中的一种或多种。2. 根据权利要求1所述的血浆mi RNA标志物，其特征在于该血浆mi RNA标志物为!^尺-148a-3p，miR-150-5p，miR-20a-5p 和 miR-425-3p 中两种或两种以上的组合，优选为11^1?-148a-3p，miR-150-5p，miR-20a-5p 和 miR-425-3p 四种 miRNA 所组成的组合。3. 权利要求1或2所述的血衆miRNA标志物在辅助诊断IgA肾病中的应用。4. 权利要求1或2所述的血衆miRNA标志物在制备IgA肾病辅助诊断试剂盒或治疗IgA肾 病药物中的应用。5. -种与IgA肾病辅助诊断相关的血浆miRNA标志物的引物，其特征在于该引物包含 miR-148a-3p，miR-150-5p，miR-20a-5p 和 miR-425-3p 中的一种或多种 miRNA的引物；优选为 包含血浆 miRNA 中 miR-148a-3p，miR-150-5p，miR-20a-5p 和 miR-425-3p 中两种或两种以上 miRNA的引物；进一步优选为包含血浆miRNA中miR-148a-3p，miR-150-5p，miR-20a-5p和 miR-425-3p 四种 miRNA的引物。6. 权利要求5所述的引物在辅助诊断IgA肾病或制备IgA肾病辅助诊断试剂盒中的应 用。7. -种IgA肾病辅助诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒用于检测血浆miR-148a-3p， 11^1?-150-5口，111丨1?-2(^-5口和111丨1?-425-3口中的一种或多种111丨1?熟 ;优选为用于检测血浆11^1?-148a-3p，miR-150-5p，miR-20a-5p 和 miR-425-3p 中两种或两种以上 miRNA;进一步优选为用 于检测血衆 miRNA 中的 miR-148a-3p，miR-150-5p，miR-20a-5p 和 miR-425-3p 四种 miRNA。8. -种IgA肾病辅助诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒中含有血浆miRNA *miR-148a-3p，miR-150-5p，miR-20a-5p和miR-425-3p中的一种或多种miRNA的引物;优选为含有血浆 miRNA 中 miR-148a-3p，miR-150-5p，miR-20a-5p 和 miR-425-3p 中两种或两种以上 miRNA 的弓丨 物;进一步优选为含有血衆 miRNA 中 miR-148a-3p，miR-150-5p，miR-20a-5p 和 miR-425-3p 四 种miRNA的引物。9. 根据权利要求7或8所述的诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒中还包括PCR技术常用 的试剂常用的试剂。
【文档编号】C12Q1/68GK106086226SQ201610726380
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年8月25日
【发明人】朱伟, 周鑫, 单霞, 齐炼文, 黄泽波, 王同杉, 吴晶晶, 朱明霞, 王魏魏, 陈彦, 邢昌赢
【申请人】朱伟