检测棉花轮纹斑病的试剂盒及检测方法
【专利摘要】本发明公开了检测棉花轮纹斑病的试剂盒，所述试剂盒为PCR检测试剂盒，包括以下引物：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，并提供了使用上述试剂盒的棉花轮纹斑病的检测方法。本发明的有益效果为：本发明提供的检测棉花轮纹斑病的试剂盒及检测方法，与现有技术相比，具有操作简单、灵敏、快速的特点，能够对棉花轮纹斑病进行诊断及预测。
【专利说明】
检测棉花轮纹斑病的试剂盒及检测方法
技术领域
[0001] 本发明涉及农作物病害检测技术领域，具体涉及检测棉花轮纹斑病的试剂盒及检 测方法。
【背景技术】
[0002] 棉花轮纹斑病（Alternaria leaf spot ,Black leaf spot)又称黑斑病、腰折病， 多发生于幼苗期的子叶及成株期的叶片，是棉花叶部病害中分布最广、危害最严重的一种 毁灭性病害。近年来，该病害在我国主三大棉区均有发生，尤其在北方棉区阴湿多雨的年份 极易大面积爆发，严重时叶片全部脱落、植株枯死，造成重大的经济损失。
[0003] 棉花轮纹斑病是一种侵染性真菌病害，多发生于幼苗期子叶和成株期的叶片，是 棉花叶部病害中分布最广、危害最大、流行频率最高的一种毁灭性病害。其致病菌属于半知 菌亚门（Duteromyccotina)，丝抱纲（Hyphomyceies)，丝抱目（Hyphomycetoles)，链格抱属 (Alternaria spp.)。病原菌以分生孢子在病叶、病莖上越冬，在棉籽和短绒上也能越冬，研 究发现棉籽带菌率达47.5%~84%。带菌棉籽及田间病残体是初侵染源，病原菌主要通过气 流传播，一般多经伤口入侵，也可直接入侵，先侵染子叶，再产生分生孢子，在田间多次再侵 染。棉花轮纹斑病多在温暖潮湿环境下发生，尤其在苗期1~2片真叶期遇见寒流阴雨天气， 容易大面积发生。棉花生长中后期，田间管理不当，植株衰弱，也容易发病。
[0004] 棉花轮纹斑病鉴定现主要通过传统的病原真菌分类鉴定:首先从病叶上分离、培 养、纯化获得真菌菌株，然后对所有菌株进行致病性鉴定，从中找到可以引起棉花轮纹斑病 的致病菌株，并对菌落形态、分生孢子和分生孢子梗等形态进行形态学鉴定。该方法费用 高、时间长、操作复杂，且链格孢属的形态指标易受培养基、温湿度、光质光强等环境条件的 影响，表现出极大的变异性，鉴定受环境影响较大，现有技术无法实现对棉花轮纹斑病的快 速、准确的检测。
[0005] rDNA序列分析： 核糖体由几十种蛋白质和rDNA组成。编码rRNA的基因（称为rRNA基因或rDNA)是基因组 DNA中的中等重复、并有转录活性的基因家族。rDNA-般由转录区和非转录区构成。转录区 包括55、5.88、185、283汕嫩，其中185、5.85和283汕嫩基因组成一个转录单元，它们之间 有内转录间隔区ITS(internal transcribed space，ITS)相隔，包括 18S rDNA与5.8S rDNA 之间的ITSl，5.8S rDNA与28S rDNA之间的ITS2;相邻的两个重复单元之间由基因内间隔区 IGS(intergenic spacer)隔开。5S、18S、5.8S、28S rDNA基因序列进化缓慢而相对保守，可 在属、科、目水平上用于不同生物种的比较，而内转录区（ITS)进化较快，常用于属内种间比 较或种内群体比较。rDNA的ITS区序列分析己被认为是目前进行真菌种间分类及种内分型 最可靠的方法之一。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种主要目的在于能够快 速、准确检测棉花轮纹斑病的检测试剂盒及检测方法。
[0007] 为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为:检测棉花轮纹斑病的试剂盒，所述 试剂盒为PCR检测试剂盒，包括以下引物:SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO.2。
[0008] 进一步的，上述的检测棉花轮纹斑病的试剂盒，所述引物为浓度ΙΟμΜ的溶液。
[0009] 进一步的，上述的检测棉花轮纹斑病的试剂盒，所述试剂盒还包括无菌去离子水、 含]\%2+的10\?0?13肚€61、浓度为0.251111的(1犯1 3，浓度为5 1]/^1的了39〇嫩聚合酶。
[0010] 本发明的第二个目的是提供了棉花轮纹斑病的检测方法，包括如下步骤： 1) 将提取的待检测目标的DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，PCR反应溶液中的上下 游引物的核苷酸序列为：SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO.2; 2) 将步骤1)得到的PCR扩增产物与溴酚蓝上样缓冲液混匀，用琼脂糖凝胶电泳分离，得 到电泳分离后的PCR扩增产物； 3) 将步骤2)得到的电泳分离后的PCR扩增产物经Go IdView DNA染料染色后在紫外凝胶 成像系统下观察，出现特异性片段大小为218 bp，则待测目标有棉花轮纹叶斑病。
[0011] 进一步的，上述的棉花轮纹斑病的检测方法，所述步骤1)中的PCR反应溶液由如下 组分组成:含Mg2+的10 XPCR buffer 1.0 μL，浓度为0.25 mM的dNTP ΙμL，浓度为5 U/μΙ的 TaqDNA聚合酶0.2μ1，浓度为10μΜ的上下游引物溶液各0.25μ1，无菌去离子水补齐至10μ1。
[0012] 进一步的，上述的棉花轮纹斑病的检测方法，所述步骤1)中的PCR反应过程具体如 下：94 cC 5 min;94 cC 45 sec，52 cC 45sec，72 cC 45sec，35个循环；72 cC 5 min。
[0013] 进一步的，上述的棉花轮纹斑病的检测方法，所述步骤2)中的电泳过程具体如下： 将5μ1 PCR产物与ΙμL溴酚蓝上样缓冲液混匀，用1.0%(重量/体积，即g/ml)琼脂糖凝胶电泳 分呙。
[0014] 进一步的，上述的棉花轮纹斑病的检测方法，所述步骤3)中，待测目标的DNA提取 步骤如下： a) 剪取待测棉花叶片0.2 g，在研钵中加入液氮充分研磨，研磨好的材料转入2 ml EP 管中，加入I ml提取缓冲液涡旋混匀，冰浴静置10min，10000 rpm、4°C离心20 min，弃上清， 得到沉淀； b) 向步骤a)得到的沉淀中加入0.8 ml 65°C预热的裂解缓冲液，并用铜丝搅松，涡旋混 匀，65°C 水浴 30min; c) 加入0.8 ml氯仿-异戊醇混合液，所述氯仿-异戊醇混合液中按照体积比氯仿:异戊 醇为24:1，翻转50次以上，10000rpm、15°C离心20min，将上清转入2 ml的离心管中，加入预 冷的异丙醇，异丙醇的加入比例为按照体积比上清:异丙醇为5:3,缓慢翻转30次，混匀，静 置IOmin，1000 Orpm，室温离心10min，弃上清，于沉淀中加入I ml 70%的乙醇洗涤，并转入 1.5 ml的离心管中，1000 Orpm离心5min，倒掉上清液，通风干燥20min; d) 加2 ml TE缓冲液溶解，65°C培养10~30min，加等体积的氯仿-异戊醇混合液，缓慢 翻转50次，混勾，室温静置5min，1000 Orpm离心10min; e) 上清液转入5ml离心管中，加 pH 5.2的3M醋酸钠，醋酸钠的加入比例为按照体积比上 清:醋酸钠为10:1，加等体积的异丙醇后翻转30次，放置30min，1000 Orpm离心5min，弃上清 液，加 I ml 70%乙醇洗DNA小团，转入1.5 ml的离心管中，1000 Orpm离心5min。弃上清液，自 然通风干燥DNA沉淀； f)用TE缓冲液溶解DNA，调整DNA浓度至50 ng/μL并保存备用，所述TE缓冲液组成为 IOmM 、PH 8.0的Tris/HCl，lmM 、PH 8.0的EDTA，PH 8.0。
[0015]进一步的，上述的棉花轮纹斑病的检测方法，所述步骤a)中，每100ml DNA提取缓 冲液的配制组成为：〇.351葡萄糖6.9368,0.謂1^8.!1(：110.〇1111，51111恥上0了厶1.〇1111，2% PVP 20.0ml，体积比 1%的β-Me 1.0ml，dd水 68.0ml。
[0016] 进一步的，上述的棉花轮纹斑病的检测方法，所述步骤b)中，每100mL裂解缓冲液 的配制组成为：1.4M NaCl 8.1816g，0.1M Tris.HCl 10.0ml，20mM Na.EDTA 4.0ml，2%CTAB 20.0ml，2% PVP 20.0ml，体积比 1%的β-Me 1.0ml，dd水 45.0ml。
[0017] 本发明的有益效果为:本发明提供的检测棉花轮纹斑病的试剂盒及检测方法，与 现有技术相比，具有操作简单、灵敏、快速的特点，能够对棉花轮纹斑病进行诊断及预测。
【附图说明】
[0018] 图1为棉花轮纹斑病检测结果的凝胶电泳图。
[0019]其中，1-5泳道为实验田中感染棉花轮纹斑病的棉花叶片检测结果，6泳道为阴性 对照。
[0020]图2为棉花轮纹斑病典型发病叶片病斑所提取DNA与正常叶片的对比凝胶图。
[0021 ]其中，1-5泳道为棉花轮纹斑病典型发病叶片病斑所提取DNA，6泳道为健康叶片提 取 DNA。
【具体实施方式】 [0022] 实施例1: 棉花轮纹斑病检测试剂盒，该试剂盒为PCR试剂盒，该试剂盒包括上游引物和下游引 物，其中 上游引物5: TGAAGAACGC AGCGAAAT -3' 下游引物5'- GCTCCGAAAC CAGTAGGC -3'。
[0023]该试剂盒中的上下游引物对棉花轮纹斑病DNA扩增的特异性片段大小为218 bp。 经GoldView DNA染料染色后在紫外凝胶成像系统下观察即可做出准确判断。
[0024] 试剂盒中的各组成部分具体如下，其中上游引物和下游引物的溶液的浓度为10μ M，含Mg2+的10 X PCR buffer，浓度为0.25mM的dNTP，浓度为5 U/μΙ的TaqDNA聚合酶和无菌去 呙子水。
[0025] 棉花轮纹斑病的检测方法，是通过上述试剂盒实现的，具体包括如下步骤： 1) 将提取的待检测目标的DNA进行PCR扩增； 2) 将PCR扩增产物与溴酚蓝上样缓冲液混匀，用琼脂糖凝胶电泳分离； 3 )将电泳分离后的PCR扩增产物经Go I dVi ew DNA染料染色后在紫外凝胶成像系统下观 察，出现特异性片段大小为218 bp，则待测目标有棉花轮纹叶斑病； 其中PCR反应溶液中的上下游引物的核苷酸序列如下， 上游引物5: TGAAGAACGC AGCGAAAT -3' 下游引物5'- GCTCCGAAAC CAGTAGGC -3'。
[0026] PCR反应溶液的具体组成如下:含Mg2+的10 XPCR buffer 1.0 μL，浓度为0.25 mM 的dNTP ΙμL，浓度为5 υ/μL的TaqDNA聚合酶0.2 μL，浓度为10 μΜ的上下游引物溶液各0.25 μL，无菌去离子水补齐至?〇μ1。
[0027] PCR反应过程具体如下：94 cC 5 min;94 cC 45 sec，52 cC 45sec，72 cC 45sec， 35个循环;72 °C 5 min。
[0028] 电泳过程具体如下：将5 μL PCR产物与I μL溴酚蓝上样缓冲液混匀，用1.0%(g/ ml)琼脂糖凝胶电泳分离。
[0029]待测目标的DNA提取步骤如下： a) 剪取待测棉花叶片0.2 g，在研钵中加入液氮充分研磨，研磨好的材料转入2 ml EP 管中，加入1ml提取缓冲液(配方见表1)涡旋混匀，冰浴静置10 min，l 0000 rpm离心20 min (4 °C)，弃上清，DNA提取缓冲液配方如表1所示； 表1
b) 向沉淀中加入0.8 ml 65°C预热的裂解缓冲液(配方见表2)，并用铜丝搅松，涡旋混 匀，65 °C水浴30 min，裂解缓冲液配方如表2所示； 表2
c) 加入0.8 ml氯仿:异戊醇(24:1)混合液，翻转50次以上，1000 Orpm离心20min( 15°C)， 将上清转入2 ml的离心管中，加 O . 6体积的预冷的异丙醇，缓慢翻转30次，混匀，静置10 min，10000 rpm，离心10 min(室温），弃上清，于沉淀中加入I ml 70%的乙醇洗涤，并转入 1.5 ml的离心管中，10000 rpm离心5 min。倒掉上清液，通风干燥20 min; d) 加2 ml TE缓冲液溶解，65°C培养10~30min，加等体积的氯仿：异戊醇（24:1)，缓慢 翻转50次，混勾，室温静置5 min，10000 rpm离心10 min; e) 上清液转入5 ml离心管中，加0.1体积的3 M醋酸钠 (pH 5.2)，加等体积的异丙醇后 翻转30次，放置30 min，10000 rpm离心5 min。弃上清液，加 I ml 70%乙醇洗DNA小团，转入 1.5 ml的离心管中，10000 rpm离心5 min。弃上清液，自然通风干燥DNA沉淀； f) 用TE缓冲液（10 mM Tris/HC1(PH 8.0)，1 mM EDTA(PH 8·0)，ΡΗ 8.0)溶解DNA，调整 DNA浓度至50 ng/μL并保存备用。
[0030]最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明， 尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可 以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。 凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的 保护范围之内。 序列表 〈11〇>新疆农垦科学院 〈120>检测棉花轮纹斑病的试剂盒及检测方法 <210> 1 <211> 18 <212> DNA 〈213>上游引物 <400> 1 tgaagaacgc agcgaaat 18 <210> 1 <211> 18 <212> DNA 〈213>下游引物 〈400> 2 getccgaaac cagtaggc 18
【主权项】
1. 检测棉花轮纹斑病的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为PCR检测试剂盒，包括以下 引物：SEQ ID N0.1 和SEQ ID N0.2。2. 根据权利要求1所述的检测棉花轮纹斑病的试剂盒，其特征在于，所述引物为浓度10 μΜ的溶液。3. 根据权利要求1所述的检测棉花轮纹斑病的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括 无菌去离子水、含Mg2+的10 X PCR buf f er、浓度为0.25mM的dNTP，浓度为5 U/μΙ的TaqDNA聚 合酶。4. 棉花轮纹斑病的检测方法，其特征在于，包括如下步骤： 1) 将提取的待检测目标的DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，PCR反应溶液中的上下 游引物的核苷酸序列为：SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO.2; 2) 将步骤1)得到的PCR扩增产物与溴酚蓝上样缓冲液混匀，用琼脂糖凝胶电泳分离，得 到电泳分离后的PCR扩增产物； 3) 将步骤2)得到的电泳分离后的PCR扩增产物经GoldView DNA染料染色后在紫外凝胶 成像系统下观察，出现特异性片段大小为218 bp，则待测目标有棉花轮纹叶斑病。5. 根据权利要求4所述的棉花轮纹斑病的检测方法，其特征在于，所述步骤1)中的PCR 反应溶液由如下组分组成：含Mg2+的10XPCR buffer 1.0 μL，浓度为0.25 mM的dNTP ΙμL， 浓度为5 U/μΙ的TaqDNA聚合酶0.2μ1，浓度为ΙΟμΜ的上下游引物溶液各0.25μ1，无菌去离子 水补齐至?〇μ1。6. 根据权利要求4所述的棉花轮纹斑病的检测方法，其特征在于，所述步骤1)中的PCR 反应过程具体如下：94 °C 5 min;94 °C 45 sec，52 °C 45sec，72 °C 45sec，35个循环；72 °C 5 min〇7. 根据权利要求4所述的棉花轮纹斑病的检测方法，其特征在于，所述步骤2)中的电泳 过程具体如下:将5μ1 PCR产物与?μL溴酚蓝上样缓冲液混匀，用1.0%琼脂糖凝胶电泳分离。8. 根据权利要求4所述的棉花轮纹斑病的检测方法，其特征在于，所述步骤3)中，待测 目标的DNA提取步骤如下： a) 剪取待测棉花叶片0.2 g，在研钵中加入液氮充分研磨，研磨好的材料转入2 ml ΕΡ 管中，加入1 ml提取缓冲液涡旋混匀，冰浴静置10min，10000 rpm、4°C离心20 min，弃上清， 得到沉淀； b) 向步骤a)得到的沉淀中加入0.8 ml 65°C预热的裂解缓冲液，并用铜丝搅松，涡旋混 匀，65°C 水浴 30min; c) 加入0.8 ml氯仿-异戊醇混合液，所述氯仿-异戊醇混合液中按照体积比氯仿：异戊 醇为24:1，翻转50次以上，10000rpm、15°C离心20min，将上清转入2 ml的离心管中，加入预 冷的异丙醇，异丙醇的加入比例为按照体积比上清:异丙醇为5:3,缓慢翻转30次，混匀，静 置lOmin，lOOOOrpm，室温离心10min，弃上清，于沉淀中加入1 ml 70%的乙醇洗涤，并转入 1.5 ml的离心管中，lOOOOrpm离心5min，倒掉上清液，通风干燥20min; d) 加2 ml TE缓冲液溶解，65°C培养10~30min，加等体积的氯仿-异戊醇混合液，缓慢 翻转50次，混勾，室温静置5min，lOOOOrpm离心10min; e) 上清液转入5ml离心管中，加 pH 5.2的3M醋酸钠，醋酸钠的加入比例为按照体积比上 清:醋酸钠为10:1，加等体积的异丙醇后翻转30次，放置30min，lOOOOrpm离心5min，弃上清 液，加1 ml 70%乙醇洗DNA小团，转入1.5 ml的离心管中，lOOOOrpm离心5min; 弃上清液，自然通风干燥DNA沉淀； f)用TE缓冲液溶解DNA，调整DNA浓度至50 ng/μL并保存备用，所述TE缓冲液组成为 10mM 、PH 8.0的Tris/HCl，lmM 、PH 8.0的EDTA，PH 8.0。9. 根据权利要求8所述的棉花轮纹斑病的检测方法，其特征在于，所述步骤a)中，每 100ml DNA提取缓冲液的配制组成为：0.35M 葡萄糖6.936g，0.1M Tris.HCl 10.0ml，5mM 恥』〇了厶1.〇1111，2%?￥?2〇.〇1111，体积比1%的0-]^1.〇1111，(1(1水68.〇1111。10. 根据权利要求8所述的棉花轮纹斑病的检测方法，其特征在于，所述步骤b)中，每 100ml 裂解缓冲液的配制组成为：1.4M NaCl 8.1816g，0.1M Tris.HCl 10.0ml，20mM 恥』〇了厶4.〇1111，2%〇^8 2〇.〇1111，2%?￥?2〇.〇1111，体积比1%的0-]^1.〇1111，(1(1水45.〇1111。
【文档编号】C12Q1/68GK106086217SQ201610674978
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年8月16日 公开号201610674978.5, CN 106086217 A, CN 106086217A, CN 201610674978, CN-A-106086217, CN106086217 A, CN106086217A, CN201610674978, CN201610674978.5
【发明人】孔宪辉, 田琴, 余渝, 陈红, 刘丽, 王娟, 王旭文, 司爱君, 王方永
【申请人】新疆农垦科学院