用于检测特发性慢性胰腺炎的引物组、试剂盒与其用图
【专利摘要】本发明公开了用于检测特发性慢性胰腺炎的引物组，其分别对应于CTRC基因第1、4、5、6、8外显子的第一至第五引物对；其中各引物对中的上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.10所示。本发明还公开了基于所述引物组的试剂盒与其用途。本发明提供的引物组和试剂盒能够高灵敏度、特异性的、简便、快捷、准确的测定CTRC基因分型，从而用于特发性慢性胰腺炎的诊断和治疗中，以及还能够用于在人群中大规模筛查CTRC基因突变的携带者，为特发性慢性胰腺炎提供诊断和治疗服务及参考。
【专利说明】
用于检测特发性慢性胰腺炎的引物组、试剂盒与其用途
技术领域
[0001] 本发明涉及一种慢性胰腺炎的检测方法及试剂，特别是一种用于检测特发性慢性 胰腺炎的引物组、试剂盒与其用途。
【背景技术】
[0002] 慢性胰腺炎（chronic pancreatitiS，CP)是一种进展性、不可逆的胰腺外分泌及 内分泌组织损毁性病变，最终导致胰腺外分泌功能损坏、糖尿病、甚至胰腺癌。一部分无明 确病因者称为特发性慢性胰腺炎（idiopathic chronic pancreatitis，ICP) <ΧΡ病程迀延， 其发病率在国内外有逐年升高的趋势，确切病因和发病机制尚不清楚，因此遗传基因异常 在其发病过程中的作用成为了国内外研究的热点。
[0003] 已有的研究表明，阳离子胰蛋白酶原(PRSSl)基因、囊性纤维化跨膜传导调节因子 (CFTR)基因和胰分泌性胰蛋白酶抑制剂Kazal 1型（SPINKl)基因突变可显著提高个体对慢 性胰腺炎的易感性。近期，大量研究结果显示CTRC基因很可能为CP易感基因研究的新热点。 然而，目前尚缺少能有效、准确的检测CTRC基因及其突变的相关手段。
【发明内容】
[0004] 本发明的主要目的在于提供一种用于检测特发性慢性胰腺炎的引物组、试剂盒与 其用途，以克服现有技术中的不足。
[0005] 为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
[0006] 本发明提供了用于检测慢性胰腺炎(特别是特发性慢性胰腺炎）的引物组，其包括 分别对应于CTRC基因第1、4、5、6、8外显子的第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引 物对和第五引物对。
[0007] 其中，所述第一引物对中的上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO .2所示。
[0008] 其中，所述第二引物对中的上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO .4所示。
[0009] 其中，所述第三引物对中的上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO .6所示。
[0010]其中，所述第四引物对中的上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO .8所示。
[0011]其中，所述第五引物对中的上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO .10所示。
[0012]进一步的，所述引物组中，每一引物对中的两条引物之间的摩尔比为1:1。
[0013] 本发明还提供了所述引物组于制备特发性慢性胰腺炎检测试剂盒中的用途。
[0014] 本发明还提供了特发性慢性胰腺炎的检测试剂盒，其包含PCR反应体系，所述PCR 反应体系包含所述的引物组。
[0015] 进一步的，所述试剂盒还包括PCR反应缓冲液，聚合酶和dNTP。
[0016] 在本发明的一个优选实施例中，所述试剂盒采用的引物组如前所述，分别以各引 物对进行PCR反应，每一 PCR反应体系组成如下： 总休系 IOui 聚合酶 0.2U 各上游引物（2uM) Iul
[0017] 各下游引物（2uM) Iul 各DNA (模板）Iul IOxbuiTcr Iul 超纯水（MiliQ) 补齐。
[0018] PCR反应程序:95°C，预变性10min;95°C变性15s，40个循环，60°C退火60s。
[0019] 本发明还提供了所述的引物组或所述的试剂盒在制备检测或辅助检测慢性胰腺 炎(特别是特发性慢性胰腺炎)的产品中的应用。
[0020] 较之现有技术，本发明的优点在于:提供的引物组和试剂盒能够高灵敏度、特异性 的、简便、快捷、准确的测定CTRC基因分型，从而用于特发性慢性胰腺炎的诊断和治疗中，以 及还能够用于在人群中大规模筛查CTRC基因突变的携带者，为特发性慢性胰腺炎提供诊断 和治疗服务及参考。
【附图说明】
[0021] 图1是本发明一典型实施例中一 Exon4位点基因突变携带者的基因测序图谱。
【具体实施方式】
[0022]本发明通过检测来自受检测人群的样本中是否存在CTRC基因第1、4、5、6、8外显子 的基因突变，进而判断受检测人群的特发性慢性胰腺炎易感的可能性。
[0023]本发明的用于检测特发性慢性胰腺炎的引物组包括分别对应于CTRC基因第1、4、 5、6、8外显子的第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对和第五引物对;其中，所 述第一引物对中的上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO.2所示，所述 第二引物对中的上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示，所述第 三引物对中的上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示，所述第四 引物对中的上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示，所述第五引 物对中的上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO. 10所示。
[0024]进一步的，所述引物组中，每一引物对中的两条引物之间的摩尔比为1:1。
[0025]更进一步的，前述引物组中各引物对所对应的CTRC基因第1、4、5、6、8外显子 (Exon)、其序列、对应的起始位置(strart)、解链温度、扩增子(ampIicon)等如下表1所示。
[0026]表 1
[0029] 本发明的前述引物组可用于制备特发性慢性胰腺炎检测试剂盒。
[0030] 本发明的特发性慢性胰腺炎的检测试剂盒包含PCR反应体系，所述PCR反应体系包 含所述的引物组。
[0031] 进一步的，本发明的试剂盒还包括PCR反应缓冲液，聚合酶和dNTP等。
[0032] 更进一步的，本发明的试剂盒可以包括下述以下一种或几种试剂的组合：
[0033] a.从待测样品中提取DNA的试剂；
[0034] b.前述的引物组和相关的PCR反应试剂；
[0035] c .PCR产物纯化试剂；
[0036] d.对PCR产物进行直接测序的试剂。
[0037] 本发明还提供了所述的引物组或所述的试剂盒在制备检测或辅助检测特发性慢 性胰腺炎的产品中的应用。
[0038] 采用PCR扩增-直接测序的方法来检测样本的突变情况，具体操作步骤如下：
[0039] a.采集待测个体的样本，为血液样本、体液样本或组织样本，提取全基因组DNA; [0040] b.以提取的DNA为模板，以本发明设计的引物组进行突变区段DNA序列的扩增，得 到相应的PCR扩增产物；
[0041] c.将得到的PCR产物纯化后，进行直接测序分析，将所测得的序列与正常序列进行 比对，确定突变是否存在；
[0042] d.根据以上实验结果分析受检人群是否存在CTRC基因第1、4、5、6、8外显子区域的 基因突变，以及探知特发性慢性胰腺炎易感的可能性。
[0043] 在本发明中，PCR反应液中各组分的终浓度可以为10 XPCR缓冲液{(ImM或IOmM或 20mM或50mM或80mM或 100mM)KCl、（ ImM或IOmM或20mM或50mM或80mM或IOOmM) (NH4)2S〇4、（ ImM 或20mM或50mM或 IOOmM或 150mM或200mM) Tri s-HCl (pH8或pH8.5或pH9)}、引物各（InM或 IOnM 或20nM或50nM或80nM或90nM或IOOnM)、探针各（InM或IOnM或20nM或50nM或80nM或90nM或 100nM)、dNTPs{(lmMSl0rnMSl5mMS20m]\m^25mM)dATP、（lm]\m!U0m]\m!U5mMS20mMS25mM) dGTP、（ImM或IOmM或15mM或20mM或25mM)dCTP、（ImM或5mM或8mM或IOmM或12·5mM)dUTP、（ImM 或5mM或8mM或IOmM或12.5mM)dTTP}、（lmM或IOmM或15mM或20mM或 25mM)MgCl2。
[0044] 或者，在本发明中，PCR反应液中各组分的终浓度也可以为10 X PCR缓冲液{(ImM或 IOmM或20mM或50mM或80mM或100mM)KCl、（lmM或IOmM或20mM或50mM或80mM或100mM)(NH4) 2SO4、（ ImM或20mM或50mM或 IOOmM或 150mM或200mM) Tri s-HCl (pH8或pH8 · 5或pH9)}、引物各 (InM 或 IOnM 或 20nM 或 50nM 或 80nM 或 90nM 或 ΙΟΟηΜ)、探针各（InM 或 IOnM 或 20nM 或 50nM 或 80nM 或 90nM 或 100nM)、dNTPs{(lrn]\m!U0m]\m!U5m]\m^20m]\m^25mM)dATP、（lm]\m!U0m]\m!U5m]\m^20mM 或 2 5mM)dGTP、（ImM或IOmM或15mM或 20mM或 25mM)dCTP、（ImM或 5mM或 8mM或IOmM或12.5mM) dUTP、（ImM或5mM或8mM或IOmM或12·5mM)dTTP}、（ImM或IOmM或15mM或20mM或25mM)MgCh。
[0045] 其中，Taq/UNG酶混合液可以为lU/yL或2U/yL或5U/yL或IOUAxL的Taq酶和24yL I UAiL或2U/yL或5U/yL或I OUAiL的UNG酶的混合液；
[0046]在本发明中，CTRC基因第1、4、5、6、8外显子的基因突变的检测能够用遗传领域的 任意一种点突变检测方法进行，如PCR(聚合酶链反应）-RFLP法（限制性内切酶片段多态 性）、PCR-测序法、位点特异性PCR法、PCR-dHPLC(变性高效液相色谱）、及PCR-SSCP (单链构 象多态性)法等。进一步的，前述方法中得到的PCR产物还能用其他方法进行检测，如DNA杂 交探针法或者直接测序法等。
[0047] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对 本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并 不用于限定本发明。
[0048] 如下实施例所用的引物组和试剂盒如前所述。而藉由该试剂盒对样品进行检测的 具体操作步骤如下：
[0049] 1、采集检测样本
[0050] 本发明中收集了一组共计120位随机选择人员的血样，并对该120人的既往病史进 行了考察，其中有3人曾患有胰腺炎且已经痊愈，1人患有慢性胰腺炎(其血样可命名为样品 z)。所有人员均详细记录临床基本资料和检测资料，在签署知情同意书后每人采集血液样 本3_5mL。
[0051 ] 2、基因组DNA提取
[0052]将获得的血液样本存储于-80°C冰箱。用酚氯仿或柱吸附方法提取血液样本的基 因组DNA，保存于-40 °C冰箱，每份DNA样本具有其对应的详细的临床资料。
[0053] 如下实施例中采用的试剂和仪器如下：Qiagen HotstarTaq DNA polymerase、 Eppendorf58IOR冷冻离心机、Eppendorf移液器、ABI 3730测序仪。当然亦可采用业界已知 的其它合适试剂或仪器。
[0054] 3、PCR 扩增：
[0055] 其中采用的引物组如前所述。分别以各引物对进行PCR反应，每一 PCR反应体系组 成如下： 总体系 IOul 聚合酶 0 2U 各上游引物（2:uM) Iul
[0056] 各下游引物〔2uM) Iul ^ DNA (模板）M IO^bulTcr Iul 超纯水（MiliQ): 补齐。
[0057] PCR反应程序:95°C，预变性10min;95°C变性15s，40个循环，60°C退火60s。
[0058] 4、PCR产物纯化
[0059] 反应体系
[0060]虾碱酶（SAP):初浓度7.633UAxL(l/2浓度）
[0061 ]外切酶(EXONl):初浓度20U/yL
[0062] 终浓度：〇.2U SAP+2.5U EXONl/7yL
[0063] 每个样本：0.05yL SAP+0.125yL EX0Nl+5.825yL ddH20+50-80ng PCR产物/7yL
[0064] 16个样品：0.8yL SAP+2.1yL EXONl+lOOyL dddH20。
[0065] 反应条件
[0066] 37〇C,60min；
[0067] 80°C , 15min；
[0068] 4°C ,for ever.
[0069] 5、测序PCR反应
[0070] A、反应体系
[0071] 0 · 4yLmix3 · 1+1 · 2ul seq buffer+2yLlyM primer+2yL ddH2〇+l-3yLPCR纯化产物
[0072] 于离心机上甩一下，达900转/分左右即停。
[0073] B、反应条件
[0074] PCR扩增：（2700/9600of PE biosystem，9600程序 107 108 109)
[0075] 96〇C,10s；
[0076] 96〇C,10s；
[0077] 50 °C ,5s，25个循环；
[0078] 60〇C,4min；
[0079] 60〇C,4min；
[0080] 4Γ,至结束。
[0081] C、测序反应
[0082] 1、扩增结束后，用连续加样器加入75%乙醇52yL左右于室温进行沉淀，时间15分 钟左右，不得超过24小时。
[0083] 2、离心机3000转/分，4°C离心30分钟。
[0084] 3、轻轻倒去上清液，将96孔板倒置离心，达900转/分即停。
[0085] 4、每孔加入I OyI^hidi
[0086] 5、95°C变性4分钟以上，取出立即放入冰水中，置5分钟。
[0087] 6、上样。
[0088]对120份受检样品检测后发现，其中样品z的CTRC基因第4外显子区域的 rs41307798位点存在突变，详见图1及下表2。
[0089]表2
L 〇〇91 J 其中，CTRC基因苐4外M于凶域中相应位点的标准核酸序列如卜): CAACACCCGGACCTACCGTGTGGCCGTGGGAAAGAACAACCTGGAGGTGGAAGACGAAGAAGGATCCCTGTTTGTGG GTGTGGACACCATCCACGTCCACAAGAGATGGAATGCCCTCCTGTTGCG(SEQ ID NO.16)
[0092] 以及，上表2中所述rs41307798的详细信息可参阅：
[0093] http://www.nebi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi?rs=41307798〇
[0094] 另外，上表2 中：同义突变GAC-GAT，D[Asp ] -D[Asp ]。
[0095] 而以业界已知的其它方法对该样品z进行检测，可以获得相同结论。
[0096]总之，本发明的检测试剂盒具有高特异性和灵敏度，且使用时操作简单、经济高 效、可进行高通量的样本检测。
[0097]应当指出，以上所述仅是本发明的优选实施方式，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰 也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 用于检测特发性慢性胰腺炎的引物组，其特征在于包括分别对应于CTRC基因第1、4、 5、6、8外显子的第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对和第五引物对;其中，所 述第一引物对中的上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO.2所示，所述 第二引物对中的上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示，所述第 三引物对中的上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示，所述第四 引物对中的上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示，所述第五引 物对中的上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO. 10所示。2. 如权利要求1所述的引物组，其特征在于:所述引物组中，每一引物对中的两条引物 之间的摩尔比为1:1。3. 如权利要求1或2所述引物组于制备特发性慢性胰腺炎检测试剂盒中的用途。4. 特发性慢性胰腺炎的检测试剂盒，其特征在于:所述试剂盒包含PCR反应体系，所述 PCR反应体系包含权利要求1或2所述的引物组。5. 如权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于:所述试剂盒包括PCR反应缓冲液，聚合 酶和dNTP。6. 如权利要求1或2所述的引物组在制备检测或辅助检测特发性慢性胰腺炎的产品中 的应用。7. 如权利要求4或5所述的检测试剂盒在制备检测或辅助检测特发性慢性胰腺炎的产 品中的应用。
【文档编号】C12N15/11GK106086212SQ201610649313
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年8月10日 公开号201610649313.9, CN 106086212 A, CN 106086212A, CN 201610649313, CN-A-106086212, CN106086212 A, CN106086212A, CN201610649313, CN201610649313.9
【发明人】孙畅, 李兆申, 黄迅威, 邵敏华
【申请人】中国人民解放军第二军医大学