一种利用lamp技术检测菊苣假单胞菌的引物组与试剂盒及方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用LAMP技术检测菊苣假单胞菌的引物组与试剂盒及方法。该引物组包括一对外侧引物F3和B3以及一对内侧引物FIP和BIP，序列分别如SEQ ID NO.1～4所示。试剂盒包括前述引物组，还可包括其他检测试剂。用LAMP技术检测菊苣假单胞菌的方法，是以待测样品的基因组DNA为模板，利用引物组或试剂盒进行LAMP扩增反应；反应结束后观察LAMP扩增反应液颜色变化，如反应液为绿色的浑浊液体，即判断为阳性反应；如反应液为橙色透明液体，即判断为阴性反应。本发明具有如下优点：结果可靠、特异性强、灵敏性高、快速高效、简便易操作。
【专利说明】
一种利用LAMP技术检测菊苣假单胞菌的引物组与试剂盒及 方法
技术领域
[0001] 本发明属于植物保护领域，特别涉及一种利用LAMP技术检测菊苣假单胞菌的引物 组与试剂盒及方法。
【背景技术】
[0002] 番前髓部坏死病(Tomato pith necrosis)是近年来我国大陆番前生产上出现的 一种新病害。由菊苣假单胞菌(Pseudomonas cichorii)侵染引起番前髓部坏死病于1974年 在爱尔兰首次被报道，目前该病害已在土耳其、希腊、坦桑尼亚和我国台湾等地区被报道。 2015年在广东省广州市首次发现了由菊苣假单胞菌侵染引起番茄髓部坏死病。番茄髓部坏 死病的田间症状包括植株的茎表面、叶柄和果柄形成黄色、棕色或黑色的斑点或损伤，随后 茎髓部出现水浸状、褪色、空心、软腐等症状，最终导致番茄植株枯萎，严重影响番茄的产量 和品质。目前，对菊苣假单胞菌的检测方法主要有传统的植物病原细菌分离与鉴定方法、 BI0L0G GEHIMicroStation微生物鉴定系统和PCR检测方法。传统的植物病原细菌分离与鉴 定方法的鉴定过程至少需要1个月以上，工作量大，且需要专业技术人员操作。BI0L0G GEM MicroStation微生物鉴定系统，的鉴定过程需要5-7天，且需要购买昂贵的仪器设备和标准 数据库。PCR方法应用最为广泛，该方法较特异、快速、灵敏，成本也较低，但需要购买PCR仪 凝胶成像系统等专业仪器设备，且扩增和产物检测时间较长(约3h)。
【发明内容】
[0003] 本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点和不足，提供一种利用LAMP技术检测 菊苣假单胞菌的引物组。
[0004] 本发明的另一个目的在于提供一种利用LAMP技术检测菊苣假单胞菌的试剂盒。
[0005] 本发明的又一目的在于提供一种利用LAMP技术检测菊苣假单胞菌的方法，该方法 快速、简便。
[0006] 本发明的目的通过下述技术方案实现:一种利用LAMP技术检测菊苣假单胞菌的引 物组，包括一对外侧引物F3和B3以及一对内侧引物FIP和BIP，其核苷酸序列如下所示：
[0007] F3:5 '-CAGCCGCGGTAATACAGAG-3 '
[0008] B3:5 '-GCCACTGGTGTTCCTTCC-3 '
[0009] FIP:5 '-GCCCGGGGATTTCACATCCAACGGTGCGAGCGTTAATCGG-3 '
[0010] BIP:5 '-ACTGCATCCAAAACTGGCGAGCGCATTTCACCGCTACACAGG-3 '。
[0011] -种利用LAMP技术检测菊苣假单胞菌的试剂盒，包括上述引物组。
[0012] 所述的利用LAMP技术检测菊苣假单胞菌的试剂盒，还包含以下组分:LAMP反应液、 酶溶液和核酸荧光染料。
[0013] 所述的LAMP反应液包含如下组分：Tris-HCl(pH8.8)40mM、KCl 20mM、MgS〇4 16mM、 (順4)23〇4 2〇1111、丁￥6611-20 0.2%(￥八）、甜菜碱（86七&1116)1.61、(1犯138 2.81111;
[0014] 所述的酶溶液为Bst DNA聚合酶，8U/yL;
[0015] 所述的核酸荧光染料为Loopamp?荧光目视检测试剂。
[0016] -种利用LAMP技术检测菊苣假单胞菌的方法，包含以下步骤：
[0017] 以待测样品的基因组DNA为模板，利用LAMP引物组或LAMP检测试剂盒进行LAMP扩 增反应;反应结束后观察LAMP扩增反应液颜色变化，如反应液为绿色的浑浊液体，即判断为 阳性反应;如反应液为橙色透明液体，即判断为阴性反应；
[0018] 所述的LAMP扩增反应的反应体系为25yL反应体系，包括DNA模板lyL、2 X反应缓冲 液12.5yL、浓度为20μΜ引物FIP和BIP各3yL、浓度为ΙΟμΜ引物F3和B3各lyL、Bst DN聚合酶1μ L、Loopamp?荧光目测反应液IyL以及去离子水1 · 5yL;
[0019] 所述的LAMP扩增反应的条件为63°C恒温条件下，扩增反应lh，95°C恒温2min使酶 失活。
[0020] 所述的引物组或试剂盒在植物菊苣假单胞菌检测领域中的应用。
[0021] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0022] (1)结果可靠:本发明所设计的LAMP引物组，已经对5种不同细菌进行检测验证，其 结果可靠性有保证。
[0023] (2)特异性强:本发明通过2对引物识别靶序列上6个特异区域，常规PCR是通过识 别靶序列上2个特异区域，而BI0L0G微生物鉴定系统因操作差异和检测板不同等原因，导致 获得的数据中部分与标准数据库不一致，难以定论。因此本发明大大提高了特异性。
[0024] (3)灵敏性高：环介导等温扩增法所需模板浓度比PCR方法所需模板浓度还要低， 相比PCR方法，环介导等温扩增法灵敏度提高10倍。
[0025] (4)快速高效:本方面的检测方法鉴定周期为1小时，传统的植物病原细菌鉴定方 法至少需要1个月，且需要专业技术人员操作;BI0L0G鉴定方法需要5-7天，而且需要购买昂 贵的仪器设备和数据库;PCR鉴定方法则至少需要3h，本发明大大提高了检测效率。
[0026] (5)简便易操作:本发明的方法只需要有恒温水浴锅或稳定热源的设备即可进行， 试验结果通过肉眼观察反应液颜色变化即可判断，不需要专业人员操作，非专业人员均可 操作，鉴定方法适应性强。克服了传统的植物病原细菌鉴定方法、BI0L0G鉴定方法和PCR方 法的专业性强以及需要专业仪器设备等局限性，从而达到实际生产中快速鉴定植物病害的 要求。
【附图说明】
[0027]图1为实施例2的LAMP特异性反应结果图，其中：管1-3是以菊苣假单胞菌基因组 DNA为模板、管4是以茄科青枯菌基因组DNA为模板、管5是以黑腐果胶杆菌基因组DNA为模 板、管6是以Pectobacterium carotovorum subsp·brasiliense菌基因组DNA为模板、管7为 阴性对照。
[0028] 图2为实施例3的LAMP灵敏度反应结果图，其中：管1-8模板浓度分别为Ι,ΠΓ1，10 -2，10- 3，10-4，10-5，10-6，10-7，管9为阴性对照。
[0029] 图3为实施例3的不同浓度的菊苣假单胞菌基因组DNA为模板的PCR产物电泳结果 图，其中：泳道1为标准分子量（IOObp LadderMarker);泳道2-8DNA模板浓度分别为1，10一1， 10-2，10- 3，10-4，10-5，10-6，10-7，泳道9 为阴性对照。
[0030]图4为实施例4未知番茄病样的LAMP反应结果图。
【具体实施方式】
[0031]下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0032]实施例1引物的设计
[0033] 根据Genbank中已登录的侵染我国番前的菊苣假单胞菌16SrRNA基因（Genebank登 录号KU923372)特异区域，设计外侧引物F3和B3以及内侧引物FIP和BIP，最终确定以下引物 组：
[0034] F3:5 '-CAGCCGCGGTAATACAGAG-3 '
[0035] B3:5 '-GCCACTGGTGTTCCTTCC-3 '
[0036] FIP:5 '-GCCCGGGGATTTCACATCCAACGGTGCGAGCGTTAATCGG-3 '
[0037] BIP:5 '-ACTGCATCCAAAACTGGCGAGCGCATTTCACCGCTACACAGG-3 '。
[0038] 实施例2 LAMP引物对菊苣假单胞菌的特异性扩增 [0039] 一、实验材料
[0040] 以菊苣假单胞菌(菌株编号为Pc-Gd-3,该菌株已在GenBank上公开，其16Sr RNA的 登录号为KU923372)、茄科青枯菌（菌株编号为SSf-4,该菌株已在GenBank上公开，其16Sr RNA的登录号为FJ744124)、黑腐果胶杆菌（菌株编号为Pl，该菌株已在GenBank上公开，其 165『1?熟的登录号为1(〇695819)、？6(31：(^&(^61'；[11111。&1'01：0￥01'111118油8。.13瓜8；[1丨61186(菌株 编号为Pcb-Z j-Ι，该菌株的16Sr RNA序列已在国际基因库上登录http:// www.ncbi · nlm.nih.gov，登录号KX377593)为材料。
[0041 ]菊苣假单胞菌LAMP检测试剂盒包括以下组分:实施例1中设计的LAMP引物组、LAMP 反应液、酶溶液和核酸荧光染料。
[0042] 2 X LAMP反应液（荣研生物科技（中国）有限公司产品）包含如下组分：Tr i s-HCl (ρΗ8·8)浓度为 40mM、KCl 浓度为 20mM、MgS〇4 浓度为16mM、（NH4)2S〇4 浓度为 20mM、0.2% Tween20(v/v)、Betaine浓度为1.6M、dNTPs浓度为2.8mM。
[0043] 酶溶液(荣研生物科技（中国）有限公司产品）为Bst DNA聚合酶。
[0044] 核酸荧光染料(荣研生物科技（中国）有限公司产品）为LQOpanip?荧光目视检测试 剂。
[0045] 二、实验方法
[0046] (1)基因组DNA提取:方法按照细菌基因组DNA提取试剂盒进行；
[0047] (2)配制环介导等温扩增(LAMP)反应混合物，包括基因组DNA IyL、2 X LAMP反应液 12.5yL、浓度为20μΜ引物FIP和BIP各3yL、浓度为ΙΟμΜ引物F3和B3各lyL、Bst DN聚合酶lyL、 Loopmnp?荧光目测反应液IyL以及去离子水1.5yL;
[0048] (3)环介导等温扩增(LAMP)反应条件:反应温度为63 °C恒温Ihour，95 °C恒温2min;
[0049] (4)反应结束后观察PCR管中反应液颜色是否有变化，根据反应液颜色变化做出判 定，并拍照。
[0050] 三、实验结果与分析
[0051] 如图1所示，应用本发明的方法，以1此菊苣假单胞菌基因组DNA为模板，可成功使 各LAMP反应液颜色呈绿色，而以前科青枯菌侵染、黑腐果胶杆菌以及Pectobacterium carotovorum subsp.brasiliense菌的基因组DNA为模板的LAMP反应液颜色呈橘红色(见图 1)，说明本发明所述的试剂盒和检测方法对菊苣假单胞菌具有很好的特异性。
[0052]实施例3:对菊苣假单胞菌检测的敏感度测定
[0053] 一、实验材料
[0054]以菊苣假单胞菌为材料。
[0055] 菊苣假单胞菌LAMP检测试剂盒同实施例2。
[0056] 二、实验方法
[0057] (1)基因组DNA提取:方法按照细菌基因组DNA提取试剂盒进行；
[0058] (2)取上述基因组DNAlOyL于PCR管中作为模板母液，将模板母液分别稀释HT1，10 -2，10-3，10-4，10-5，10- 6，10-7倍，从各梯度稀释液中取IyL作为模板；
[0059] (3)配制环介导等温扩增(LAMP)反应混合物，包括各梯度稀释液DNAlyL、2 X LAMP 反应液12.5yL、浓度为20μΜ引物FIP和BIP各3yL、浓度为ΙΟμΜ引物F3和B3各lyL、Bst DN聚合 酶lyL、Loopamp?荧光目测反应液IyL以及去离子水1 · 5yL;
[0060] (4)环介导等温扩增(LAMP)反应条件:反应温度为63°C恒温lhour，95°C恒温2min;
[0061] (5)结果鉴定
[0062] 反应结束后，观察PCR管中反应液颜色是否有变化，根据反应液颜色变化做出判 定，并拍照；
[0063] 如图2所示，应用本发明的方法，以UiL母液以及10'10'10'10'和1(^倍稀释 液为模板的LAMP反应液均呈绿色，I(T 6和I(T7倍稀释液为模板的和阴性对照LAMP反应液为 橘红色。
[0064] (6)PCR 反应
[0065] 配制PCR反应体系，25yL反应体系包括各梯度稀释液DNA lyL，Premix Taq(dNTP Mixture 0.4mM，TaKaRa Taq 0.05UAiL，Mg2+3mM)12.5yL、浓度分别为ΙΟμΜ的菊苣假单胞菌 的特异引物肚？1&(5 /-〇^1'1^厶1^61^厶1^6厶0：1'-3/)和!1印2&(5/-(^61^〇^〇厶了6厶1'(^6661'-3')各IyL，加灭菌的双蒸水9.5yL至总体积为25yL;
[0066] PCR反应条件为：94°C预变性4min，94°C变性45s、55°C退火45s、72°C延伸90s，35个 循环，72°C最终延伸10min。
[0067] (7)结果鉴定
[0068] PCR反应结束后，取各反应产物IOyL分别点样于质量体积百分比(w/v)为1%琼脂 糖凝胶的点样孔中，进行电泳，120V恒压电泳25min;在凝胶成像系统中观察，并拍照;根据 电泳结果做出判定。
[0069] 电泳结果如图3所示，泳道1:标准分子量（100bp Ladder Marker);泳道2-8:母液、 10-1、10-2、10-3、10- 4、10-5、10-6和 10-7;泳道9:阴性对照。分别以母液、10-1、10-2、10- 3和 10-4倍 稀释液为模板，可成功地扩增到预期大小为897bp的特异目的片段，这些片段大小与预期片 段大小一致，10- 5、10-6和KT7倍稀释液和阴性对照均未扩增出特异条带。
[0070] 由图2图3相比可知，LAMP检测鉴定菊苣假单胞菌的敏感度比PCR反应扩增鉴定菊 苣假单胞菌的敏感度高10倍。
[0071] 实施例4对未知番茄病样的检测与鉴定
[0072] 一、实验材料
[0073] 以田间采集的10株疑似髓部坏死病番茄植株为材料。
[0074] 菊苣假单胞菌LAMP检测试剂盒同实施例2。
[0075]二、实验方法
[0076]对采集到的10株病株进行取样并进行编号。检测鉴定所采用的方法同实施例2所 用方法相同，并用PCR方法加以比较验证，PCR所采用的方法同实施例3所用方法相同。
[0077] 三、实验步骤
[0078] (1)基因组DNA提取:方法按照细菌基因组DNA提取试剂盒进行；
[0079] (2)配制环介导等温扩增(LAMP)反应混合物，包括（1)所述基因组DNAlyL、2 X LAMP 反应液12.5yL、浓度为20μΜ引物FIP和BIP各3yL、浓度为ΙΟμΜ引物F3和B3各lyL、Bst DN聚合 酶lyL、Loopamp?荧光目测反应液IyL以及去离子水1 · 5yL;
[0080] (3)环介导等温扩增(LAMP)反应条件:反应温度为63°C恒温lhour，95°C恒温2min;
[0081 ] (4)反应结束后观察PCR管中反应液颜色是否有变化，根据反应液颜色变化做出判 定，并拍照。
[0082] (5)PCR验证：采用对应量的DNA模板，以菊苣假单胞菌的特异引物HrplaW- CCGTTCATCGTCATCGACCT-3')和HrpSaG' -CTGTCCCACATGATCTGGGT-3')进行PCR验证。
[0083] PCR反应体系为25yL，包含（1)所述基因组DNA lyL，Premix Taq(dNTP Mixture各 0.4mM，TaKaRa TaqO.05U/yL，Mg2+浓度为3mM) 12.5yL、浓度分别为ΙΟμΜ的菊苣假单胞菌的特 异引物Hrpla和Hrp2a各lyL，加灭菌的双蒸水9.5yL至总体积为25μΙ^ΡΟ?反应条件为：94°C 预变性4min，94°C变性45s、55°C退火45s、72°C延伸9〇8,35个循环，72°(：最终延伸1〇1^11。？0? 反应结束后，取各反应产物1〇此分别点样于质量体积百分比为(w/v)l%琼脂糖凝胶的点样 孔中，进行电泳，120V恒压电泳25min;在凝胶成像系统中观察，并拍照;根据电泳结果做出 判定。
[0084]四、实验结果与分析
[0085] 如图4所示，采用LAMP检测方法，对10份疑似病样进行检测，结果如图4,疑似病样1 号、4号、5号、6号、7号、8号和9号为阳性，2号、3号和10号为阴性;进一步用PCR验证，检测结 果与LAMP检测结果一致，二者符合率100%。
[0086] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本方面的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任务未背离本方明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种利用LAMP技术检测菊宦假单胞菌的引物组，其特征在于:包括一对外侧引物F3 和B3 W及一对内侧引物FIP和BIP，其核巧酸序列如下所示： F3:5 '-CAGCCGCGGTAATACAGAG-3， B3:5 '-GCCACTGGTGTTCCTTCC-3 ' 巧P: 5 ' -GCCCGGGGATTTCACATCCAACGGTGCGAGCGTTMTCGG-3， BIP:5 '-ACTGCATCCAAAACTGGCGAGCGCATTTCACCGCTACACAGG-3 '。2. -种利用LAMP技术检测菊宦假单胞菌的试剂盒，其特征在于:包括权利要求1所述的 引物组。3. 根据权利要求2所述的利用LAMP技术检测菊宦假单胞菌的试剂盒，其特征在于:还包 含W下组分:LAMP反应液、酶溶液和核酸巧光染料。4. 根据权利要求3所述的利用LAMP技术检测菊宦假单胞菌的试剂盒，其特征在于:所述 的LAMP反应液包含如下组分：p服.8的T ris-HCl 40mM、KCl 20mM、MgS〇4 16mM、（NH4)2S〇4 20mM、Tween-20 0.2%(v/v)、甜菜碱 1.6M、dNTPs 2.8mM; 所述的酶溶液为Bst DM聚合酶，洲AiL; 所述的核酸巧光染料为Loopamp?巧光目视检测试剂。5. -种利用LAMP技术检测菊宦假单胞菌的方法，其特征在于包含W下步骤： W待测样品的基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的引物组或权利要求2~4任一项 所述的试剂盒进行LAMP扩增反应;反应结束后观察LAMP扩增反应液颜色变化，如反应液为 绿色的浑浊液体，即判断为阳性反应;如反应液为澄色透明液体，即判断为阴性反应。6. 根据权利要求5所述利用LAMP技术检测菊宦假单胞菌的方法，其特征在于：所述的 LAMP扩增反应的反应体系为25化反应体系，包括DNA模板化L、2 X反应缓冲液12.5化、浓度 为20μΜ引物FIP和BIP各化L、浓度为ΙΟμΜ引物F3和B3各化L、Bst DN聚合酶化L、L00阱mp? 巧光目测反应液化LW及去离子水1. 所述的LAMP扩增反应的条件为63°C恒溫条件下，扩增反应lh，95°C恒溫2min使酶失活。7. 权利要求1所述的引物组在植物菊宦假单胞菌检测领域中的应用。8. 权利要求2~4任一项所述的试剂盒在植物菊宦假单胞菌检测领域中的应用。
【文档编号】C12N15/11GK106086207SQ201610598755
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月26日 公开号201610598755.5, CN 106086207 A, CN 106086207A, CN 201610598755, CN-A-106086207, CN106086207 A, CN106086207A, CN201610598755, CN201610598755.5
【发明人】佘小漫, 何自福, 汤亚飞, 蓝国兵
【申请人】广东省农业科学院植物保护研究所