一种检测jak2 v617f基因突变的引物及其方法
【专利摘要】本发明公布了一种检测JAK2V617F基因突变的引物，其中引物包括用于扩增JAK2V617F的正常序列内引物JAK2WF、突变序列内引物JAK2MF、正常序列和突变序列的反向引物JAK2WR、封闭引物JAK2WF?P，并将该引物对JAK2V617F基因突变列进行荧光定量PCR反应。本发明所述的JAK2V617F基因突变的检测方法相对于现有技术的检测方法检测灵敏度提高，远远高于20％，且检测方法简单，成本低廉，报告周期短，适用于一般筛查。
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因检测方法，具体涉及一种检测JAK2 V617F基因突变的引物及其方 法。 一种检测JAK2 V617F基因突变的引物及其方法
【背景技术】
[0002] 骨髓增殖性疾病(Myeloproliferative Disorder，MPD)是一系或多系分化相对成 熟的骨髓细胞不断的克隆性增殖所致的一组肿瘤性疾病的统称，其中以真性红细胞增多症 (Polycythemia Vera，PV)、原发性血小板增多症（Essential Thrombocythemia，ET)、骨髓 纤维化(Myelof ibros is，MF)最为常见。
[0003] JAK2与JAK1、JAK3和TYK2同属于JAK家属，为非受体型即细胞内激酶。V617F突变位 于JAK2的JH2假激酶区，此与该激酶活性的抑制有关。V617F突变导致JAK2持续激活，导致不 受控制的细胞持续增殖从而导致MPD的发生。世界卫生组织于2008年将JAK2 V617F基因突 变列为骨髓增殖性疾病的主要确诊指标之一。
[0004] JAK2(Janus Tyrosine Kinase 2)V617F基因突变常见于PV、MF和ET中。目前的研 究报道表明，JAK2 V617F(c.l849G>T)的突变率在PV中约为65%~97%、ET中约为23%~ 57%、MF中约为35%~57%。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是:现有JAK2 V617F基因突变序列的检测方法是测序 和定量PCR，测序检测灵敏度低，检测下限只有20%，而定量PCR检测，需要采用特定的实验 仪器，检测成本高。现提供一种检测JAK2 V617F基因突变的引物及其方法。解决了现有检 测方法检测灵敏度低、准确度低等技术缺陷。
[0006] 本发明的通过下述技术方案实现：
[0007] 一种检测JAK2 V617F基因突变的引物，包括用于扩增JAK2 V617F的正常序列内引 物JAK2 WF、突变序列内引物JAK2 MF、正常序列和突变序列的反向引物JAK2 WR、封闭引物 JAK2 WF-P，各引物的核苷酸序列为：
[0008] JAK2 WF ：
[0009] ATCTGCTACAGTACTGCGTAGCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATGTG
[0010] JAK2 MF：
[0011] GCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATGAT
[0012] JAK2 WR:
[0013] ACTGACACCTAGCTGTGATCCTG
[0014] JAK2 WF-P：
[0015] ATCTGCTACAGTACTGCGTAGCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATGTG-P。
[0016] 现有的对于JAK2 V617F基因突变的检测方法是直接测序和定量PCR，测序是指直 接对JAK2 V617F的某一段进行测序，确定突变点，该检测方法灵敏度低，检测下限不超过 20% ο
[0017] 发明人经过大量实验研究设计：引物JAK2 WF，用于对正常序列JAK2 V617F进行扩 增，并作为内参。引物JAK2 MF，针对突变序列(G>T)，由于将最后碱基G换成T造成正常序列 里没有突变基因也会扩增，故将jak2 MF的最后两个碱基进行改变，该突变序列的内引物 JAK2 MF可高度特异性扩增突变序列。
[0018] 反向引物JAK2 WR为正常序列和突变序列共用。
[0019] 封闭引物JAK2 WF-P的采用，可进一步增加检测的灵敏度，该封闭引物在突变反应 体系中特异性的封闭正常序列，从而使突变序列获得更好的扩增。如此突变序列的引物就 可特异性的扩增突变序列，正常序列中则不会出现突变条带。
[0020] 本发明技术方案中封闭引物JAK2 WF-P加入到正常序列中，能结合没有突变的序 列，从而使检测体系中突变序列扩增比例相对增高，提高整个检测的灵敏度和准确度。
[0021] 本发明还提供了一种JAK2 V617F基因突变的检测方法，包括以下步骤：
[0022] 1)提取受试者的骨髓、外周血或组织的基因组DNA;
[0023] 2)以受试者骨髓或外周血的基因组DNA为模板，使用权利要求1所述的正常序列内 引物JAK2 WF、突变序列内引物JAK2 MF、正常序列和突变序列的反向引物JAK2 WR、封闭引 物JAK2 WF-P进行扩增；
[0024] 3)对步骤2)的扩增反应获得的扩增条带，分别进行测序。
[0025] 进一步地，为了更好的实现本发明，所述扩增方法为PCR扩增。
[0026] 进一步地，为了更好的实现本发明，PCR扩增反应具体操作方法为：
[0027] 1)将检测样本DNA稀释至100ug/ml;
[0028] 2)在PCR反应管中加入ddH20、Taq PCR Mastermix、引物工作液制备PCR反应体系， 离心；
[0029] 3)在PCR反应管中加入检测样本后稀释至lOOng/yL样本DNA模板；
[0030] 4)震荡混匀，转移至PCR仪上进行扩增反应。
[0031]本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
[0032] (1)本发明在检测突变序列中加入正常序列的封闭引物jak2 WF-P，该封闭引物能 结合没有突变的序列，从而使检测突变体系中突变序列的比例相对增高，从而提高检测 JAK2 V617F基因突变的灵敏度和准确度。
[0033] (2)本发明所采用的检测方法相对于一般的采用定量PCR和测序方法不同，本发明 引入竞争性抑制物封闭引物，可提高检测灵敏度高于20%，满足初诊患者，成本低，且本发 明所述的检测方法操作简单、成本低廉、报告周期短、适用于一般筛查。
【附图说明】
[0034] 此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部 分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：
[0035]图1为本发明实施例1中阳性样本a管的扩增条带图；
[0036]图2为本发明实施例1中阳性样本b管的扩增条带图；
[0037] 图3为本发明实施例1中灵敏度检测结果图；
[0038] 图4为本发明实施例1中野生型序列扩增结果图；
[0039] 图5为本发明实施例1中突变型序列扩增结果图；
[0040] 图6为本发明检测JAK2 V617F基因突变方法的结构示意框图。
【具体实施方式】
[0041] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本 发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作 为对本发明的限定。
[0042] 实施例1:
[0043] 一种检测JAK2 V617F基因突变的引物，包括用于扩增JAK2 V617F的正常序列引物 JAK2 WF、突变序列引物JAK2 MF、正常序列和突变序列的反向引物JAK2 WR、封闭引物JAK2 WF-P，各引物的核苷酸序列为：
[0044] JAK2 WF ：
[0045] ATCTGCTACAGTACTGCGTAGCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATGTG
[0046] JAK2 MF ：
[0047] GCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATGAT
[0048] JAK2 WR：
[0049] ACTGACACCTAGCTGTGATCCTG
[0050] JAK2 WF-P：
[0051 ] ATCTGCTACAGTACTGCGTAGCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATGTG-P。
[0052]其中，正常序列的封闭引物JAK2 WF-P，加入到检测突变的体系中，该封闭引物能 结合没有突变的序列，而从使体系中突变序列相对比例相对增高，从而提高检测的灵敏度 和准确度。
[0053] 一种JAK2 V617F基因突变的检测方法:将实施例1中的引物序列对JAK2 V617F基 因突变列进行PCR扩增反应。
[0054]本实施例所述的检测方法主要检测JAK2编码序列的1849位点上由G到T的突变。因 而在设计引物时，采用的对照就是没有突变的序列:GCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATGTG，而 JAK2突变序列中由序列最后一位的G变成T，我们在设计突变引物时，把最后两个碱基都换 掉，序列为:GCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATGAT，此引物可特异的扩增出突变基因。其中设计 的JAK2 WF-P为正常引物最后一个碱基磷酸化:GCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATGTG-p，该引 物可特异结合到正常序列上不会扩增，且此序列不会结合到突变序列上。因此突变序列引 物能特异性的扩增突变序列，而正常人中就不会出现突变条带。
[0055]具体操作方法为，如图6所示：
[0056] 1)提取受试者的骨髓、外周血或组织的基因组DNA;
[0057] 2)以受试者骨髓或外周血的基因组DNA为模板，使用权利要求1所述的正常序列内 引物JAK2 WF、突变序列内引物JAK2 MF、正常序列和突变序列的反向引物JAK2 WR、封闭引 物JAK2 WF-P进行扩增；
[0058] 3)对步骤2)的扩增反应获得的扩增条带，分别进行凝胶电泳。
[0059]其中PCR扩增反应操作步骤为：
[0060] 1、标本制备区使用检测样本DNA稀释至100yg/mL;
[0061 ] 2、从试剂储备区取出Taq PCR Mastermix(天根生物），ddH20和引物工作液，低速 离心IOs;
[0062] 3、反应体系配制；
[0063] 反应体系配制表
[0065] 4、震荡混匀，短暂离心后，分装20μ1至标记好的PCR反应管，转移至标本制备区；
[0066] 5、向分装好的PCR反应管中加入5μ1稀释后稀释至IOOngAiL样本DNA模板；
[0067] 6、盖好PCR反应管管盖后，震荡混匀，短暂离心，转移至PCR仪。
[0068]其中，PCR扩增反应具体操作方法为：
[0069] 步骤 1:95°C 预变性 2min;
[0070] 步骤 2:95 Γ 变性 5s;
[0071] 步骤 3:6(TC 退火 30s;
[0072] 步骤 4:72Γ 延伸 30s;
[0073] 步骤5:循环步骤2-4,35次；
[0074] 步骤 6:72。(：延伸1〇11^11。
[0075] 扩增反应结果：如图1、图2所示，阳性样本a管、b管都有扩增带，a管带为野生型 162bp，b管带为突变型扩增142bp，阴性样本只有野生型条带a管有扩增，可见扩增结果特异 性高。
[0076] 对阳性样本a管和b管的扩增条带进行测序，结果显示，a管和b管的扩增条带分别 正常的JAK2和突变JAK2的部分序列。将测序结果与NCBI(Homo sapiens Janus kinase 2 (JAK2)，RefSeqGene on chromosome 9Sequence ID:ref|NG_0〇99〇4.l|Length:149939)上 结果进行序列比对。结果显示，扩增片段与参考序列完全一致。
[0077]其中，图4为野生型序列扩增结果，与参考序列完全一致；图5为突变序列，与参考 序列有两个碱基不同，见引物设计，与预期相同。其中，图4、图5显示部分测序结果。
[0078]本实施例所述的JAK2 V617F基因突变的检测方法为：
[0079] (1)电泳前准备:在电泳前确保所有的电泳用具为清洁干燥的，若电泳前电泳用具 较脏可用洗涤剂清洁再用II级水冲洗干净。
[0080] (2)琼脂糖凝胶制备琼脂糖凝胶的配制:称取足量的琼脂糖，放入200ml的锥形瓶， 加入一定量的TBE缓冲液，在微波炉中以中高火加热中高火3min或煮沸后至溶液澄清，室温 冷却至65°C，倒入另一100mL锥形瓶，加入适量DD核酸染料，倒胶，然后插入齿梳，室温冷却 10-15min后即可使用。
[0081 ] (3)点样和电泳：吸取5ul扩增产物点样至凝胶孔内，盖上电泳槽盖，以185V电泳 45min〇
[0082] 本检测采用PCR后琼脂糖凝胶电泳对标本条码号为2315231450、2314600796、 2315244749进行检测，检测灵敏度以最低检测下限（LOD)代替，检测结果：如表6,本实验检 测灵敏度为:5%突变型;DNA浓度>10ng/ul，DNA量输入范围>50ng，可保证突变样本检测结 果一致。
[0083] 表6 JAK2 V617检测灵敏度结果
[0086]检测结果：如图3所示，在突变JAK2的含量低至0.5%时，可检测到JAK2突变条带， 灵敏度高，且DNA浓度低至5ng/ul时，仍可检测出突变。
[0087]准确度的检测：
[0088]对标本号2314346686、2314214965、2313183578、2314376660、2314198499、 2314198497、2315244749、2314600796、2315190409、2315231450、2314467891、2314650882、 2315162691、2315006446、2315006445、2314719491、2315310714、2315290221、2315231450、 2315229846、2314650910、2315307221、2315081322、2314719618、2314719709、2315288336、 2315252562、2315133418、2315335127、2314628299、2314661522、2314744343进行准确度检 测：
[0089]检测结果:如下表7所示，
[0092] 检测结果:准确度100 %。
[0093]本实施例所述的JAK2 V617F基因突变的检测方法相对于现有技术的检测方法检 测灵敏度提高，远远高于20%，且检测方法简单，成本低廉，报告周期短，适用于一般筛查。
[0094]以上所述的【具体实施方式】，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步 详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的【具体实施方式】而已，并不用于限定本发明 的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包 含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种检测JAK2V617F基因突变的引物，其特征在于：包括用于扩增JAK2V617F的正常 序列内引物JAK2WF、突变序列内引物JAK2MF、正常序列和突变序列的反向引物JAK2WR、封闭 弓丨物JAK2WF-P，各引物的核苷酸序列为： JAK2WF： ATCTGCTACAGTACTGCGTAGCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATGTG JAK2MF： GCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATGAT JAK2WR： ACTGACACCTAGCTGTGATCCTG JAK2WF-P： ATCTGCTACAGTACTGCGTAGCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATGTG-P。2. -种JAK2V617F基因突变的检测方法，其特征在于:包括以下步骤， 1) 提取受试者的骨髓、外周血或组织的基因组DNA; 2) 以受试者骨髓或外周血的基因组DNA为模板，使用权利要求1所述的正常序列内引物 JAK2WF、突变序列内引物JAK2MF、正常序列和突变序列的反向引物JAK2WR、封闭引物 JAK2WF-P进行扩增； 3) 对步骤2)的扩增反应获得的扩增条带，分别进行测序。3. 根据权利要求2所述的一种JAK2V617F基因突变的检测方法，其特征在于:采用的扩 增方法为PCR扩增。4. 根据权利要求3所述的一种JAK2V617F基因突变的检测方法，其特征在于:所述PCR扩 增反应具体操作方法为： 1) 将检测样本DNA稀释至100ug/ml; 2) 在PCR反应管中加入ddH20、Taq PCR Mastermix、引物工作液制备PCR反应体系，离 心； 3) 在PCR反应管中加入检测样本后稀释至100ng/yL样本DNA模板； 4) 震荡混匀，转移至PCR仪上进行扩增反应。
【文档编号】C12N15/11GK106086204SQ201610553215
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月14日
【发明人】黄平, 周炜, 欧阳小峰, 彭宇
【申请人】四川金域医学检验中心有限公司