一种包括血清长链非编码rna h19的慢性心力衰竭患者早期诊断的制剂的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种慢性心力衰竭患者早期诊断的制剂，属于心血管分子生物学领域。该制剂包括序列结构如SEQ NO.1所示的血清长链非编码RNA H19和实时荧光定量PCR检测试剂。本发明制剂只需从人群外周血血清中提取RNA即可检测lncRNA H19表达水平，从而对慢性心力衰竭患者做出早期、快速的无创性诊断，操作简单，稳定性好。本方法不仅可用于慢性心力衰竭患者的早期诊断，而且可以用于慢性心力衰竭患者的患病风险的预测，为慢性心力衰竭患者的早期诊断和预测提供了强有力的技术支持，具有深远的临床意义和推广价值。
【专利说明】
一种包括血清长链非编码RNA H19的慢性心力衰竭患者早期 诊断的制剂
技术领域
[0001] 本发明涉及一种慢性心力衰竭患者早期诊断的制剂，尤其涉及一种包括血清长链 非编码RNA H19的慢性心力衰竭患者早期诊断的制剂，属于心血管分子生物学领域。
【背景技术】
[0002] 慢性心力衰竭是各种心血管疾病发展到严重阶段的临床综合征，主要病理生理特 征为心脏收缩和/或舒张功能障碍，导致心脏栗血功能低下，是威胁人类健康最重要的疾病 之一。目前为止，尽管针对心力衰竭的防治措施已经取得了一定的进展，但其发病率和死亡 率仍居高不下，因此，需要寻找新的、更为有效的诊断及预后评估方法。
[0003] 长链非编码RNA(long non-coding RNA,IncRNA)是一类新发现的在多种生物进程 中起重要调控作用的非编码RNA，可以在转录、转录后及表观遗传学水平等多个层面上发挥 基因调控作用。近年来研究表明，IncRNAs在高血压、冠心病、动脉粥样硬化等心血管疾病中 都能起到重要的调控作用。最近我们发现，IncRNA H19在心力衰竭大鼠心肌组织和血清中 表达均有明显上调;通过构建H19过表达腺相关病毒载体，在心肌细胞肥大模型和病理性心 肌肥厚大鼠模型中均证实，IncRNA H19表达升高具有抑制心肌肥厚、改善心功能的作用。进 一步通过检测心力衰竭患者发现，IncRNA H19水平在心力衰竭患者有明显升高，并且与左 室射血分数呈反比；ROC诊断曲线显示，IncRNA H19作为心力衰竭诊断标志物具有较高的诊 断敏感性和特异性。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是针对现有技术中存在的上述问题，提出了一种具有较高的诊断敏 感性和特异性的包括血清长链非编码RNA H19的慢性心力衰竭患者早期诊断的制剂。
[0005] 本发明的目的可通过下列技术方案来实现:一种包括血清长链非编码RNA H19的 慢性心力衰竭患者早期诊断的制剂，所述制剂包括血清长链非编码RNA H19,其序列结构如 SEQ NO. 1 所示。
[0006] 本发明利用血清长链非编码RNA H19(定位于染色体llpl5.5，GeneBank登陆号NR_ 002196)作为心力衰竭早期诊断的标志物，该血清长链非编码RNA H19全长2.3kb，序列结构 如SEQ NO. 1所示，表达上调与心肌组织验证结果具有一致性，且检验结果的敏感性高，特异 性好。
[0007] 在上述的一种包括血清长链非编码RNA H19的慢性心力衰竭患者早期诊断的制剂 中，所述制剂还包括实时荧光定量PCR检测试剂。
[0008] 在上述的一种包括血清长链非编码RNA H19的慢性心力衰竭患者早期诊断的制剂 中，所述实时荧光定量PCR检测试剂包括血清长链非编码RNA H19的特异性引物和内参照U6 snRNA的特异性引物。
[0009] 在上述的一种包括血清长链非编码RNA H19的慢性心力衰竭患者早期诊断的制剂 中，所述血清长链非编码RNA H19的特异性引物包括血清长链非编码RNA H19正向引物和血 清长链非编码RNA H19反向引物。
[0010] 在上述的一种包括血清长链非编码RNA H19的慢性心力衰竭患者早期诊断的制剂 中，所述血清长链非编码RNA H19正向引物的序列如SEQ NO. 2所示。
[0011] 在上述的一种包括血清长链非编码RNA H19的慢性心力衰竭患者早期诊断的制剂 中，所示血清长链非编码RNA H19反向引物的序列如SEQ NO. 3所示。
[0012]在上述的一种包括血清长链非编码RNA H19的慢性心力衰竭患者早期诊断的制剂 中，所述内参照U6 snRNA的特异性引物包括内参照U6 snRNA正向引物和内参照U6 snRNA反 向引物。
[0013]在上述的一种包括血清长链非编码RNA H19的慢性心力衰竭患者早期诊断的制剂 中，所述内参照U6 snRNA正向引物的序列如SEQ NO.4所示。
[0014] 在上述的一种包括血清长链非编码RNA H19的慢性心力衰竭患者早期诊断的制剂 中，所述内参照U6 snRNA反向引物的序列如SEQ NO.5所示。
[0015] 在上述的一种包括血清长链非编码RNA H19的慢性心力衰竭患者早期诊断的制剂 中，所述的实时荧光定量PCR检测试剂中还可以包括PCR反应常用试剂，如Taq酶、逆转录酶、 缓冲液、dNTPs、MgCl 2 等。
[0016] 与现有技术相比，本发明制剂只需从人群外周血血清中提取RNA即可检测IncRNA H19表达水平，从而对慢性心力衰竭患者做出早期、快速的无创性诊断，操作简单，稳定性 好。本方法不仅可用于慢性心力衰竭的早期诊断而且可以用于慢性心力衰竭患者的患病风 险的预测，为慢性心力衰竭的早期诊断和预测提供了强有力的技术支持，具有深远的临床 意义和推广价值。
【附图说明】
[0017] 图1为实时荧光定量PCR分析血清IncRNA H19在慢性心力衰竭心肌组织与正常心 肌组织中的表达差异；
[0018] 图2为实时荧光定量PCR分析血清IncRNA H19在慢性心力衰竭患者与正常人中的 表达差异；
[0019] 图3为扩大样本量后，实时荧光定量PCR分析血清IncRNA H19在慢性心力衰竭患者 与正常人中的表达差异；
[0020] 图4为ROC分析血清IncRNA H19对慢性心力衰竭早期诊断的特异性和敏感性。
【具体实施方式】
[0021]以下是本发明的具体实施例，并结合【附图说明】对本发明的技术方案作进一步的描 述，但本发明并不限于这些实施例。下述实施例中所述试验方法，如无特殊说明，均为常规 方法;所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得，或可常规方法制得。
[0022] 实施例1:
[0023] 实时荧光定量PCR法检测发现I ncRNAH 19在慢性心力衰竭患者心肌组织中表达升 尚。
[0024] 1.材料与方法
[0025] 从6例慢性心力衰竭患者和7例正常人心肌组织中抽提总RNA，Iyg RNA经逆转录成 cDNA后，进行实时荧光定量PCR检测。
[0026] 血清IncRNA H19正向引物序列如SEQ N0·2所示：5'-TCCCAGAACCCACAACATGAAA- 3，。
[0027] 血清lncRNAH19反向引物序列如SEQN0·3所示：5'-CACCTTCCAGAGCCGATTCC-3'。
[0028] 用于内参照的U6snRNA正向引物序列如SEQN0.4所示：5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'。
[0029] 用于内参照的U 6 s n R N A反向引物序列如S E Q N 0 . 5所示：5 ' -GGAACGCTTCACGAATTTG-3'。
[0030] 实时荧光定量PCR反应体系为(PCR检测方法是两个独立反应分别检测Η19和内参 照U6 snRNA的表达，因此下面的正向引物和反向引物分别为各自反应中所使用的特异性引 物)： SYBR Green PCR Master Mix (2χ) 5 μ I
[0031] - 特异性正向引物（10 μΜ) 0.125 μL 特异性反向引物（10 μΜ) 0.125 μL 无酶水 .2.75 μL
[0032] cDNA 产物 2 μL 总计 1〇μ1
[0033] 实时荧光定量PCR反应程序 50 0C 95 0C 9 5 0C
[0034] 60 C 95 〇C 60 C 95 0C
[0035]反应结束，确认实时荧光定量PCR的扩增曲线和熔解曲线后，根据CT值用内参基因 U6 snRNA标化后计算lncRNAH19的相对定量值，比较慢性心力衰竭患者与正常人心肌组织 lncRNAH19表达的差异。结果为:如图1所示，慢性心力衰竭患者心肌组织中lncRNAH19表达 水平较正常心肌组织有明显升高(P = 〇. 026)。
[0036] 实施例2:
[0037] 实时荧光定量PCR法检测发现血清lncRNAH19表达在慢性心力衰竭患者中明显升 尚。
[0038] 1.材料与方法
[0039] 将预先收集的上述6例慢性心力衰竭患者和7例正常人的外周血血清样本置于冰 上备用。血清采集过程如下，使用BD真空采血管(肝素抗凝)收集慢性心力衰竭患者和正常 人的空腹静脉血约5mL，室温静置30分钟后，于4°C、1600g离心10分钟。小心将上层血清转移 分装至新的1.5mL离心管中，-80°C冻存备用。
[0040] 利用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(Qiagen,#55114)(此试剂盒为商品 化的RNA提取试剂盒，产自Qiagen公司)试剂盒抽提血清中总RNA，具体步骤如下：
[0041 ] Sl、吸取IOOyL蛋白酶K至50mL离心管中；
[0042] S2、吸取ImL血清溶液加入50mL离心管中；
[0043] S3、吸取800yL Buffer ACL加入50mL离心管中，涡旋震荡30s;
[0044] S4、将离心管置于60 °C水浴中孵育30分钟；
[0045] S5、向离心管中加入1.8mL Buffer ACB，涡旋震荡30s;
[0046] S6、将离心管置于冰上孵育5分钟；
[0047] S7、将溶液转移至预先组装好的真空抽吸栗中，待全部液体通过mini柱后，关闭真 空栗，将压力释放至〇，弃去延长管；
[0048] S8、吸取600yL Buffer ACWl到mini柱，维持mini柱盖子打开状态，打开真空栗，待 全部液体通过mini柱后，关闭真空栗，将压力释放至0;
[0049] S9、吸取750yL Buffer ACW2到mini柱，维持mini柱盖子打开状态，打开真空栗，待 全部液体通过mini柱后，关闭真空栗，将压力释放至0;
[0050] SlO、吸取750yL无水乙醇到mini柱，维持mini柱盖子打开状态，打开真空栗，待全 部液体通过mini柱后，关闭真空栗，将压力释放至0;
[0051 ] Sll、关闭mini柱的盖子，将mini柱卸下，弃去连接器，将mini柱放到干净的2mL收 集管，20000g离心3分钟；
[0052] S12、将mini柱放到一个新的2mL收集管中，打开管盖，置于56°C水浴中孵育10分 钟，直至mini膜完全干燥；
[0053] S13、将mini柱放到一个新的1 · 5mL洗脱管，加入20yL Buffer AVE至mini膜中央位 置，关上管盖，室温孵育3分钟；
[0054] S14、20000g离心1分钟，收集的溶液即为总RNA。
[0055] 将Iyg RNA逆转录成cDNA后，进行实时荧光定量PCR检测。
[0056] 血清IncRNA H19正向引物序列如SEQ N0·2所示：5'-TCCCAGAACCCACAACATGAAA- 3，。
[0057] 血清lncRNAH19反向引物序列如SEQN0·3所示：5'-CACCTTCCAGAGCCGATTCC-3'。
[0058] 用于内参照的U6snRNA正向引物序列如SEQN0.4所示：5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'。
[0059] 用于内参照的U 6 s n R N A反向引物序列如S E Q N 0 . 5所示：5 ' -GGAACGCTTCACGAATTTG-3'。
[0060] 实时荧光定量PCR反应体系为(PCR检测方法是两个独立反应分别检测Η19和内参 U6 snRNA的表达，因此下面的正向引物和负向引物分别为各自反应中所使用的特异性引 物)： SYBR Green PCR Master Mix (2χ) 5 μL 特异性正向引物（10 μΜ) 0.125 μL 特异性反向引物（10 μΜ) 0,125 μL
[0061] 无酶水 2.75 μL cDNA 产物 .2 μL 总计 ：10μ1
[0062] 实时荧光定量PCR反应程序 50°C 2 min 950C 10 min 95 Γ 15 s · , . 40 循环
[0063] 6〇 G I min」 95 iG 15 s 60 C 15 S ?熔解曲线 95 V 15 s ·
[0064] 反应结束，确认实时荧光定量PCR的扩增曲线和熔解曲线后，根据CT值用内参基因 U6 SnRNA标化后计算H19的相对定量值，比较慢性心力衰竭患者和正常人血清IncRNA H19 表达的差异。结果为：如图2所示，血清IncRNA H19表达在慢性心力衰竭患者中较正常人有 明显升高（P = 〇. 018)。该结果与实施例1心肌组织中的检测结果相一致，说明检测血清 IncRNA H19的表达水平，即可判断该患者是否患有慢性心力衰竭。
[0065] 实施例3:
[0066] 通过扩大样本量，实时荧光定量PCR检测炎症血清IncRNA H19用于慢性心力衰竭 诊断的特异性和敏感性。
[0067] 1.材料与方法
[0068]使用BD真空采血管(肝素抗凝)收集100例慢性心力衰竭患者和100例正常人的空 腹静脉血约5mL，室温静置30分钟后，于4°C、1600g离心10分钟。小心将上层血清转移分装至 新的1 · 5mL离心管中，-80 °C冻存备用。
[0069] 米用实施例2中步骤，利用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(Qiagen，# 55114)(此试剂盒为商品化的RNA提取试剂盒，产自Qiagen公司）试剂盒抽提血清中总RNA。
[0070] 采用实施例2中步骤进行逆转录及实时荧光定量的方法检测IncRNA H19的表达。
[0071] 反应结束，确认实时荧光定量PCR的扩增曲线和熔解曲线后，根据CT值用内参基因 U6 snRNA标化后计算H19的相对定量值，比较慢性心力衰竭患者和正常人血清IncRNA H19 表达的差异。同时，通过ROC曲线分析利用血清IncRNA H19作为慢性心力衰竭诊断标志物的 特异性和敏感性。
[0072] 如图3所示，血清IncRNA H19表达在慢性心力衰竭患者中较正常人有明显升高(P = 0.026)。
[0073] 如图4的ROC曲线分析显示，血清IncRNA H19用于慢性心力衰竭诊断ROC曲线下方 的面积(Area under curve,AUC)可达0.95,特异性可高达86.1%，灵敏度可达96.7%。因 此，血清IncRNA H19能较好地用于慢性心力衰竭的早期诊断。
[0074] 本发明检测方法仅需要ImL血清便可用于IncRNA H19的表达水平检测，因而具备 较好的操作性。
[0075] 通过荧光定量分析发现IncRNA H19在6例慢性心力衰竭患者心肌组织和7例正常 人心肌组织中存在差异性表达(P = 0.026)(图1 )，进一步检测血清IncRNA H19发现，慢性心 力衰竭患者血清IncRNA H19表达与正常人的表达存在明显差异(P = 0.018)(图2)，且与心 肌组织中的检测结果一致。通过扩大样本量，在100例慢性心力衰竭患者和100例正常人中 检测血清IncRNA H19表达进一步验证发现，血清IncRNA H19表达在慢性心力衰竭患者和正 常人中有明显差异(P = 〇.021)(图3)，在慢性心力衰竭患者中表达升高。血清IncRNA H19用 于慢性心力衰竭诊断特异性可高达86.1 %，灵敏度可达96.7% (图4)。因此，本发明方法只 需从人群外周血血清中提取RNA即可检测IncRNA H19表达水平，从而对慢性心力衰竭患者 做出早期、快速的无创性诊断，操作简单，稳定性好。本方法不仅可用于慢性心力衰竭的早 期诊断而且可以用于慢性心力衰竭患者的患病风险的预测，为慢性心力衰竭的早期诊断和 预测提供了强有力的技术支持，具有深远的临床意义和推广价值。
[0076]本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领 域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种修改或补充或采用类似的方式替代，但并 不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
[0077]尽管对本发明已作出了详细的说明并引证了一些具体实施例，但是对本领域熟练 技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。
【主权项】
1. 一种包括血清长链非编码RNA H19的慢性心力衰竭患者早期诊断的制剂，其特征在 于，所述制剂包括血清长链非编码RNA H19,其序列结构如SEQ N0.1所示。2. 根据权利要求1所述的一种包括血清长链非编码RNA H19的慢性心力衰竭患者早期 诊断的制剂，其特征在于，所述制剂还包括实时荧光定量PCR检测试剂。3. 根据权利要求2所述的一种包括血清长链非编码RNA H19的慢性心力衰竭患者早期 诊断的制剂，其特征在于，所述实时荧光定量PCR检测试剂包括血清长链非编码RNA H19的 特异性引物和内参照U6 snRNA的特异性引物。4. 根据权利要求3所述的一种包括血清长链非编码RNA H19的慢性心力衰竭患者早期 诊断的制剂，其特征在于，所述血清长链非编码RNA H19的特异性引物包括血清长链非编码 RNA H19正向引物和血清长链非编码RNA H19反向引物。5. 根据权利要求4所述的一种包括血清长链非编码RNA H19的慢性心力衰竭患者早期 诊断的制剂，其特征在于，所述血清长链非编码RNA H19正向引物的序列如SEQ NO. 2所示。6. 根据权利要求4所述的一种包括血清长链非编码RNA H19的慢性心力衰竭患者早期 诊断的制剂，其特征在于，所示血清长链非编码RNA H19反向引物的序列如SEQ NO.3所示。7. 根据权利要求3所述的一种包括血清长链非编码RNA H19的慢性心力衰竭患者早期 诊断的制剂，其特征在于，所述内参照U6 snRNA的特异性引物包括内参照U6 snRNA正向引 物和内参照U6 snRNA反向引物。8. 根据权利要求7所述的一种包括血清长链非编码RNA H19的慢性心力衰竭患者早期 诊断的制剂，其特征在于，所述内参照U6 snRNA正向引物的序列如SEQ NO.4所示。9. 根据权利要求7所述的一种包括血清长链非编码RNA H19的慢性心力衰竭患者早期 诊断的制剂，其特征在于，所述内参照U6 snRNA反向引物的序列如SEQ NO.5所示。
【文档编号】C12Q1/68GK106086201SQ201610534032
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月7日
【发明人】王连生, 高伟, 王昊, 张震, 陈雨, 杨笛, 鲁翔
【申请人】王连生