用cyp1a基因监测水中菲污染的方法

用cyp1a基因监测水中菲污染的方法
【专利摘要】本发明公开了一种用细胞色素P4501A(CYP1A)基因监测水中菲污染的方法，用鱼作为监测水污染的生物样本，所述鱼的CYP1A基因作为监测水中菲污染的敏感生物标记物；本发明的优点在于：CYP1A基因作为监测水污染的敏感生物标记物，测试CYP1A基因的相对表达量，来监测水体污染的程度，该方法能灵敏反应出水体是否污染及污染程度，甚至能敏感地测出微量污染源的水体污染；同时也能从生物的角度敏感地监测菲污染的危害性和危害程度，为水体生态环境监测、毒理诊断、调控和防治提供准确、快速的科学方法。
【专利说明】
用CYP1A基因监测水中菲污染的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及水污染监测技术领域。更具体地说，本发明涉及一种用CYPlA基因监测 水中菲污染的方法。
【背景技术】
[0002] 随着城镇化和工农业的迅猛发展，水体多环芳烃污染日益加剧，其中菲是多环芳 烃污染的典型代表。菲是水生动物非必需但高致毒元素，具有亲脂强、易富集和难降解的特 性，不仅能引起动物肾、肝、睾丸损伤，肺水肿和骨软化，而且与肾、肺、前列腺的癌变等相 关，对环境、人和其他动物健康造成严重威胁。用化学方法可以定性、定量检测菲等多环芳 烃污染，但是无法检测其危害性和危害程度。敏感生物标记物则可敏感地监测菲等多环芳 烃污染的危害性和危害程度，为水体生态环境监测、毒理诊断、调控和防治提供准确、快速 的科学方法。

【发明内容】

[0003] 本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供一种用CYPlA基因监测水中菲污 染的方法，通过鱼的CYPlA基因作为敏感生物标记物，测试并计算CYPlA基因的相对表达量， 能敏感的表达出水体中菲污染的程度，方法简单，易操作，能快速灵敏的检测出水体污染程 度，更好的监测水体污染，以便及时控制和治理污染。
[0004] 为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种用CYPlA基因监测水中 菲污染的方法；
[0005] 本发明提供的技术方案为：
[0006] -种用CYPlA基因监测水中菲污染的方法，用鱼作为监测水污染的生物样本，鱼的 CYPl A基因作为监测水中菲污染的敏感生物标记物。
[0007] 优选的是，建立鱼的CYPlA基因的相对表达量与污染浓度关系的标准曲线， 获取与建立标准曲线同类同大小的待测水域的鱼，然后将计算得所述待测水域的鱼的 CYPlA基因的相对表达量与标准曲线比对，获得污染浓度。
[0008] 优选的是，计算CYPlA基因的相对表达量具体包括以下步骤：
[0009] 1)用鱼作为监测水污染的生物样本；
[0010] 2)利用RNA提取试剂，提取鱼样品总RNA，利用反转录试剂将RNA反转录合成首链 cDNA；
[0011] 3)实时荧光定量PCR检测，以首链cDNA为模板，分别根据所述CYPlA基因的特异性 引物，所述18s_rRNA基因引物，在罗氏PCR仪上进行实时荧光定量PCR扩增反应，荧光定量 PCR反应体系为：SYBR试剂12.5yL、上游引物F IyU下游引物R lyL、cDNA2yL、灭菌蒸馏水 8.5yL，反应体系总体积为25yL;反应程序采用三步法程序:95 °C预变性30s; 95°C 15s; 60°C 30S;72°C30s，40个循环，采集荧光信号数值Ct，Ct值是每个反应管内的荧光信号到达设定 的域值时所经历的循环数；
[0012] 4)获得CYPlA基因荧光信号数值CtCYPlA和内参基因荧光信号数值Ctl8s-rRNA后， 采取 2-法进行数据分析，ACt = CtCYPlA-Ctl8s-rRNA，
[0013] AACt=(CtCYPlA-Ctl8s-rRNA)测试组-(CtCYPlA-Ctl8s-rRNA)空白组，CYPlA 基 因的相对表达量=2^^，计算2^^得出CYPl A基因的相对表达量。
[0014] 优选的是，通过CYPlA基因的相对表达量来监测水污染的程度，值越大，污染 程度越大，反之，值越小，污染程度越小。
[0015]优选的是，所述鱼为仔鱼，将仔鱼分成若干组，其中一组作为无污染对照组，其他 组为待测水域组;分别将仔鱼放入无污染对照水体和待测水域水体中饲养;7天后随机抽取 仔鱼，检测并计算CYPlA相对表达量，如果待测水域组的值大于无污染对照组的 值，那么待测水域受到菲污染，其污染源菲的浓度与待测水域组的 2-^&值呈正相关。
[0016] 优选的是，CYPlA基因的特异性引物为：
[0017] 上游引物如SEQ ID NO · 1 所示：CYPlA-F: 5 ' -TTTGTCCAAGTGACAGGCAG-3 '，
[0018] 下游引物如SEQ ID NO · 2所示：CYPlA-R: 5 ' -AAGTGGCATAGTGCTCGCTG-3 ' ；
[0019] 鱼的内参基因为18s-rRNA基因，18s-rRNA基因的引物为：
[0020]上游引物如SEQ ID NO · 3所示：18s-rRNA-F: 5 ' -TTGACCCAACACGGGAAACCT-3 '，
[0021 ]下游引物如SEQ ID NO · 4所示：18s-rRNA-R: 5 ' -CAAATCGCTCCACCAACTAAGAA-3 '。
[0022]优选的是，所述鱼为海水青鏘或淡水青鏘。
[0023]优选的是，仔鱼均为10天龄幼鱼。
[0024]本发明至少包括以下有益效果：
[0025] DCYPlA基因作为监测水污染的敏感生物标记物，测试CYPlA基因的相对表达量， 来监测水体污染的程度，该方法能灵敏反应出水体是否污染及污染程度，甚至能敏感地测 出微量污染源的水体污染；同时也能从生物的角度敏感地监测菲污染的危害性和危害程 度，为水体生态环境监测、毒理诊断、调控和防治提供准确、快速的科学方法。
[0026] 2)鱼的CYPlA为细胞色素 P4501A基因能敏感反应水中微量的菲污染，CYPlA基因作 为监测水污染的敏感生物标记物，同时CYPlA相对表达量能敏感地表明与水中菲的浓度呈 正相关，该基因对其他污染源具有相对的稳定性，能单一准确地测出水中菲的污染，这样为 治理水污染提供科学参考。
[0027] 本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本 发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
【具体实施方式】
[0028] 结合下面实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书 文字能够据以实施。
[0029] 实施例1
[0030] (1)水污染鱼生物样本饲养准备
[0031] 采用10天龄海水青鏘仔鱼作为监测水污染的生物样本，将仔鱼分成6组，分别在表 1所述的菲浓度水环境中饲养，其中〇浓度的作为对照组，每组3个平行进行，饲养7天后，每 个平行取3尾鱼样品测定，每组测定3x3 = 9个数据，将每组9个数据数理统计后得到各组鱼 的CYPlA基因的相对表达量结果。：
[0032]表1 6组仔鱼饲养的水域的菲浓度
[0034] 饲养的其他条件均为：盐度：30 ± 2，水温为28± 2°C，pH为8.10，溶氧量彡6. IOmg/ L，光暗比为14h:10h，每天三次投喂200目饲料，总投喂量为鱼体重的5%，饲养7天后随机采 集鱼样品测定。
[0035] 2、利用RNA提取试剂，提取鱼样品总RNA，利用反转录试剂将RNA反转录合成首链 cDNA；
[0036] (1)快速称取冷冻的仔鱼IOOmg左右，记录实际重量为M，然后放入提前预冷的研钵 中倒入液氮，用研杵研磨称量好的仔鱼样品，直至研磨成粉末状，然后用不锈钢小药匙迅速 将样品粉末移入冰浴中的玻璃匀浆管底部。
[0037] (2)用移液枪往玻璃匀浆管中加入0.6mL RNAiso试剂，充分匀浆至匀浆液呈无颗 粒透明状后，将匀浆液转入1.5ml离心管中。然后再向匀浆管中加入0.2mL RNAiso试剂，洗 涤匀衆棒和匀衆管管壁一次，之后将匀衆液转入之前的离心管中，重复上述操作一次，使加 入的RNAiso试剂总体积为lmL。盖好离心管并颠倒混匀数次后室温静置5min。
[0038] (3)用1000 yL微量移液枪往上一步的1.5mL离心管中加入200yL氯仿，盖紧离心管 盖，混匀至溶液乳化后，再室温静置5min。
[0039] (4)转移至高速冷冻离心机中12000g，4°C，离心15min。
[0040] (5)小心从离心机中取出离心管，用1000 yL微量移液器吸取500yL上清液至一个新 的1.5ml离心管中。
[00411 (6)然后往新的1.5mL离心管中加入500yL异丙醇，盖好离心管并充分颠倒混匀，室 温静置l0min。
[0042] (7)转移至高速冷冻离心机中12000g，4°C，离心10min。
[0043] (8)将1.5mL离心管中上清液倒掉，再12000g，4°C，离心lmin，用小枪头（IOOyL)将 上清液吸净。
[0044] (9)往离心管中加入现配的预冷的75%乙醇Iml(无水乙醇3: IDEPC水），盖好离心 管并轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁及RNA，再12000g，4°C，离心Imin后小心去除乙醇。
[0045] (10)在超净工作台中打开离心管盖，室温干燥沉淀lOmin，加入50yL DEPC处理水 溶解沉淀，静置3min，待RNA沉淀完全溶解后置于-20°C冰箱保存待用。
[0046] (11)使用Thermo Scientific Nanodrop 2000c测定总的RNA的含量，获得测定浓 度，RNA含量的计算公式：
[0047] 样品RNA浓度(yg/mg)=测定浓度(ng/μL) X50X 1000+M。
[0048] (12)用1%琼脂糖凝胶电泳检测其纯度，若测定的0D260/0D280值在1.9~2.1之 间，且总RNA电泳条带清晰呈现为28S，18S和5S三条带，28S的条带亮度约为18S的两倍，说明 RNA纯度和浓度符合要求，可继续进行后续实验；
[0049 ] (13)利用反转录试剂将RNA反转录合成首链cDNA;
[0050] (14)逆转录:用普通PCR仪将RNA反转录成首链cDNA，按照表2配制反转录反应液：
[0051 ]表2反转录反应液组成
[0053] 反应液配制方法:配置前先根据反转录样品的数量计算出各反应液实际需要量， 统一加入无菌离心管中混合均匀，然后分装到各个反应管中，最后添加样品并小心点动离 心混匀，使反应更加充分并减少误差。配制过程需在冰浴且无菌体系中进行，
[0054] 反转录反应条件：5CTC，20min495°C，5min45°C，5min4l5°C，15min。
[0055] 3、实时荧光定量PCR检测目的基因
[0056] ⑴引物设计
[0057]所述CYPlA基因的特异性引物为：
[0058] 上游引物为：CYPlA-F: 5 ' -TTTGTCCAAGTGACAGGCAG-3 '，（ SEQ ID NO · 1)
[0059] 下游引物为：CYP1A-R:5'-AAGTGGCATAGTGCTCGCTG-3'；（SEQIDN0·2)
[0060] 所述鱼的内参基因为18s-rRNA基因，所述18s-rRNA基因的引物为：
[0061] 上游引物为：18s-rRNA-F:5'-TTGACCCAACACGGGAAACCT-3'，（SEQIDN0·3)
[0062] 下游引物为：18s-rRNA-R: 5 ' -CAAATCGCTCCACCAACTAAGAA-3 ' ；（SEQ ID NO · 4)
[0063] (2)PCR检测目的基因
[0064] PCR扩增反应用普通PCR仪扩增cDNA，按表3配制PCR反应液：
[0065] 表3 PCR反应液组成
L0067J 根据反转录样品数量计算谷PCR反应试刑用量，配制反应混合液，点动离心混习， 然后分装到RT-PCR反应结束后的PCR反应管中，再点动离心混匀。反应结束后，将PCR管保存 于4°C冰箱保存，待用。
[0068] PCR扩增反应条件：95 cC，lmin- (94Γ，30sec-60 cC，30sec-72 cC，Imin，40个循 环)-72°C，5min4l5°C，pause〇
[0069] 用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，条件为100V，30min。若PCR反应产物的条带单 一，出现位置在100bp-200bp之间，可初步确定PCR产物为目的基因。
[0070] PCR产物纯化与浓缩，PCR产物的1 %琼脂糖凝胶电泳检测符合实验要求后，取经纯 化浓缩后的？〇?产物测序，测序结果经131^51'(111^。://\^￥.11(313；[.111111.11；[11.80￥)比对后，确定 PCR扩增产物是目的基因片段，方可进行后续的荧光定量实验。
[0071 ]本实验米用的是TaKaRa公司的 S.YBlTPremix Ex Taq?(Perfect Real Time)试剂 盒，本试剂盒是在PCR扩增合成双链DNA的过程中，荧光分子SYBfTGreen I与双链DNA结合能 够发出荧光信号，通过连续监测荧光信号出现的先后顺序以及信号的强弱变化，来及时分 析目的基因 CYPlA的拷贝数目，从而对目的基因的表达量进行实时准确定量。实时荧光定量 PCR的反应体系如表4:
[0072] 表4 RTQ-PCR反应体系组成
[0074] RTQ-PCR反应体系的配制必须在冰浴无菌条件下进行，试剂使用前需点动离心混 匀后才能使用，反应液配制、分装均要使用无菌的新枪头，以避免污染，而且配制的速度要 快，以免其中的反应酶失活。反应试剂添加完成后，使用配有八联管转头的台式离心机短暂 离心，确保试剂沉积在管底。
[0075] 荧光定量反应条件：95°C预变性3〇8;95°(：158;6〇1€3〇8;72 1€3〇8,40个循环；采集 荧光信号数值Ct;获得CYPlA基因荧光信号数值CtCYPlA和内参基因荧光信号数值Ctl8s-rRNA 后，采取 2-法进行数据分析，ACt = CtCYPlA-Ct 18s-rRNA，
[0076] AACt=(CtCYPlA-Ctl8s-rRNA)测试组-(CtCYPlA-Ctl8s-rRNA)空白组，CYPlA 基 因的相对表达量= 2^^，计算2^^得出CYPlA基因的相对表达量;测定并经数理统计的结 果如表5所不：
[0077] 表5 6组鱼样品的CYPlA基因的相对表达量2_^et
[0079] 受到水域中菲的污染胁迫，鱼样本生理机能发生变化，通过CYPlA基因的相对表达 量来监测水污染的程度，值越大，菲浓度大，很直观的说明水域受污染的程度越大，反 之值越小，菲浓度越小，说明水域受污染的程度越小，测试组的值大于对照组的 值时说明水体已经受菲污染，而且幅度越大污染越严重。
[0080] 通过表5的数据结果，建立鱼的CYPlA基因的相对表达量与菲浓度的标准曲 线，获取与建立标准曲线同类同大小的待测水域的鱼，然后将计算得所述待测水域的鱼的 CYPlA基因的相对表达量与标准曲线比对，获得菲浓度大小。
[0081 ] 实施例2
[0082] 1、水污染鱼生物样本饲养准备
[0083]采用海水青鏘仔鱼作为监测水污染的生物样本，将仔鱼分成2组，这2组分为无污 染对照组与待测水域组，将仔鱼分别放入无污染水体和待测水域水体中饲养，每组3个平行 进行，7天后每个平行随机取3尾鱼样品测定，每组测定3x3 = 9个数据，将每组9个数据数理 统计后得到各组鱼的结果。。
[0084] 2、按照分组，利用RNA提取试剂，提取鱼样品总RNA，利用反转录试剂将RNA反转录 合成首链cDNA;
[0085] (1)快速称取冷冻的仔鱼IOOmg左右，记录实际重量为M，然后放入提前预冷的研钵 中倒入液氮，用研杵研磨称量好的仔鱼样品，直至研磨成粉末状，然后用不锈钢小药匙迅速 将样品粉末移入冰浴中的玻璃匀浆管底部。
[0086] (2)用移液枪往玻璃匀浆管中加入0.6mL RNAiso试剂，充分匀浆至匀浆液呈无颗 粒透明状后，将匀浆液转入1.5ml离心管中。然后再向匀浆管中加入0.2mL RNAiso试剂，洗 涤匀衆棒和匀衆管管壁一次，之后将匀衆液转入之前的离心管中，重复上述操作一次，使加 入的RNAiso试剂总体积为lmL。盖好离心管并颠倒混匀数次后室温静置5min。
[0087] (3)用1000 yL微量移液枪往上一步的1.5mL离心管中加入200yL氯仿，盖紧离心管 盖，混匀至溶液乳化后，再室温静置5min。
[0088] (4)转移至高速冷冻离心机中12000g，4°C，离心15min。
[0089] (5)小心从离心机中取出离心管，用1000 yL微量移液器吸取500yL上清液至一个新 的1.5ml离心管中。
[0090] (6)然后往新的1.5mL离心管中加入500yL异丙醇，盖好离心管并充分颠倒混匀，室 温静置l〇min。
[0091] (7)转移至高速冷冻离心机中12000g，4°C，离心10min。
[0092] (8)将1.5mL离心管中上清液倒掉，再12000g，4°C，离心lmin，用小枪头（IOOyL)将 上清液吸净。
[0093] (9)往离心管中加入现配的预冷的75%乙醇Iml(无水乙醇3: IDEPC水），盖好离心 管并轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁及RNA，再12000g，4°C，离心Imin后小心去除乙醇。
[0094] (10)在超净工作台中打开离心管盖，室温干燥沉淀lOmin，加入50yL DEPC处理水 溶解沉淀，静置3min，待RNA沉淀完全溶解后置于-20°C冰箱保存，待用。
[0095] (11)使用Thermo Scientific Nanodrop 2000c测定总的RNA的含量，获得测定浓 度，
[0096] RNA含量的计算公式：
[0097]样品RNA浓度(yg/mg)=测定浓度(ng/μL) X50X1000+M。
[0098] (12)用1%琼脂糖凝胶电泳检测其纯度，若测定的0D260/0D280值在1.9~2.1之 间，且总RNA电泳条带清晰呈现为28S，18S和5S三条带，28S的条带亮度约为18S的两倍，说明 RNA纯度和浓度符合要求，可继续进行后续实验；
[0099 ] (13)利用反转录试剂将RNA反转录合成首链cDNA;
[0100] a)逆转录:用普通PCR仪将RNA反转录成首链cDNA，按照表2配制反转录反应液：
[0101]表2反转录反应液组成
[0103] 反应液配制方法:配置前先根据反转录样品的数量计算出各反应液实际需要量， 统一加入无菌离心管中混合均匀，然后分装到各个反应管中，最后添加样品并小心点动离 心混匀，使反应更加充分并减少误差。配制过程需在冰浴且无菌体系中进行，
[0104] 反转录反应条件：50°C，20min-95°C，5min-5°C，5min-15°C，15min。
[0105] 4、实时荧光定量PCR检测目的基因
[0106] ⑴引物设计
[0107]所述CYPlA基因的特异性引物为：
[0108] 上游引物为：CYPlA-F: 5 ' -TTTGTCCAAGTGACAGGCAG-3 '，（ SEQ ID NO · 1)
[0109] 下游引物为：CYP1A-R:5'-AAGTGGCATAGTGCTCGCTG-3' ；（SEQIDN0·2)
[0110] 所述鱼的内参基因为18s-rRNA基因，所述18s-rRNA基因的引物为：
[0111] 上游引物为：18s-rRNA-F:5'-TTGACCCAACACGGGAAACCT-3'，（SEQIDN0·3)
[0112] 下游引物为：18s-rRNA-R: 5 ' -CAAATCGCTCCACCAACTAAGAA-3 ' ；（SEQ ID NO · 4)
[0113] (2)PCR检测目的基因
[0114] PCR扩增反应用普通PCR仪扩增cDNA，按表3配制PCR反应液：
[0115] 表3PCR反应液组成
[0117] 根据反转录样品数量计算各PCR反应试剂用量，配制反应混合液，点动离心混匀， 然后分装到RT-PCR反应结束后的PCR反应管中，再点动离心混匀。反应结束后，将PCR管保存 于4°C冰箱保存，待用。
[0118] PCR扩增反应条件：95 °C，lmin- (94°C，30sec-60 °C，30sec-72 °C，Imin，40个循 环)-72°C，5min4l5°C，pause〇
[0119] 用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，条件为100V，30min。若PCR反应产物的条带单 一，出现位置在100bp-200bp之间，可初步确定PCR产物为目的基因。
[0120] PCR产物纯化与浓缩，PCR产物的1 %琼脂糖凝胶电泳检测符合实验要求后，取经纯 化浓缩后的？〇?产物测序，测序结果经131^51'(111^。://\^￥.11(313；[.111111.11；[11.80￥)比对后，确定 PCR扩增产物是目的基因片段，方可进行后续的荧光定量实验。
[0121] 本实验采用的是TaKaRa公司的SYBR*Premix Ex Taq?(Perfect Real Time)试剂 盒，本试剂盒是在PCR扩增合成双链DNA的过程中，荧光分子SYBIf Green I与双链DNA结合能 够发出荧光信号，通过连续监测荧光信号出现的先后顺序以及信号的强弱变化，来及时分 析目的基因 CYPlA的拷贝数目，从而对目的基因的表达量进行实时准确定量。实时荧光定量 PCR的反应体系如表4:
[0122] 表4 RTQ-PCR反应体系组成
[0124] RTQ-PCR反应体系的配制必须在冰浴无菌条件下进行，试剂使用前需点动离心混 匀后才能使用，反应液配制、分装均要使用无菌的新枪头，以避免污染，而且配制的速度要 快，以免其中的反应酶失活。反应试剂添加完成后，使用配有八联管转头的台式离心机短暂 离心，确保试剂沉积在管底。
[0125] 荧光定量反应条件：95°C预变性3〇8;95°(：158;6〇1€3〇8 ;721€3〇8,40个循环；采集 荧光信号数值Ct;采用上述参数，多次循环测试，相对其他参数来说采集到的荧光信号数值 Ct误差小;获得CYPlA基因荧光信号数值CtCYPlA和内参基因荧光信号数值Ctl8s-rRNA后， 采取 2-法进行数据分析，ACt = CtCYPlA-Ctl8s-rRNA，
[0126] AACt=(CtCYPlA-Ctl8s-rRNA)测试组-(CtCYPlA-Ctl8s-rRNA)空白组，CYPlA 基 因的相对表达量= 2^^，计算2^^得出CYPlA基因的相对表达量，采取2^^法进行数据 分析能减少误差，能够准确表述CYPlA基因的相对表达量从而精准反映出水污染程度;检测 结果:对照组的值为1.82，待测组的2_M Gt值为2.15，结果显示对照组的2_MGt值小于 待测组的2-^&值，所述待测水域已经受到了菲污染，需及早进行水域治理，而化学的方法 测试菲，一般采用气质联用法测试，该方法成本高，误差相对本发明来说也较大。本发明所 提到的空白组为所使用的试剂盒的空白对照，目的是为了减小误差。
[0127] 尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列 运用，它完全适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可轻易改作他 用，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节 和这里示出与描述的实施例。 SEQUENCE LISTMO <110>广西大学 <120> -种用CYPlA基因监测水中菲污染的方法 <160> 4 <170> PaicnlIn version 3.5 <2i0> I <2Π>20 <212> DNA <213>人工序到 <400> 1 TTTGTCCAAG TGACAGGCAG 20 <210>2 <211> 20
[0128] <212> DNA <213>人工序列 <400 2 A AG TGGC ATA GTGCTCGCTO 20 <2103 <211>21 <212> DNA <213>人工序呵 <400> 3 TTGACCCAAC ACGGGAAACC T 21 <210>4 <211〉2.3 <212> DNA <213>人工序列 <400> 4
[0129] CA A ATCGCTC CACCAACmA GAA 23
【主权项】
1. 一种用CYP1A基因监测水中菲污染的方法，其特征在于，用鱼作为监测水污染的生物 样本，鱼的CYP1A基因作为监测水中菲污染的敏感生物标记物。2. 根据权利要求1所述的用CYP1A基因监测水中菲污染的方法，其特征在于，建立鱼的 CYP1A基因的相对表达量与污染浓度关系的标准曲线，获取与建立标准曲线同类同大 小的待测水域的鱼，然后将计算得所述待测水域的鱼的CYP1A基因的相对表达量2 4Aet与标 准曲线比对，获得污染浓度。3. 根据权利要求2所述的用CYP1A基因监测水中菲污染的方法，其特征在于，计算CYP1A 基因的相对表达量具体包括以下步骤： 1) 用鱼作为监测水污染的生物样本； 2) 利用RNA提取试剂，提取鱼样品总RNA，利用反转录试剂将RNA反转录合成首链cDNA; 3) 实时荧光定量PCR检测，以首链cDNA为模板，分别根据所述CYP1A基因的特异性引物， 18s-rRNA基因引物，在罗氏PCR仪上进行实时荧光定量PCR扩增反应，荧光定量PCR反应体系 为:SYBR试剂12.5yL、上游引物F lyL、下游引物R lyL、cDNA 2yL、灭菌蒸馏水8.5yL，反应体 系总体积为25以1^反应程序采用三步法程序：95°(：预变性3〇8;95°(：158 ;6〇1€3〇8;721€ 30s，40个循环，采集荧光信号数值Ct，Ct值是每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时 所经历的循环数； 4) 获得CYP1A基因荧光信号数值CtCYPlA和内参基因荧光信号数值Ctl8s-rRNA后，采取 2-ΛΔα法进行数据分析，Δ Ct = CtCYPlA-Ctl8s-rRNA， Δ ACt=(CtCYPlA-Ctl8s-rRNA)测试组-(CtCYPlA-Ctl8s-rRNA)空白组，CYP1A基因的 相对表达量= 2_AAet，计算2_AAet得出CYP1A基因的相对表达量。4. 根据权利要求3所述的用CYP1A基因监测水中菲污染的方法，其特征在于，通过CYP1A 基因的相对表达量来监测水污染的程度，2_λ Aet值越大，污染程度越大，反之，2_λ Aet值越小， 污染程度越小。5. 根据权利要求4所述的用CYP1A基因监测水中菲污染的方法，其特征在于，所述鱼为 仔鱼，将仔鱼分成若干组，其中一组作为无污染对照组，其他组为待测水域组;分别将仔鱼 放入无污染对照水体和待测水域水体中饲养;7天后随机抽取仔鱼，检测并计算CYP1A相对 表达量，如果待测水域组的2 4Aet值大于无污染对照组的24Aet值，那么待测水域受到 菲污染，其污染源菲的浓度与待测水域组的2^ Aet值成正相关。6. 根据权利要求1-5任一项所述的用CYP1A基因监测水中菲污染的方法，其特征在于， CYP1A基因的特异性引物为： 上游引物如SEQIDN0.1所示：CYPlA-F:5'-TTTGTCCAAGTGACAGGCAG-3'，下游引物如 SEQ ID N0.2m*:CYPlA-R:5'-AAGTGGCATAGTGCTCGCTG-3'； 鱼的内参基因为18s-rRNA基因，18s-rRNA基因的引物为： 上游引物如SEQIDNO·3所示：18s-rRNA-F:5'-TTGACCCAACACGGGAAACCT-3'，下游引物 如SEQ ID NO · 4所示：18s-rRNA-R: 5 ' -CAAATCGCTCCACCAACTAAGAA-3 '。7. 根据权利要求5所述的用CYP1A基因监测水中菲污染的方法，其特征在于，所述鱼为 海水青鏘或淡水青鏘。8. 根据权利要求5所述的用CYP1A基因监测水中菲污染的方法，其特征在于，所述仔鱼 均为10天龄仔鱼。
【文档编号】C12Q1/68GK106086202SQ201610545363
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月12日
【发明人】许友卿, 丁兆坤, 刘永强, 刘富娟
【申请人】广西大学