专利名称：一种通过cyp1a1基因检测肺癌易感性的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用亍检测疾病易感性的试剂盒，尤其楚一种检测肺癌易感性的试剂盒，通过检测对细 胞色素P4501A1酶基因(cytochrome P450， family 1， subfamily A, polypeptide 1 ， CYPl Al)的单核苷酸多态 性位点来预测个体对肺癌的易感性。
背景技术：
.原发性支气管肺癌，简称肺癌，为当前世界各地最常见的恶性肿瘤之一，是一种严重威胁人民健康和 生命的疾病。肿瘤细胞源于支气管粘膜或腺体，常有区域性淋巴结和血行转移，早期常有剌激性咳嗽、痰 中带血等呼吸道症状，病情进展速度与细胞的生物特性有关。半个世纪以来，世界各国肺癌的发病率和病死率都有明显增高趋势。世界卫生组织(WHO)2000年报告 1997年全世界死于恶性肿瘤的共706.5万人，占死亡人数的12.6%,其中肺癌占恶性肿瘤死亡的19%，居 恶性肿瘤死因的第一位。我国19卯 1992年的抽样调査显示，在城市人口的肿瘤死亡中，肺癌由原来的 第4位上升为第1位，农村上升最快的也是肺癌。云南锡矿的肺癌发病率在1954 1959年间为28.02/10 万，1%0 1969年间为197. 87/10万，1970 1979年间上升到219.10/10万，这在全世界也是罕见的。英 国著名肿瘤学家R.Peto预言如果我国不及时控制吸烟和空气污染，到2025年我国每年肺癌将超过100 万，成为世界第一肺癌大国。病因和发病机制迄今尚未明确。 一致认为肺癌的发病与下列因素有关①吸烟(包括主动吸烟和被动 吸烟)；②职业致癌因子，己被确认的致人类肺癌的职业因素包括石棉、无机砷化合物、二氯甲醚、铬及 其化合物、镍、氡、芥子气、氯乙烯、煤烟、焦油和石油中的多环芳烃、烟草的加热产物等；③空气污染 (包括室内小环境和室外大环境污染)；④电离辐射； 饮食与营养，美国纽约和芝加哥开展的前瞻性人 群观察的结果说明，食物中天然维生素A类、P胡萝卜素的摄入量与十儿年后癌症的发生呈负相关，其中 最突出的是肺癌； 其他，美国癌症学会将结核列为肺癌的发病因素之一。有结核病者患肺癌的危险性是 止常人群的10倍。其主要组织学类型是腺癌。此外，病毒感染、真菌毒素(黄曲霉)、机体免疫功能低下、 内分泌失调以及家族遗传等因素，对肺癌的发生可能也起一定的综合作用。近年研究表明，肺癌的发生与某些癌基闳的活化及抑癌基因的失活密切相关。己经证明的几个癌基因 家族包括引起突变的ras族、放大基因的myc族、C-erB2、机制不明的bcl-2、 Kit及由野生型变异的抗癌 基因p53、 pl6和RB等。大量研究表明C-myc、 L-myc、 N-myc和RAF在小细胞肺癌中均有过度表达。 非小细胞肺癌中则常可见ras族基因的过度表达。这些深入的研究将为基因预防和治疗肺癌提供理论基础。CYP1A1基因位f第15号染色体15q22-q24位置，全长6.0kb， mRNA全长2601bp,共有7个外显子， 编码513aa的细胞色素P4501A1。P4501A1是重要的活化多环芳烃类致癌物的主要酶类,被激活的CYP1A1 能将多种环境中的有机物质如PAH (polycyclic aromatic hydrocarbons)多环芬芳碳氢化合物转化为细胞 毒素或其他致癌物质，从而增加癌症发生的危险。国内外的众多研究显示CYP1A1的多态与野生型相比有 更高的酶接触反应活性和可诱导性，从而增加肝癌、肺癌、乳腺癌、食道癌、前列腺癌等疾病的危险度。细胞色素P450酶(CYP450)是细胞内重要的I相代谢酶，在致癌物的活化和解毒过程中起着重要的 作用。P4501A1(CYP1A1)是活化多环芳烃类致癌物的主要酶类。CYP1A1作为一种微神经元体细胞酶与一 些致癌物质的生物激活有关，例如benzo[a]pyrene。同时，CYP1A1易于被TCDD和多环的芳香族化合物 所诱变，包括3-甲基胆蒽等实验室用致癌物质。目前的动物实验表明，CYP1A1的表达与芳基碳氢化合物 受体(AhR)禾UArnt (AhR Nuclear Translocator)的激动剂，以及USF1 (Upstream Stimulatory Factor)的 拮抗剂有关。同时，CYP1A1通过C2羟基化作用参与雌激素的代谢活动。SNP(single nucleotide polymorphism)，即单核苷酸多态性标记，是一类基于单碱基变异引起的DM 多态性，被遗传学界称为第三代遗传标记。主要是指由基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性， 包括单碱基转换、颠换，以及单碱基的插入/缺失等。它是基因纟且中最为广泛存在的一类多态性标记，占 大约90%。这些基闵組齐列变异可以导致个体间表型的差异以及不同个体对疾病，特别是复杂疾病的易感性、和对环境因素、药物反应的差异。rsl048943是位于CYP1A1基因上的一个A/G多态，位于第7外显子462号氨基酸由He转化为Val。 目前NCBI公布的世界人口频率A:G为0.896:0.104,杂合度0.186。世界人群的关联分析表明，CYP1A1 Ue462Val位点ValVal和Vallle基因型在肺癌病例组中的频率明显高于对照组，在女性中风险度尤其突出。 基于多个中国人群肺癌发病与CYP1A1 Ue462Val位点的关联分析研究，上千例肺癌个体与健康对照个体的 分析，显示CYPlAlIle462Val这种位于酶蛋白的血红素结合区的变异，是中国人群中重要的肺癌遗传易感 因素之--，在女性中尤为突出。酶动力学研究表明，3种基因型表达的酶活性存在差异。Val/Val活化毒物 的能力最强，Ue/Val次之，而lle/Ile最弱。研究显示，CYPlAlValVal基因型是中国人群中重要的肺癌遗 传易感因素之一，rsl048943位点携带G型即为食管癌易感型。发明内容基于CYP1A1基因上的rsl048943号SNP位点可用来评估个体对肺癌的易感性的基础上，本发明提供 一种用于检测肺癌易感性的试剂盒。该试剂盒包括检测CYP1A基因SEQ ID NO: 1中第161位SNP的特异性引物对及特异性荧光探针、 Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液、去离子水。本试剂盒中所述的特异性引物对是指针对SEQ ID NO: 1中第161位SNP位点而设计，能特异性扩增 出SEQ ID NO: 1中包含第161位SNP位点的DNA片段的引物对。设计这类引物对是本领域技术人员能够 轻易完成的。优选地，试剂盒中包含具有SEQ ID NO: 2和3所示序列的引物对。特异性引物对可用常规 的合成技术进行合成。本领域的技术人员能够理解，本发明的引物不限于这两对引物。本试剂盒中所述的特异性荧光探针是指针对SEQ ID NO: 1中第161位SNP位点而设计，能通过荧光 定量PCR技术特异性检测出该SNP位点肺癌易感基因型的探针。设计这类探针是本领域技术人员能够轻易 完成的。优选地，试剂盒中包含具有SEQ ID NO: 4所示序列的Tacpan探针。特异性荧光探针可用常规的 合成技术进行合成。本领域的技术人员能够理解，本发明的特异性荧光探针不限于这条探针，所有可用于 荧光定量PCR检测SEQ ID NO: 1中第161位SNP位点的探针均在本发明范围内。本发明试剂盒的组分和含量包括 "I 10 X荧光定量PCR反应缓冲液， 0. lul 25mM dNTP混合液， 0.6nl 25raM MgCh溶液， 0.025fil (5units/jxl) Taq DNA聚合酶， 20nM特异性引物对(两条)各O. 225^1, lOpM特异性荧光探针O. 25nl， 去离子水5. 575nl。本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-2(TC 。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规 条件，或按照厂商所建议的条件。实施例l.检测试剂盒的使用 步骤l: DNA模板的抽取 用硅胶吸附法抽提口腔上皮细胞的基因组DNA。 步骤2:荧光定量PCR反应使用可检测肺癌易感性的荧光定量PCR检测试剂盒，其中，含有下列引物对和荧光探针 有义引物5' - GTGTTAAGTGAGAAGGTGAT -3， (SEQ ID NO: 2) Tm值为56。C 反义引物5' - AGGATAGCCAGGAAGAGMA -3' (SEQ ID NO: 3) Tm值为58。C 荧光探针5' - TATCGGTGAGACCGTTGCCC-3' (SEQ ID NO: 4) Tm值为64。C荧光定量PCR反应体系为总体积10nl,包含浓度为20ng/nl的DNA模板2pl、 lpl 10 X荧光定量PCR 反应缓冲液、0. 25mM d證混合液、0. 6pl 25mM MgCl2溶液、0. 025^1 (5units/nl) Taq DNA聚合酶、 2(HiM的有义引物和反义引物各0.225pl、 10nM的荧光探针0.25^,去离子水5. 575^1。在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为5CTC、 2分钟，95°C、 10分钟，进行60个循环的 95X;、 30秒，6(TC、 l分钟。反应结束后在ABI7900型荧光定量PCR仪上读取样品荧光量。 步骤3: SNP基因型分析将荧光定量PCR仪上显示的最终样品荧光量和正常对照相对比，荧光探针最终的荧光信号明显高于正 常对照，说明被检测DNA的CYP1A1基因上的rsl048943号SNP位点基因型携带为G型，为肺癌易感型。实施例2.指导人们主动预防肺癌的服务目前在上海主健生物工程有限公司已经开展了这项服务。 步骤l: DNA提取对被检测者进行服务前咨询，由被检测者签署知情同意书，填写生活饮食习惯问巻调査表。依照取样 盒中的指示使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，采用硅胶吸附法进行口腔上皮细胞的DNA抽提。 步骤2:基因分型检测使用本发明提供的试剂盒，对被检测者DNA的CYP1A1基因上的rsl048943号SNP位点进行荧光定量 PCR检测，确定该SNP位点的基因型。步骤3:指导人们主动预防肺癌通过对被检测者SNP基因型的分析，出具基因分型检测报告和被检测者个体化健康指导报吿。基因检 測报告详细说明了被检测者肺癌易感程度的高低以及患病的概率大小。个体化健康指导报告以被检测者的 基函分型检测结果为基础，结合其生活饮食习惯问巻调査结果，评估被检测者肺癌遗传易感的相对风险。 同时制定出针对于被检测者的个性化健康行动方案，方案包括在饮食习惯、生活方式上的改进建议等，并 为被检测者普及预防肺癌的健康知识。
序歹U表<110>上海主健生物丁.程有限公司<120〉 一种通过CYP1A1基因检测肺癌易感性的试剂盒<160〉 4<210〉 1 〈211〉 300 <212> DNA <213>人属，人种(Homo sapiens, human)< 1gccacttcagacctgaacggtatctttggctctcttcctgggacatgaccctgtctccct ctggttacag gaagctatgg gtcaacccat ctgagttcct 60tttctcaccc ctgatggtgc tatcgacaag gtgtt卿tg卿aggtgat 120atgggcaagc ggsagtgtat cggtg卿cc attgcccgct ggg3ggtctt 180gctatcctgc tgcsacgggt gg33ttcagc gtgccactgg gcgtga鄉t 240ccc3tct3tg ggctaaccat g幼gc8tgcc tgctgtg3gc acttccaaat 300<210> 2 .<211> 20 <212>舰 〈213〉人工序列<220〉<223〉引物<400〉 2gtgttaagtg agaaggtgat20<210> 3 <211〉 20 <212〉 DNA <213〉人工序列<220><223>引物<柳〉3agptagcca ggaagagaaa20
〈210〉 4 <211> 20 <212> DNA <213〉人工序列<220><223>探针 〈400〉 4tateggtgag accgttgccc 20
权利要求
1.一种肺癌易感性检测试剂盒，其特征在于包括检测CYP1A1基因SEQ ID NO1中第161位SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液、去离子水。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在T:所述的特异性引物对是指针对SEQIDNO: 1中第161 位SNP位点而设计，能特异性扩增出包含SEQ ID NO: 1中第161位SNP位点的咖A片段的引物对。
3. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的特异性荧光探针是指针对SEQ ID NO: l中第 161位SNP位点而设计，能通过荧光定量PCR技术特异性检测出该SNP位点肺癌易感基因型的探针。
4. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在T:所含的特异性引物对选自具有SEQ ID NO: 2和3所 示序列的引物对。
5. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在P:所含的特异性荧光探针选自具有SEQ IDNO: 4所示 序列的Taqman探针。
6. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分和含量包括lpl IOX荧光定量PCR反 应缓冲液，0. lul 25mM dNTP混合液，0. 6^1 25mM MgCl2溶液，0. 025fil (5units/nl) Taq DNA聚合酶， 20pM特异性引物对(两条)各0.225^1， 10nM特异性荧光探针0.25fil，去离子水5.575^1。本试剂盒供 一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-2(TC。
全文摘要
本发明公开了一种肺癌易感性检测试剂盒。该试剂盒包括检测CYP1A1基因SEQ ID NO1中第161位SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针、用于荧光定量PCR检测的常规组件等。本发明的试剂盒通过检测分析个体的CYP1A1基因上SNP位点基因携带型来预测个体对肺癌的易感性。
文档编号C12Q1/68GK101130813SQ200610030388
公开日2008年2月27日 申请日期2006年8月25日 优先权日2006年8月25日
发明者冯哲民, 邹祖烨 申请人:上海主健生物工程有限公司