专利名称：一种检测与SARS－CoV感染相关的易感基因MBL基因型的方法及MBL易感基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及严重急性呼吸系统综合症(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)人群预防中的个体易感性及其遗传学检测方法。具体地，本发明涉及与SARS冠状病毒(SARSCoronavirus，SARS-CoV)感染相关的易感基因甘露糖结合凝集素(mannose-binding lectin，MBL)基因的基因型检测方法。本发明进一步涉及上述易感基因基因型的检测试剂盒，以及该试剂盒的应用。另外，本发明还涉及上述检测方法和易感基因在SARS的预防和控制以及遗传咨询中的应用。
背景技术：
SARS是新近确定的人类传染性疾病，由一种新型的冠状病毒SARS-CoV引起。截止到2003年6月底，短短半年多的时间内全球25个国家以上共报道8000多SARS病例，其中700多例死亡。SARS的迅速传播、强感染性、难以预料的临床进展和高死亡率使其成为全球范围内的严重威胁。鉴于此，有效预防和治疗该疾病是我国及至世界公众健康的一个重要目标。
资料显示，个体对于SARS的易感性是不一样的；比如，SARS-CoV血清反应阳性的个体可能患SARS，也可能只表现出轻微的感染症状。正如其它大多数传染性疾病一样，SARS的发展可能也是病原微生物、宿主遗传因素和环境之间复杂的相互作用的结果。先前已有报道表明年老、糖尿病以及心脏病是SARS发展的风险因素；然而，机体遗传因素对于SARS易感性的影响程度尚了解不多。虽然已有报道表明人类组织相容性复合体(HLA)基因的多态性(如HLA-B*4601、HLA-B*0703和HLA-DRB1*0301)与SARS发生的风险相关，然而我们知道，获得性免疫反应从识别病原微生物(如SARS-CoV)到产生足够多的具有保护作用的特异性抗体需要一定的时间。因此，在获得性免疫反应无法对机体提供有效保护作用期间，早期的非特异性的固有免疫反应很可能在决定疾病的易感性方面起着更为重要的作用。
MBL是一种属于胶凝素(collectin)家族的血清蛋白，在先天的固有免疫反应中担负重要角色。MBL是一种肝细胞来源的急性期反应蛋白，它能够通过其多个凝集素结构域结合到入侵机体的细菌、真菌、病毒和原虫表面的重复甘露糖和N-乙酰氨基葡萄糖的糖结构域上。MBL结合的这些部位是病原微生物的特征性结构，在哺乳动物细胞的表面并不存在。在结合到病原微生物上之后，MBL至少可以引发两种保护作用。第一，MBL通过凝集素途径介导补体系统的活化，这并不需要抗体的参与；第二，MBL能够通过胶凝素受体直接促使吞噬调理作用。离体、在体实验均表明MBL缺陷可能对固有免疫系统的激活具有重要影响，并使得机体受到严重感染的风险增加。
已知，在对病毒感染起重要作用的SARS-CoV的S蛋白上，具有甘露糖等MBL可识别的糖结构域类型。人们还发现在鸡中，MBL能够于体液免疫反应发生之前参与中和传染性支气管炎冠状病毒(IBV)。由于IBV与SARS-CoV一样是冠状病毒家族的成员，因此，有可能MBL也能够结合到SARS-CoV的S蛋白上，并可能通过上面提到的两种途径发挥其抗病毒作用。
MBL在血清中的含量很大程度上受MBL基因的遗传多态性控制。已知MBL基因具有一个位于编码区的SNP G+230A，当基因型为+230G/A或+230A/A时，血清MBL含量可为野生基因型+230G/G血清含量的10％或更低。MBL基因启动子区另外有2个SNP(G-550C和G-221C)与G+230A一起可影响血清中的MBL含量。对于由G-550C(H/L)、G-221C(Y/X)和G+230A(A/B)这3个SNP组成的单倍型而言，决定血清中MBL表达水平为高的单倍型对包括HYA/HYA、HYA/LYA、HYA/LXA、LYA/LYA和LYA/LXA，决定血清中MBL表达水平为中的单倍型包括LXA/LXA、HYA/LYB和LYA/LYB，决定血清中MBL表达水平为低的单倍型包括LXA/LYB和LYB/LYB。
基于以上MBL的生物学功能，我们因此推测，MBL有可能是SARS-CoV感染的易感基因。MBL基因中的多态性影响MBL在血清中的表达水平，进而导致基因型依赖性的SARS-CoV感染易感性的差异。
本发明的目的是通过病例-对照研究，分析MBL基因中上述可决定其血清含量的多态性位点，以检查这些多态性位点和SARS-CoV感染易感性间是否具有相关性。
发明内容
发明人通过病例-对照研究，分析了可决定血清中MBL表达水平的MBL基因的多态性，考察了MBL基因的这些多态性位点与SARS-CoV感染易感性的相关性。通过基于医院的大规模病例对照研究，进行了大量的临床及实验室实验和大样本的统计分析，判明携带MBL的230G/A或230A/A基因型的个体对SARS-CoV感染有更高的易感性。同时还判明，携带中或低MBL表达水平的单倍型的个体对SARS-CoV感染有更高的易感性(其中，决定血清中MBL表达水平为中的单倍型包括LXA/LXA、HYA/LYB和LYA/LYB，决定血清中MBL表达水平为低的单倍型包括LXA/LYB和LYB/LYB；这些单倍型是由MBL基因的G-550C(H/L)、G-221C(Y/X)和G+230A(A/B)这3个单核苷酸多态性(SNP)构建而成的)。
因此本发明鉴定了SARS-CoV感染的一种新的易感基因及其易感基因型和易感单倍型。
本发明还提供了一种检测与SARS-CoV感染易感性关联的易感位点G+230A基因型的方法，该方法为PCR产物测序法。
本发明还提供了一种通过检测MBL基因的G+230A位点来判定个体对SARS-CoV感染是否易感的方法。
本发明还提供了一种检测与SARS-CoV感染易感性关联的易感单倍型LXA/LXA、HYA/LYB、LYA/LYB、LXA/LYB和LYB/LYB的方法，该方法为以PCR产物测序法确定G-550C(H/L)、G-221C(Y/X)和G+230A(A/B)这3个SNP的基因型，然后以PHASE程序计算个体的单倍型。
本发明还提供了一种通过检测由MBL基因的G-550C(H/L)、G-221C(Y/X)和G+230A(A/B)这3个SNP组成的单倍型LXA/LXA、HYA/LYB、LYA/LYB、LXA/LYB和LYB/LYB来判定个体对SARS-CoV感染是否易感的方法。
本发明还提供了用于检测MBL基因多态性位点G-550C、G-221C和G+230A的引物对。
本发明进一步提供了一种检测与SARS-CoV感染关联的MBL基因的G+230A位点及易感单倍型所包括的其它2个位点(G-550C和G-221C)的试剂盒，以及上述试剂盒在人群中预防与控制SARS-CoV感染的应用。
一、如上所述，本发明提供了一种检测与SARS-CoV感染易感性关联的MBL基因的G+230A位点基因型的方法，该方法为PCR产物测序法。具体的说，包括了如下步骤1)对MBL基因G+230A位点所在区域设计基因序列特异性引物，并对样本基因组DNA进行热启动和梯度的特异性PCR扩增；2)对PCR产物进行测序，以此判明MBL基因G+230A位点的基因型。
二、本发明提供了与SARS-CoV感染易感性关联的2种易感基因型，即MBL基因的230G/A或230A/A基因型为SARS-CoV感染的易感基因型。并提供了一种通过检测MBL基因G+230A位点的基因型来判定人群或个体对SARS-CoV感染易感性的方法。该方法包括1)对MBL基因G+230A位点所在区域设计基因序列特异性引物，并对样本基因组DNA进行热启动和梯度的特异性PCR扩增；2)对PCR产物进行测序，以此判明MBL基因G+230A位点的基因型；3)当某一个体的MBL基因的G+230A位点表现为230G/A或230A/A基因型时，则表明该个体在SARS-CoV感染流行时感染该病毒的风险更高。
三、本发明提供了与SARS-CoV感染易感性关联的5种易感单倍型，即MBL基因LXA/LXA、HYA/LYB、LYA/LYB、LXA/LYB或LYB/LYB等5种单倍型组合为SARS-CoV感染的易感基因型。并提供了一种通过检测由MBL基因的G-550C(H/L)、G-221C(Y/X)和G-230A(A/B)这3个SNP组成的单倍型来判定人群或个体对SARS-CoV感染易感性的方法。具体的说，包括了如下步骤1)对MBL基因G-550C(H/L)、G-221C(Y/X)和G+230A(A/B)这3个位点所在区域设计基因序列特异性引物，并对样本基因组DNA进行热启动和梯度的特异性PCR扩增；2)对PCR产物进行测序，以此判明MBL基因G-550C(H/L)、G-221C(Y/X)和G+230A(A/B)这3个位点的基因型；3)以PHASE程序计算各个体中由MBL基因的G-550C(H/L)、G-221C(Y/X)和G+230A(A/B)这3个位点组成的单倍型。
四、本发明提供了一种检测与SARS-CoV感染易感性关联的MBL基因的单倍型LXA/LXA、HYA/LYB、LYA/LYB、LXA/LYB和LYB/LYB的方法，该方法为以PCR产物测序法确定MBL基因的G-550C(H/L)、G-221C(Y/X)和G+230A(A/B)这3个SNP的基因型，并以PHASE程序计算个体的单倍型。具体的说，包括了如下步骤1)对MBL基因G-550C(H/L)、G-221C(Y/X)和G+230A(A/B)这3个位点所在区域设计基因序列特异性引物，并对样本基因组DNA进行热启动和梯度的特异性PCR扩增；2)对PCR产物进行测序，以此判明MBL基因G-550C(H/L)、G-221C(Y/X)和G+230A(A/B)这3个位点的基因型；3)以PHASE程序计算各个体中由MBL基因的G-550C(H/L)、G-221C(Y/X)和G+230A(A/B)这3个位点组成的单倍型。
4)当某一个体表现为LXA/LXA、HYA/LYB、LYA/LYB、LYA/LYB或LYB/LYB单倍型时，则表明该个体在SARS-CoV感染流行时感染该病毒的风险更高。
五、检测MBL基因G+230A位点基因型的特异性引物对的序列为正向引物5’-CGGTCCCATTTGTTCTCACT-3’反向引物5’-TCACAAACTGCTGTGTGGAAT-3’检测MBL基因的G-550C和G-221C位点基因型的特异性引物对的序列为正向引物5’-AATGGGAGGAGGATTCAAGG-3’反向引物5’-CCTTGTGACACTGCGTGACT-3’
六、本发明进一步提供了一种检测与SARS-CoV感染关联的MBL基因的G+230A位点及易感单倍型所包括的其它2个位点(G-550C和G-221C)的试剂盒，其内装有一个或多个容器，容器内装有用以检测G-550C(H/L)、G-221C(Y/X)和G+230A(A/B)这3个位点基因型的一种或多种组分。与之同时提供的可以是经政府食品与药品监督管理部门审核的、有关药品或生物制品制造、使用及销售方面的信息。例如，在DNA的PCR扩增方法实施中，直接检测样品的G-550C(H/L)、G-221C(Y/X)和G+230A(A/B)这3个位点基因型的试剂盒，含有PCR的引物对(5’-CGGTCCCATTTGTTCTCACT-3’和5’-TCACAAACTGCTGTGTGGAAT-3’5’-AATGGGAGGAGGATTCAAGG-3’和5’-CCTTGTGACACTGCGTGACT-3’)，dNTPs，用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓冲液等。本领域技术人员已知，以上的组分仅是示意性的，所述用于PCR反应的DNA聚合酶可以是TaqDNA聚合酶，例如，HotStar Taq酶、Klenow片段，Tth DNA聚合酶，VENT DNA聚合酶等能够用于PCP扩增的酶。但为保证特异性扩增，除了引物和反应条件的优化外，应优选HotStar Taq酶。
使用方法说明如下对样品基因组DNA(其具体制备方法参见实施例)，分别用本发明提供的2对引物，按照如下反应体系和条件进行PCR扩增12.5-μl反应体系为20～100ng基因组DNA，0.2μM引物，0.2mM dNTP，1.5nM MgCl2，1.0 unit HotStarTaqTMDNA聚合酶以及1×缓冲液(QIAGEN，Chatsworth，CA)。95℃ 15min预变性后进行2个阶段的扩增，其变性和延伸条件一致，均为94℃30s和72℃50s，在第一阶段的13个循环中，退火温度从62℃开始每个循环降0.5℃，第二阶段扩增的退火温度则固定在56℃，最后的72℃延伸时间为7min。PCR产物经常规测序，根据峰图判断基因型。
七、本发明提供了与SARS-CoV感染易感性关联的MBL基因G+230A位点及易感单倍型所包括的其它2个位点(G-550C和G-221C)的检测方法及其在SARS-CoV感染人群预防和控制中的应用。例如，由于本发明证实了MBL基因G+230A位点，或由G-550C(H/L)、G-221C(Y/X)和G+230A(A/B)这3个位点组成的单倍型组合LXA/LXA、HYA/LYB、LYA/LYB、LXA/LYB或LYB/LYB，与SARS-CoV感染易感性存在关联，因此，在SARS-CoV感染人群的预防和控制中，就需要对所咨询的对象进行MBL基因的G-550C(H/L)、G-221C(Y/X)和G+230A(A/B)的基因型进行分析，以判断该对象是否携带有SARS-CoV感染易感基因型230G/A或230A/A，或者携带有易感单倍型组合LXA/LXA、HYA/LYB、LYA/LYB、LXA/LYB或LYB/LYB。对具有MBL基因230G/A或230A/A基因型，或者具有易感单倍型组合LXA/LXA、HYA/LYB、LYA/LYB、LXA/LYB或LYB/LYB的个体(表现为对SARS-CoV感染具有更高的易感性)，则可对之进行科学的干预，包括建议及早进行治疗性预防或者若有可能则接种SARS疫苗等，这样可以针对性地降低这些易感人群的SARS-CoV感染的风险。
具体实施例方式实施例1该实施例设计并合成了2对引物，并且在该引物对的基础上，设计了一种检测与SARS-CoV感染易感性关联的MBL基因的G+230A位点，以及由G-550C(H/L)、G-221C(Y/X)和G+230A(A/B)这3个SNP位点组成的易感单倍型组合LXA/LXA、HYA/LYB、LYA/LYB、LXA/LYB或LYB/LYB的方法。
1、基因组DNA的提取采取本领域常规的Miller改良盐析法提取外周血白细胞基因组DNA。
1)取柠檬酸钠或EDTA-Na2抗凝全血5ml(尽量不用肝素抗凝)，置于50ml有盖离心管；2)加入3-5倍体积冷蒸馏水，反复颠倒混匀，冰中放置5分钟，4℃2000rpm离心20分钟；3)缓慢倾倒上清，沉淀加入预冷的0.1％Triton-X100((体积同上)，轻柔混匀沉淀，如上离心，弃上清；4)沉淀加入4ml裂解液(50Mm Tris-Cl-10mM EDTA，pH8.0)，彻底打碎沉淀，然后加入10％SDS至终浓度为0.5％，混匀；5)加入蛋白酶K(10mg/ml)至终浓度为200μg/ml，混匀，55℃3小时或37℃过夜消化(以过夜消化为佳)；6)加入6M NaCl 1.2ml，剧烈振荡20秒，2,200rpm离心10分钟，将上清转移至另一个有盖离心管；7)加入2倍体积预冷无水乙醇，反复颠倒混匀至出现絮状DNA沉淀，挑出DNA至另一Eppendorf管；8)以75％预冷乙醇洗涤DNA沉淀2次；9)以0.5ml TE(10mM Tris-Cl-EDTA，pH8.0)或蒸馏水溶解DNA沉淀，电泳检测DNA片段大小，或测260/2.80nm OD比值。
2、PCR扩增分别用本发明提供的2对引物，按照如下反应体系和条件进行PCR扩增12.5-μl反应体系为20～100ng基因组DNA，0.2μM引物，0.2mM dNTP，1.5mM MgCl2，1.0unitHotStarTaqTMDNA聚合酶以及1×缓冲液(QIAGEN，Chatsworth，CA)。95℃15min预变性后进行2个阶段的扩增，其变性和延伸条件一致，均为94℃ 30s和72℃ 50s，在第一阶段的13个循环中，退火温度从62℃开始每个循环降0.5℃，第二阶段扩增的退火温度则固定在56℃。最后的72℃延伸时间为7min。PCR产物以测序法鉴定G-550C(H/L)、G-221C(Y/X)和G+230A(A/B)这3个位点的基因型。
3、单倍型计算对于已经测出G-550C(H/L)、G-221C(Y/X)和G+230A(A/B)这3个位点的基因型的个体而言，应用PHASE程序计算出其相应的单倍型。
实施例2该实施例用实施例1建立起来的方法，对352例SARS患者、392例健康对照个体的MBL基因的G-550C(H/L)、G-221C(Y/X)和G+230A(A/B)这3个位点的基因型进行了分析。
1、试验对象2003年5月到2003年7月期间，从北京小汤山医院的病房里收集符合世界卫生组织标准的SARS患者352例。这352例患者中，52例患有一些可能增加SARS风险的基础性疾病，如糖尿病、高血压、心脏病、肺结核、哮喘和肿瘤等重要疾病(为PI组)；另有20例是患有严重SARS的患者，他们入住重症监护病房(ICU)或者死亡(为PII组)；剩下280例为PIII组。另收集年龄、性别和种族匹配的健康个体392例作为对照人群。样本收集过程按照国家人类基因组研究伦理学准则进行，并获得了被募集对象的知情同意。
2、确定MBL基因G-550C(H/L)、G-221C(Y/X)和G+230A(A/B)这3个位点的基因型及由此3个位点构成的单倍型352例SARS患者和392例健康对照个体中MBL基因G-550C(H/L)、G-221C(Y/X)和G+230A(A/B)这3个位点的基因型频率分布如表1所示。
当PI+PII+PIII与对照比较时，230G/G的频率在SARS患者和健康对照中分别为65.6％和76.8％(OR值为1.73)，决定血清中MBL表达水平为高的单倍型的频率在SARS患者和健康对照中分别为64.0％和74.5％(OR值为1.67)；当PII+PIII与对照比较时，230G/G在SARS患者和健康对照中的频率分别为64.3％和76.8％(OR值为1.84)；决定血清中MBL表达水平为高的单倍型组合的频率在SARS患者和健康对照中分别为63.1％和74.5％(OR值为1.75)。因此，用本发明的方法解析了MBL的G+230A多态性位点及由G-550C(H/L)、G-221C(Y/X)和G+230A(A/B)这3个位点组成的单倍型组合与SARS感染易感性的相关性。
应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，但所作改动或修改的等价形式同样落在本申请权利书所限定的范围之内。
CI可信限。通过执行logistic回归分析多态性位点是否与SARS感染的易感性关联，分析时校正了年龄和性别这两种风险因素，并进行了多重检验校正。
a决定血清中MBL表达水平为高的单倍型组合包括HYA/HYA、HYA/LYA、HYA/LXA、IYA/LYA和LYA/LXA，决定血清中MBL表达水平为中的单倍型组合包括LXA/LXA、HYA/LYB和LYA/LYB，决定血清中MBL表达水平为低的单倍型组合包括LXA/LYB和LYB/LYB。
bG-550CG/G基因型与G/C+C/C基因型比较；G-221CG/G基因型与G/C+C/C基因型比较；G+230AG/G基因型与G/A+A/A基因型比较；单倍型高与中+低比较。
分型样本的数目因为少数个体分型的失败而有所变化。
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序列表<110>中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所<120>一种检测与SARS-CoV感染相关的易感基因MBL基因型的方法及MBL易感基因<160>4<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>1CGGTCCCATT TGTTTCTCACT 20<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>2TCACAAACTG CTGTGTGGAA T 21<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>3AATGGGAGGA GGATTCAAGG 20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>4CCTTGTGACA CTGCGTGACT 20
权利要求
1.一种检测MBL基因的G+230A位点的基因型的方法，该方法为PCR产物测序法，其特征在于包括以下方面1)对包含G+230A多态位点的MBL基因序列，设计特异性的引物，其序列为正向引物见序列表中序列1反向引物见序列表中序列2；2)对包含G+230A多态位点的MBL基因区域，以所设计引物，通过热启动和梯度的聚合酶链式反应，以基因特异性引物进行DNA扩增；3)对PCR产物以常规测序法测序，根据测序峰图结果判断G+230A的基因型。
2.如权利要求1所述检测MBL基因的G+230A位点的基因型的方法，其特征在于对包含G+230A多态位点的MBL基因序列所设计的特异性引物，其序列为正向引物见序列表中序列1；反向引物见序列表中序列2。
3.一种通过检测MBL基因的G+230A位点来判定个体对SARS-CoV感染是否易感的方法，其特征在于当某一个体的MBL基因的G+230A位点表现为基因型G/A或A/A时，则表明该个体对SARS-CoV感染具有更高的易感性。
4.一种检测MBL基因的G-550C(H/L)、G-221C(Y/X)和G+230A(A/B)3个SNP组成的单倍型的方法，该方法为PCR产物测序法，并以PHASE程序计算单倍型，其特征在于包括以下方面1)对包含G-550C(H/L)、G-221C(Y/X)和G+230A(A/B)这3个SNP位点的MBL基因序列，设计特异性的引物，检测MBL基因G+230A位点基因型的特异性引物对的序列为正向引物见序列表中序列1，反向引物见序列表中序列2；检测MBL基因的G-550C和G-221C位点基因型的特异性引物对的序列为正向引物见序列表中序列3，反向引物见序列表中序列4；2)对PCR产物以常规测序法测序，根据测序峰图结果判断G-550C(H/L)、G-221C(Y/X)和G+230A(A/B)这3个SNP位点的基因型；3)以PHASE程序计算各个体中由MBL基因的G-550C(H/L)、G-221C(Y/X)和G+230A(A/B)这3个位点组成的单倍型。
5.一种通过检测MBL基因的G-550C(H/L)、G-221C(Y/X)和G+230A(A/B)3个SNP组成的单倍型来判定个体对SARS-CoV感染是否易感的方法，其特征在于当某一个体的MBL的单倍型组合表现为LXA/LXA、HYA/LYB、LYA/LYB、LXA/LYB或LYB/LYB时，则表明该个体对SARS-CoV感染具有更高的易感性。
6.一种检测与SARS-CoV感染关联的MBL基因的G+230A位点及易感单倍型所包括的其它2个位点(G-550C和G-221C)的试剂盒，包括扩增用基因特异性引物、dNTP、用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓冲液的一种或多种，以及用于测序用的试剂中的一种或多种。
7.如权利要求1-6所述的任一项方法或其试剂盒在SARS-CoV感染的人群预防和控制以及遗传咨询中的应用。
全文摘要
本发明涉及与SARS－CoV感染易感性相关的甘露糖结合凝集素基因(MBL)的G+230A的一种检测方法，所述方法为PCR产物测序法。本发明还涉及与SARS－CoV感染易感性相关的由MBL基因G－550C、G－221C和G+230A这3个单核苷酸多态位点(SNP)组成的单倍型的检测方法，所述方法为先用PCR产物测序确定3个SNP位点基因型，然后用PHASE程序计算单倍型。本发明进一步涉及检测上述多态性位点的试剂盒及使用。另外，本发明将MBL的G+230A多态位点及由G－550C、G－221C和G+230A这3个SNP组成的单倍型与SARS－CoV感染的易感性联系起来，确定了MBL是SARS－CoV感染的一个新型易感基因，为SARS－CoV感染的人群预防和控制提供了新的遗传咨询内容。
文档编号C12Q1/68GK1896272SQ20051008299
公开日2007年1月17日 申请日期2005年7月12日 优先权日2005年7月12日
发明者贺福初, 周钢桥, 张红星, 翟芸, 智联腾, 杨灏 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所