在人实体瘤中的基因缺损和突变体alk激酶的制作方法

专利名称：在人实体瘤中的基因缺损和突变体alk激酶的制作方法
技术领域：
本发明通常涉及与癌症有关的蛋白质和基因，以及涉及癌症的 才企测、i貪断和治疗。
背景技术：
许多癌症以细胞信号通路的石皮坏为特征，其导致细胞过程的异 常控制，或导致不能控制细胞的生长和增殖。这些破坏经常由特定 信号蛋白(如激酶)活性的变化所引起。这些癌症包括实体瘤，如 非小细胞肺癌(NSCLC)。在美国，NSCLC是癌症死亡的主要原因， 并且占所有月申癌的约87%。在美国每年有约151,000个NSCLC新 病例，并且据估计-f义在美国每年120,000以上的患者将死于该疾病。 参见"C"wcer2G05，" American Cancer Society 。包括 三种不同亚型的NSCLC经常4又在它已经转移以后祐:;险测到，因此 在i貪断的两年内死亡率是75%。
已知，导致具有异常信号活性的激酶融合蛋白的基因缺失和/ 或易^f立可以直^妄导致某些癌症。例如，已直4妄i正明，BCR-ABL癌 蛋白( 一种酪氨酸激酶融合蛋白)是人慢性髓细胞性白血病(CML ) 的病原体。在至少90-95%的CML病例中发现的BCR-ABL癌蛋白 是通过基因序列从第9号染色体上的c-ABL蛋白质酪氨酸激酶易位到第22号染色体上的BCR序列而产生的，这产生所谓的费城染色 体。参见例如，Kurzock " "/.， TV.五"g/. 3/9: 990-998 (1988)。
在急性淋巴细胞白血病和NSCLC病例中也观测到易位。
已描述了导致与各种其它癌症有关的突变体或融合蛋白的基 因易^f立和缺失。1列^口， Falini"a/"S/ood 99(2" 409-426 (2002),纟宗 述了已知发生在血液癌症中的易位，包括在ALCL中发现的 NPM-ALK融合。到目前为止，仅描述了发生在肺癌中的有限数目 的基因易位、缺失、以及突变体蛋白质，包括涉及Notch3的t(15;19) 易位。参见Dang " a/" /胸/. Ow. 92(76" 1355-1357 (2000)。
在小细胞和非小细胞肺癌中已发现RNA结合蛋白-6(EML-4)表达和 /或活性方面的缺损。参见Drabkin " a/., (9wcoge"e S(76」.'2589-97 (1999)。然而，到目前为止，还没有描述在人NSCLC癌症中涉及蛋 白激酶的易位或缺失。
已描述了在间变性大细胞淋巴瘤中由于NPM与ALK的融合所 导至丈的ALK S敫酶表达方面的在夹损。参见Morris " a/., 1994; Shiota " "/.，1994。已描述了 ALK与膜突蛋白、非肌肌球蛋白重链9(Tort " a/. 2001)、网格蛋白(clarthrin)重链(TourioleM/" 2000; Bridge""/" 2001 )、原月几5求蛋白3(TPM3)(Lamant " 1999)、 TRK-融合基因 (TGF)(Hemandez W "/.，爿附.户"仇1487-1493 (2002))以及 其它基因的融合。尤其是，据报道在非实体淋巴瘤中有TGF-ALK 融合，但到目前为止，还未在实体瘤中描述这种融合。已描述了 ALK在癌症中的一4殳作用。参见Pulford " "/.， J！ Ce〃尸 Wo/. 7P9(3六 330-358 (2004)。然而，到目前为止，还没有描述在EML-4表达和/ 或激活方面的缺损。
高度期望鉴定在人癌症中的突变，因为它可以导致开发新疗法 (治疗剂)，其輩巴向这样的融合或突变体蛋白质，以及导致新i貪断 方法，用于鉴定具有这才羊的基因突变的患者。例如，BCR-ABL已 变成开发治疗白血病的治疗剂(疗法)的靶。最近，Gleevec (曱 磺酸伊马替尼，STI-571), ABL激酶的一种小分子抑制剂，已批准 用于治疗CML。这种药物是新类抗增殖剂的第一种药物，其用来对驱动肿瘤细胞生长的信号通路进行干扰。这种药物的开发相对于
CML和ALL的常规疗法(化疗和放射)而言代表一种显著的进步， 其中常规疗法受到众所周知的副作用的烦扰并且经常具有有限的 效果，因为它们不能特异性地靶向癌(恶性肿瘤)的基本的原因。 同样，已描述了用于特异性地检测患者中的BCR-ABL融合蛋白的 试剂和方法，以便鉴定最可能应答靶向抑制剂如Gleevec⑧的患者。
因此，仍然需要鉴定新的基因突变，如易位或缺失，其导致与 人癌症，尤其是实体瘤，包括肺癌如NSCLC的进展有关的融合或 突变体蛋白质，以及需要开发新的试剂和方法，用于研究和4企测这 样的融合蛋白。这样的融合蛋白的鉴定将尤其期望产生新方法来选 择用于靶向治疗的患者，以及用于筛选能抑制这样的突变体/融合蛋 白的新药物。

发明内容
根据本发明，在人实体瘤非小细胞肺癌(NSCLC)中现已鉴定 了发生在人第2号染色体中的新的基因缺失突变，其导致融合蛋白， 该融合蛋白结合部分间变性淋巴瘤激酶(ALK)和二级蛋白质。与 ALK融合有关的二级蛋白质包括棘皮动物微管结合蛋白样(棘皮类 微管关联蛋白样,Echinoderm Microtubule-Associated Protein-Like) 4(EML-4)和TRK-融合基因(TFG)。在非小细胞肺癌患者样品中目前 已7见测到突变体/融合ALK激酶。
因此本发明部分地提供了分离的多核苷酸和载体，其编码所披 露的突变体/融合ALK多肽，用于检测它们的探针和测定方法，分 离的突变体/融合ALK多肽，重组突变体多肽，以及用于才企测突变 体ALK多核苦酸和多肽的试剂。所^皮露的这些新的突变体ALK激 酶和易位/缺失的鉴定使得可以用新方法来确定在生物样品中突变 体ALK多核苦酸或多肽的存在，本发明还提供了对抑制突变体激 酶蛋白的化合物进行筛选的方法，以及对以突变体ALK多核苷酸 或多肽的表达为特征的癌症的进展进行抑制的方法。下面更详细地 描述本发明的方面和实施方式。
ii附图j兌明


图1A示出了 EML-4基因和ALK基因在第2号染色体上的位 置(图片A),全长EML-4和ALK蛋白质的结构域位置，以及 EML4-ALK融合蛋白(短变体)的结构域位置(图片B );融合接 头存在于氨基酸233-234,并且融合蛋白包括ALK的激酶结构域(但 不包括跨膜和胞外结构域)。还示出了 (在图片B中)EML4外显 子6/内含子6/ALK外显子20融合接头区的DNA (和蛋白质)序列 (分别为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8 )。
图1B示出了 EML-4基因和ALK基因在第2号染色体上的位 置(图片A),和全长EML-4和ALK蛋白质的结构域位置，以及 EML4-ALK融合蛋白(长变体)的结构域位置(图片B );融合接 头存在于氨基酸495-496，并且融合蛋白包括ALK的激酶结构域(但 不包括跨膜和胞外结构域)。还示出了 (在图片B中)EML4外显 子13/ALK外显子20融合接头区的DNA (和蛋白质)序列(分别 为SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25 )。
图1C示出了 TFG基因在第6号染色体上和ALK基因在第2 号染色体上的位置(图片A),和全长TFG和ALK蛋白质的结构 域位置，以及TFG-ALK融合蛋白的结构域位置(图片B );融合接 头存在于氨基酸138-139，并且融合蛋白包括ALK的激酶结构域(但 不包括跨膜和胞外结构域)。还示出了 (在图片B中)TFG外显子 3/ALK外显子20融合接头区的DNA(和蛋白质)序列(分别为SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27 )。
图2A是人EML4-ALK融合蛋白(短变体)的氨基酸序列(1 字母代码)(SEQ ID NO:l)(顶部图片)，还示出了编码DNA序列(SEQ ID NO:2 )(底部图片)；EML-4部分的残基用斜体表示，而ALK的 激酶结构域的残基用黑体表示。
图2B是人EML4-ALK融合蛋白(长变体)的氨基酸序列(1 字母代码)(SEQ ID NO:18)(顶部图片)，还示出了编码DNA序列(SEQIDNO:19)(底部图片)；EML-4部分的残基用斜体表示，而 ALK的激酶结构域的残基用黑体表示。
图2C是人TFG-ALK融合蛋白的氨基酸序列(1字母代码)(SEQ ID NO:20)(顶部图片)，还示出了编码DNA序列(SEQ ID NO:21 )(底 部图片)；TFG部分的残基用斜体表示，而ALK的激酶结构域的残 基用黑体表示。
图3A-3B是人EML-4蛋白质的氨基酸序列(1字母代码)(SEQ ID NO:3)(SwissProt Accession No. 061936)，还示出了编石马DNA序 歹'J ( SEQ ID NO:4 ) (GeneBank Accession No. NM019063);《呆留在 短变体缺失突变体中的残基被加上下划线，而保留在长变体中的残 基用斜体表示。
图4A-4B是人ALK激酶的氨基^列(1字母代码)(SEQ ID NO:5 ) (SwissProt Accession No. Q9UM73),还示出了编码DNA序 列(SEQ ID NO:6 ) (GeneBank Accession No. HSU66559); l呆留在缺 失突变体中的残基被加上下划线，而激酶结构域的残基用粗体表示。
图4C-4D是人TFG蛋白质的氨基酸序列(1字母代码)(SEQ ID NO:22)(SwissProt Accession No. Q92734),还示出了编码DNA序列 (SEQ ID NO:23)(GeneBank Accession No. NM006070); 4呆留在缺失 突变体中的残基净皮加上下划线。
图5是凝胶图(gels)，其示出了 ( A)借助于5'RACE产物并 通过ALK引物在2 4仑PCR以后ALK的才佥测；UAP表示通用扩增 引物，GSP表示基因特异性引物，(B)通过EML-4形成的融合基 因和通过RT-PCR形成的ALK缺失突变体的检测，(C )在人NSCLC 肺瘤冲羊品中通过5，RACE对EML4-ALK融合基因(短和长变体) 的枱r测，以及(D )在人NSCLC胂瘤样品中通过5，RACE对TFG-ALK 融合基因的^r测。图6示出了通过采用双色(橙色/绿色)断裂探针(包括ALK基因断裂点2p23相反侧的探针)的FISH测定法，对在H2228细胞中通过EML-4和ALK易位所形成的融合基因的检测；探针大小和位置示于上部图片中。
具体实施例方式
根据本发明，在人实体瘤非小细胞肺癌(NSCLC)中现已鉴定了导致突变体激酶融合蛋白的先前未知的基因缺失和易位，其中突变体激酶融合蛋白结合部分间变性淋巴瘤激酶(ALK)和部分二级蛋白质。与所发现的ALK融合有关的二级蛋白质包括棘皮动物微管结合蛋白样4 (EML-4)和TRK-融合基因(TFG )。
两种披露的发生在第2号染色体上的EML4和ALK基因之间的缺失产生融合蛋白，其结合EML-4 (401个氨基酸微管结合蛋白)的N端与ALK ( 1620个氨基酸膜酪氨酸激酶)的激酶结构域和C端。所得到的EML4-ALK融合蛋白(其分别为796个氨基酸(短变体)和1059个氨基酸(长变体)并保留ALK激酶活性)预期会驱动人实体瘤亚型(包^舌NSCLC)的增殖和存活。
所披露的发生在第6号染色体上的TFG基因和第2号染色体上的ALK基因之间的易位产生融合蛋白，其结合TFG (—种400个氨基酸蛋白质)的N端与ALK ( —种1620个氨基酸膜酪氨酸激酶)的激酶结构域和C端。所得到的TFG-ALK融合蛋白(其是701个氨基酸)先前在非实体人淋巴瘤中已观测到(Hernandez " a/.(2002)，上文)，但先前在实体瘤中没有描述。TFG-ALK融合蛋白保留ALK激酶活性，并且预期会驱动人实体瘤亚型(包括NSCLC )的增殖和存活。
虽然在NSCLC中已描述了几种导致异常融合蛋白的基因易位或缺失，包4舌涉及Notch3的t(l5; 19)易位(参见Dang W a/.，上文)，但目前披露的EML4-ALK缺失突变体和融合蛋白是新的。类似地，TFG-ALK易位突变体和融合蛋白，虽然在非实体瘤如淋巴瘤中是
14已知的，但在实体瘤NSCLC中是新的。EML-4是一种表达在大多数人组织中的微管相关蛋白。到目前为止，还没有报道在EML-4表达和/或活性方面的缺损。ALK是一种膜酪氨酸激酶，并且表达在人类的脑、CNS组织、以及小肠和睾丸中，但不表达在正常、淋巴样细胞中。在神经系统的正常发育和功能中它起重要的作用(Iwahara"a/" 1997)。
在间变性大细胞淋巴瘤和成神经细胞瘤中已发现在ALK表达和/或激活方面的缺损(参见Morris d a/" 1994, Osajima-Hakomori "a/.，2005)。已描述了 ALK与膜突蛋白、非肌肌球蛋白重链9、网格蛋白重链、原肌球蛋白3(TPM3)、 TRK-融合基因(TFG)、以及其它基因的鬲虫合。参见Tort W a/.; Touriol W a/., Hernandez W a/.，上文。有趣的是，所纟皮露的EML-4与ALK的融合(短变体)精确地存在于野生型(wild-type) ALK中的相同点(氨基酸1058),如先前4十只于其它ALK融合突变体所描述的。
如下文进一步描述的，目前已分离和测序了 EML4-ALK缺失突变体和表达的融合蛋白，并且产生了用于表达融合蛋白的cDNA。因此，本发明部分地提供了编码EML4-ALK融合多肽的分离的多核苷酸；杂交于这样的多核苷酸的核酸探针；以及利用这样的多斥亥芬酸来产生重《且突变体ALK多肽的方法、载体以及宿主细月包。本发明还部分地提供了分离的多肽，其包含编码EML4-ALK融合多肽的氨基酸序列；重组突变体多肽；以及分离的试剂，其特异性地结合于和/或检测EML4-ALK融合多肽，但不结合于或检测野生型EML-4或野生型ALK。本发明的这些方面(其将在下文进一步详细地描述)将尤其可用于进一步研究由突变体ALK激酶表达/活性驱动的癌症才几制，用于鉴定实体瘤(例如，癌，包4舌肺癌和肉瘤)以及其它癌症，其以所4皮露的ALK缺失和易位突变和/或融合蛋白、或突变体ALK激酶的表达/活性为特征，以及可用于实施本发明的方法，如下文进一步描述的。
新型ALK激酶突变体以及基因缺失和易4立突变的鉴定对于实体瘤如NSCLC的可能的诊断和治疗具有重要意义，其中实体瘤以这些融合蛋白中的一种或多种为特征。NSCLC，例如，经常仅在它转移以后才才企测到，因此在it断两年内的死亡率为75%。因此，高度期望能够尽早地鉴定具有基因突变(其可以导致NSCLC)的患者。
因此，起因于基因缺失的EML4-ALK融合蛋白(短和长变体)和起因于基因易位的TFG-ALK融合蛋白(其预期会驱动实体瘤，NSCLC，的增殖和存活)的发现〗吏得可以产生重要的新方法来准确地鉴定哺乳动物的实体瘤，包括肺癌(如NSCLC)，以及其它癌症，其中表达ALK融合蛋白(如EML4-ALK或TFG-ALK )。这些肿瘤4艮可能对突变体ALK蛋白如WHI-131或WHI-154的激酶活性的抑制剂起反应。尽早鉴定由突变体ALK激酶驱动的癌症的能力将大大有助于临床确定哪种疗法(治疗剂)或疗法组合将最适合于特定患者，从而有助于避免这样的靶向其它激酶的抑制剂处方，这些激酶事实上并不是驱动癌症的主要信号分子。
因此，本发明部分地提供了利用本发明的融合特异性和突变体特异性试剂来才全测癌症中ALK突变体多核苷酸和/或融合多肽的存在的方法。这样的方法可以用来例如鉴定实体瘤，如NSCLC，其可能对突变体蛋白质的ALK激酶活性的抑制剂起反应。本发明还部分地提供了用于确定化合物是否抑制以EML4-ALK融合多肽为特征的癌症的进展的方法。另外，本发明提供了一种通过抑制突变体多肽的表达和/或活性来抑制实体瘤进展的方法，其中实体瘤表达EML4-ALK融合多肽或TFG-ALK融合多肽。这样的方法将在下文进一步详纟田i也4苗述。
下文将更详细地描述本发明的另外的方面、优点以及实施方式。将本文引用的所有参考文献的全部内部结合于此作为参考。
16定义
如在本文中所4吏用的，以下术语具有指定的含义。
"抗体"是指所有类型的免疫球蛋白，包括IgG、 IgM、 IgA、 IgD以及IgE，包括Fab或其抗原识别片段，包括嵌合、多克隆以及单克隆抗体。如在本文中所使用的，术语"人源化抗体"是指这样的抗体分子，其中氨基酸已被非抗原结合区代替以便更接近地类似人抗体，同时仍然保留最初的结合能力。
术语"生物上活性的"是指具有天然存在分子的结构、调节、或生化功能的蛋白质。同样，"免疫学上活性的"是指天然、重组、或合成EML4-ALK或TFG-ALK融合多肽、或其任何寡肽诱导适当
术语"生物样品，，以其最广的含义使用，并且指任何怀lt包含ALK融合多核香酸或多肽或其片4殳(包括EML4-ALK和TFG-ALK融合多核苷酸和多肽)的生物样品，并且可以包括细胞、分离自细胞的染色体(例如， 一定范围的中期染色体)、基因组DNA(在溶液中或结合于固体载体如用于DNA分析)、RNA (在溶液中或结合于固体载体如用于RNA分析)、cDNA (在溶液中或结合于固体载体)、来自细胞的提取物、血液、尿、骨髓、或组织等。
就癌症和突变体ALK多核苷酸以及多肽而论，"特征为"是指这样的癌症，其中涉及ALK的基因缺失或易位和/或表达的融合多肽是存在的，这是与其中这样的基因缺失和/或融合多肽不存在的癌症相比。突变体多肽的存在可以整体上或部分地驱动这样的癌症的生长和存活。
"共有序列，，是指这样的核酸序列，其已被重测序以分离(分解)不需要的石咸基(uncalled base )，或其已利用XL-PCR ( PerkinElmer, Norwalk, Conn.)在5，和/或3'方向力口以延4申并测序过，或其已利用GELVIEWTM Fragment Assembly系统(GCQ Madison, Wis.)装配自多于一种Incyte克隆的重叠序列，或其已^皮延伸和装配。
17"ALK激酶-抑制治疗剂"是指任何包含一种或多种化合物(化 学的或生物的)的组合物，其直4妄或间接i也、并单独i也和/或作为融 合蛋白的一部分(如EML4-ALK融合蛋白和TFG-ALK融合蛋白)， 抑制野生型或截短的ALK激酶的表达和/或活性。
"衍生物"是指编码所披露的融合多核苷酸的核酸序列的化学 修饰或所编码的多肽本身。作为上述修饰的例证是用烷基、酰基、 或氨基基团代替氢。核酸衍生物将编码保留天然分子的基本生物特 性的多肽。
就本文4皮露的多肽、多核苷酸或试剂而i仑，"可才企测标记"是指 化学的、生物的、或其它修饰，包括但不限于荧光、质量、残基、 染料、放射性同位素、标记、或标志修饰等，借此可以才企测感兴趣 分子的存在。
就生物样品中的ALK融合多肽而论，"表达"或"表达的"是指与 其中该融合多肽未显著表达的对照样品相比显著表达。
"重同位素标记肽"(可与AQUA肽互换-使用)是指包括至少一
个重同位素标记的肽，其适合于绝对量化或检测蛋白质，如在 WO/03016861, "Absolute Quantification of Proteins and Modified Forms Thereof by Multistage Mass Spectrometry" (Gygi "/.)中戶斤4苗 述的，并在下文进一步描述。就上述AQUA肽而i仑，术语"特异性 地检测"是指肽将仅检测和量化包含AQUA肽序列的多肽和蛋白质 并且将不会显著地才企测并不包含AQUA肽序列的多肽和蛋白质。
"分离的"(或"基本上纯化的")是指离开它们的天然环境并 经分离的或隔离的核酸或氨基酸序列。它们优选为至少60%、更优 选75%、以及最优选90%或更大地不含它们天然伴随的其它成分。
"模拟物"是指这样的分子，按照ALK融合多肽或其部分的结 构开发其结构，因此同样能够实施易位相关的蛋白质样分子的一些 或所有作用。
18如本文所描述的，"突变体ALK"或"融合"多核苷酸或多肽是指 涉及ALK和二级蛋白质(例如，EML-4或TFG)的融合多核苷酸 或多肽。
"多核苷酸"(或"核苷酸序列")是指寡核苷酸、核苷酸、或 多核苷酸、以及其片断或部分，以及指基因组或合成起源DNA或 RNA,其可以是单链或双链的，并且表示有义链或反义链。
"多肽，，(或"氨基酸序列")是指寡肽、肽、多肽、或蛋白质 序列、以及其片断或部分，并且指天然存在或合成分子。其中本文 陈述的"氨基酸序列"是指天然存在的蛋白质分子的氨基酸序列，
"氨基酸序列"和类似术语，如"多肽"或"蛋白质"，并不是将 氨基酸序列限于与陈述的蛋白质分子有关的完全、天然氨基酸序 列。
"EML4-ALK融合多核苦酸"是指如本文描述的基本上纯化的 EML4-ALK缺失突变体基因产物或融合多核苷酸(短或长变体)的 核酸序列，其获自任何物种，尤其是哺乳动物，包括牛、羊、猪、 鼠、马、以及优选人，并且来自任何来源天然、合成、半合成、 或重组。
"EML4-ALK融合多肽"是指本文描述的基本上纯化的 EML4-ALK融合多肽(短或长变体)的氨基酸序列，其获自任何物 种，尤其是哺乳动物，包括牛、羊、猪、鼠、马、以及优选人，并 且来自<壬<可来源天然、合成、半合成、或重组。
"TFG-ALK融合多核苷酸"是指如本文描述的基本上纯化的 TFG-ALK易位突变体基因产物或融合多核香酸的核酸序列，其获 自任何物种，尤其是哺乳动物，包括牛、羊、猪、鼠、马、以及优 选人，并且来自4壬4可来源天然、合成、半合成、或重组。
"TFG-ALK融合多肽"是指本文描述的基本上纯化的TFG-ALK 融合多肽的氨基酸序列，其获自任何物种，尤其是哺乳动物，包括
19牛、羊、猪、鼠、马、以及优选人，并且来自任何来源天然、合 成、半合成、或重组。
关于抗体和蛋白质或肽的相互作用，术语"特异性地结合于" ((或"特异性地结合"或"特异的结合")是指，该相互作用取决于 在蛋白质上特定结构(即，抗原决定簇或表位)的存在；换言之， 抗体识别并结合于特定的蛋白结构而不是一般地结合于蛋白质。就 抗体结合于序列或抗原决定簇而不是结合于它对其是特异性的序 列或抗原决定簇而论，术语"并不结合"是指并不显著地与其反应， 这是与抗体结合于对其抗体是特异性的抗原决定簇或序列相比。
就序列或探针杂交条件而论，术语"严格条件"是"严格性"， 其发生在约Tm-5°C (低于探针或序列的解链温度(Tm)5。C)至低于 Tm约20。C至25。C的范围内。典型的严格条件是在42°C下在溶 液中过夜温育，其中溶液包含50%甲酰胺、5X.SSC(750mMNaCl， 75 mM 一宁檬酸三钠)、50 mM石粦酸钠(pH 7.6)、 5X Denhardt溶液、 10%硫酸右旋糖酐、以及20孩i克/ml变性的、切变的鮭鱼精DNA， 接着在约65。C的O.IXSSC中洗涤过滤器。如本领域4支术人员将明
苦酸序列。
突变体ALK多肽的"变体"是指被一个或多个氨基酸改变的 氨基酸序列。该变体可以具有"保守"变化，其中取代的氨基酸具 有类似的结构或化学性能，例如，用异亮氨酸代替亮氨酸。更例外 地，变体可以具有"非保守，，变化，例如，用色氨酸^替甘氨酸。 类似的较小变化还可以包括氨基酸缺失或插入，或两者。利用本领 i或众所周知的计算枳4l序，例如DNASTAR库欠件，可以找到指导， 其用来确定可以取代、插入、或缺失哪些氨基酸残基而不消除生物 或免疫活性。
A.在人实体瘤中的突变体ALK激酶的鉴定
在对来自非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系(包括H2228)的提取物 和来自患者的实体瘤进行全面磷酸化肽分布实验过程中意外地鉴
20定了本文披露的新的人基因缺失，其发生在第2号染色体上并导致 两种结合具有激酶结构域的EML-4的N端和ALK的C端的融合蛋 白变体的表达。NSCLC (—种实体瘤)是肺癌的一种亚型。在这些 缺失融合中涉及的蛋白质示于图1A-1B的图片A中。
利用最近描述的用于分离和质谱表征来自复杂混合物的〗奮饰 肽的4支术(参见美国专利/>开号20030044848, Rush w "Immunoaffinity Isolation of Modified Peptides from Complex Mixtures" ) ("IAP"才支术)，首次阐述了 H2228细胞系的石粦酸化分布， 如在下文的实施例1中进一步描述的。应用IAP技术并利用磷酸酪 氨酸特异性抗体(Cell Signaling Technology, Inc., Beverly, MA， 2003/04 Cat. #9411 )鉴定了 H2228细胞系表达ALK激酶，但蛋白 质被明显截短。该筛选鉴定了在细胞系中的许多其它激活的激酶， 包括已知在肺癌中被激活的某些激酶。然后通过5， RACE进行的序 列5，至ALK的分析鉴定了激酶#:融合到EML-4的N端(参见图6 )。
随后利用才目同的全面石粦酸基分布方式(phospho-profiling approach )对来自NSCLC患者的154个肿瘤样品进行的实验不4又证 实在那些患者群体中存在EML4-ALK (短变体)突变，而且揭示了 在其它患者群体中存在第二种EML4-ALK (长变体)以及存在 TFG-ALK突变(参见实施例IB和1C )。
通过利用siRNA沉默来抑制细胞可以i正实，突变体ALK蛋白 质在这些NSCLC肿瘤中正驱动细胞增殖和存活(参见实施例3 )。
通过PCR扩增EML4-ALK融合基因(短和长变体)和TFG-ALK 融合基因，然后分离并测序(参见实施例3)。如图1A-1B的图片B 所示，EML4-ALK缺失结合具有激酶结构域的野生型EML-4 (在 短变体中的氨基酸1-233,或在长变体中的氨基酸1-495 ) N端与野 生型ALK (氨基酸1057-1620 )的C端(还参见SEQ ID NOs: 3和 5 )。融合接头正好存在于野生型ALK的C端至跨膜结构域(参见 图1A-1B )。 EML4-ALK融合多肽分别保留EML-4的N端233或 495个氨基酸，其包括该蛋白质的巻曲螺旋结构域。所得到的分别 包含796个氨基酸(短变体)或1059个氨基酸(长变体)(参见图
211A-1B和图2A画2B的图片B(SEQ ID NOs: 1和18))的EML4-ALK 融合蛋白可保留ALK的激酶活性。涉及的外显子以及融合4妻头示 于图1A-1B(图片B)中。融合接头包括来自EML-4的内含子6, 其接着外显子6 (短变体)或来自EML-4 (长变体)的外显子13。
如图1C的图片B所示，TFG-ALK易4立结合具有激酶结构i或 的野生型TFG (氨基酸1-138)的N端与野生型ALK (氨基酸 1057-1620)的C端(还参见SEQIDNOs: 22和5;以及图1C的图 片B和图4C(SEQ ID NOs: 20和1))。融合4姿头正好存在于野生型 ALK的C端至跨膜结构域(参见图1C )并保留ALK的激酶活性。 涉及的外显子以及融合接头示于图1C(图片B)中。该融合接头包 括来自TFG的外显子3和来自ALK的外显子20。
FISH探针用来在一组400个石蜡包埋的人NSCLC肿瘤样品中 才企测EML4-ALK (短变体)融合蛋白的存在(参见实施例6和7; 图6)。在该样本量中这种短变体突变的发生率非常^f氐。然而，利用 IAP技术来4全查在另一组来自患者的154个冷冻人NSCLC肿瘤样 品中的全面磷酸化分布，则才企测到EML4-ALK融合蛋白(短和长 变体两者)、以及TFG-ALK融合蛋白的表达具有更高的发生率(参 见实施例1B )。
B.分离的多核苷酸
本发明部分地提供了编码EML4-ALK融合多肽的分离的多 核苷酸；杂交于上述多核苷酸的核苷酸探针，以及用于利用上述多 核苷酸来产生重纟且融合多肽的方法、载体、以及宿主细月包。
除非另有"i兌明，本文中通过测序DNA分子所确定的所有4亥苷 酸序列是利用自动4匕的DNA测序4义(如来自Applied Biosystems， Inc. 的型号373 )力口以确定的，并且由本文确定的DNA分子编石马的多 肽的所有氨基酸序列是利用自动化的肽测序4义加以确定的(参见实 施例2)。如本技术领域已知的，对于通过这种自动化方式确定的任 何DNA序列，本文确定的任何核苦酸序列可以包含一些误差。通
22过自动化方法确定的核苷酸序列通常至少约90%相同于，更通常至 少约95%至至少约99.9%相同于测序的DNA分子的实际核苷^f 列。实际序列可以通过其它方式更准确地加以确定，包括本领:威众 所周知的人工DNA测序方法。如本技术领域同样已知的，和实际 序列相比，在确定的核苦酸序列中的单插入或缺失爿夸在核苷酸序列 的翻译中引起移码，以致由确定的核苷酸序列编码的预测的氨基酸 序列将完全不同于由测得的DNA分子实际编码的氨基酸序列，其 开始于上述插入或缺失的点。
除非另有说明，本文陈述的每个核苷酸序列表示为脱氧核糖核 芬酸(简写为A、 G、 C以及T)的序列。然而，核酸分子或多核 苷酸的"核苷酸序列"对于DNA分子或多核苷酸是指脱氧核冲唐核 苦酸序列，而对于RNA分子或多核苷酸则是指核糖核苷酸(A、 G、 C以及U)的相应序列，其中在指定的脱氧冲亥外唐核香酸序列中的每 个胸苦脱氧核糖核苦酸(T)被核糖核苦酸尿苷(U)取代。例如，对照 具有SEQ ID NO: 2的序列(利用脱氧核糖核苷酸简写表示)的RNA 分子可用来指出RNA分子具有这样的序列，其中SEQ ID NO: 2的 每个脱氧核糖核苦酸A、 G或C已^皮相应的核糖核苷酸A、 G或C 取 ，并且每个脱氧冲亥4唐4亥香酸T已净皮核津唐4亥苷酸U取^。
在一种实施方式中，本发明提供了一种分离的多核苷酸，该多 核苷酸包含核苷酸序列，而该核苷酸序列至少95%相同于选自由以 下序列组成的组的序列
(a)编码棘皮动物微管结合蛋白样4/间变性淋巴瘤激酶 (EML4-ALK )融合多肽的核苷酸序列，包括SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 18的氨基酸序列；
(b )编码EML4-ALK融合多肽的核苦酸序列，所述核香酸序 列包括SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 19的核苷酸序列；
(c )编码EML4-ALK融合多肽的核苷酸序列，其中EML4-ALK 融合多肽包含EML-4的N端氨基酸序列(SEQ ID NO: 3的残基
231-233或SEQ ID NO: 3的残基1-495 )以及ALK的激酶结构域(SEQID NO: 5的残基1116-1383 );
(d )核苷酸序列，包含EML-4的N端核普酸序列(SEQ ID NO:4的核苦酸1-700或SEQ ID NO: 4的核苷酸1-1486 )以及ALK的激酶结构域核苷酸序列(SEQ ID NO: 6的核苷酸3348-4149 );
(e )核苷酸序列，包含至少6个邻接核苷酸，其围绕EML4-ALK融合多核普酸的融合接头(SEQ ID NO: 2的核苦酸700-701或SEQID NO: 19的核苷酸1486-1487 );
(f) 编码多肽的核香酸序列，包含至少6个邻接氨基酸，其围绕EML4-ALK融合多肽的融合接头(SEQ ID NO: 1的残基233-234或SEQ ID NO: 18的残基495-496 );以及
(g) 核香酸序列，其互补于(a) (-(f)的任4可核苷酸序列。
利用本文提供的信息，如图2中的核苷酸序歹'j(SEQ IDNO:2),并利用标准克隆和筛选方法，如利用mRNA作为原料来克隆cDNA的那些方法，可以获得本发明的核酸分子，其编码本发明的突变体ALK多肽。作为本发明的例证，在图2中描述的EML4-ALK融合多核普酸(短变体)(SEQ ID NO: 2)分离自人NSCLC细胞系的基因组DNA (如在在下面的实施例2中进一步描述的)。还可以在其它癌症(包括实体瘤)的基因组DNA或cDNA文库中鉴定融合基因，其中发生所披露的EML4-ALK基因缺失(第2号染色体)。
确定的EML4-ALK融合基因的核苦酸序列(SEQ ID NOs: 2和19)分别编码796个氨基酸的激酶融合蛋白(短变体)和1059个氨基酸的激酶融合蛋白(长变体)(参见图2A-B(SEQ ID NOs: 1和18)和图1A-B )。 EML4-ALK融合多核苷酸包括「野生型EML-4的部分核苷酸序列(参见图3(SEQIDNO:4))，其编码具有野生型ALK的部分核香酸序列(参见图4(SEQIDNO: 6))的蛋白质的N端(氨基酸l-233(短变体)或氨基酸l-495(长变体))，其中上述部分核苷酸序列编码上述蛋白质的激酶结构域和C端。参见图1A-B。激酶结构域包含在短变体融合蛋白(由短变体融合多核苷酸的核苷酸
874-1704编码)中的残基292-568或在长变体融合蛋白(由长变体融合多核苷酸的核苷酸1663-2494编码)中的残基555-831。参见图2A-2B。
如所指出的，本发明部分地提供了 EML4-ALK融合蛋白的成熟形式。根据信号假说，由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号或分泌前导序列，其在生长蛋白质链穿过糙面内质网的l命出已^皮引发以后剪切自成熟蛋白质。大多数哺乳动物细胞并且甚至昆虫细胞在相同的特异性下剪切分泌的蛋白质。然而，在某些情况下，分泌蛋白质的剪切并不是完全均匀的，其导致两种或更多种蛋白质的成熟物质。另外，4艮久已经知道，分泌的蛋白质的剪切特异性最终由完全蛋白质的一级结构确定，即，它是多肽的氨基酸序列所固有的。
具有例如由沉积的cDNA克隆编码的氨基酸序列的成熟EML4-ALK多肽是指，通过在哺乳动物细月包(例如，3T3纟田月包，如下所述)中表达完全可读框所产生的成熟形式的这种融合蛋白，其中完全可读冲匡是由沉积的克隆或其它编码成熟融合多肽的克隆的人DNA序列编码的。
如所指出的，本发明的多4亥苦酸可以具有RNA的形式，如mRNA,或具有DNA的形式，包4舌，例如，cDNA和基因组DNA(通过克隆获得或合成产生)。该DNA可以是双链或单链的。单链DNA或RNA可以是编码链，还称作有义链，或它可以是非编码链，还称作反义4连。
本发明的分离的多核苷酸是核酸分子、DNA或RNA,其已离开它们的天然环境。例如，对于本发明来说，包含在载体中的重组DNA分子被认为是分离的。分离的DNA分子的另外的实例包括保持在异源宿主细胞中的重组DNA分子或在溶液中的经纯化(部分地或基本上)的DNA分子。分离的RNA分子包括本发明的DNA分子的体内或体外RNA转录物。才艮据本发明的分离的核酸分子进一步包4舌上述合成产生的分子。本发明的分离的多核苷酸包括图2A-B所示的DNA分子(SEQID NOs: 2和19 );图1A-B所示的包含用于成熟EML4-ALK融合蛋白的编码序列的DNA分子(SEQ ID NOs: 1和18);以及这样的DNA分子，其包含显著不同于上述序列的序列，但由于遗传密码的筒并，其仍然编码本发明的ALK突变体多肽。遗传密码在本才支术领域是众所周知的，因此本领域4支术人员可以常规地产生上述简并变体。
在另一种实施方式中，本发明提供了一种分离的多核苷酸，该多核香酸编码EML4-ALK融合多肽，其包括包含在上述沉积的cDNA克隆中的EML4-ALK融合核苷酸序列。优选地，上述核酸分子将编码由沉积的cDNA克隆或另 一种克隆(其表达本文描述的全长EML4-ALK融合蛋白)编码的成熟融合多肽。在另一种实施方式中，本发明^是供了一种分离的核苷酸序列，该核苷酸序列编码EML4-ALK融合多肽，其包含EML-4的N端氨基酸序列(SEQ IDNO: 3的残基1-233或SEQ ID NO: 3的残基1-495 )以及ALK的激酶结构域(SEQ ID NO: 5的残基1116-1383 )。在一种实施方式中，包含ALK的^敫酶结构j或的多肽包4舌SEQ ID NO: 5的残基1057-1620 (参见图1，图片B)。在另一种实施方式中，上述EML-4的N端氨基酸序列和ALK的激酶结构域分别由包含SEQ ID NO: 4的核普酸1-700或SEQ ID NO: 4的核苷酸1-1486和SEQ ID NO: 6的核苷酸3171-4860的核苷酸序列加以编码。
本发明进一步提供了分离的多核苷酸，该多核苷酸包含这样的核苷酸序列，其具有互补于本发明的突变体ALK多核苷酸之一的序列。上述分离的分子，尤其是DNA分子，可作为^t罙针，用于通过与染色体的原位杂交进行基因作图，以及用于冲企测EML4-ALK融合蛋白在人組织中的表达，例如，通过RNA印迹分沖斤，如在下面的F部分中进一步描述的。
本发明进一步涉及本文描述的分离的核酸分子的片断。本发明的分离的EML4-ALK多核苷酸的片断是指长度至少约15个核苷酸的片断，更优选至少约20个核苷酸，进一步更优选至少约30个核普酸，并且甚至更优选至少约40个核苷酸，如本文所讨i仑的，其可以用作i貪断4采针和引物。当然，才艮据本发明，也可以4吏用长度约50-1500个核香酸的更大片断，因为这些片断对应于大多数(如果不是所有)沉积的cDNA的突变体ALK核普酸序列或如图2所示(SEQ ID NO: 2)或其它克隆，其表达融合多核苷酸，如图2A-B所示(SEQIDNOs:2或19)。长度至少20个核苷酸的片断，例如，是指这样的片断，其包括20个或更多邻4妄相应核苷酸序列(片断由其书f生)的碱基。本4页域」技术人员可以用常失见方法产生上述DNA片断，并且可以例如通过限制性内切核酸酶剪切或声处理剪切可获自沉积的cDNA克隆的DNA来完成，或才艮据本文披露的序列加以合成。可替换地，可以直接合成产生上述片断。
本发明的优选的核酸片断或探针包括这样的核酸分子，其编码EML4-ALK融合基因产物的融合接头(参见图1A-B，图片B )。例如，在某些优选的实施方式中，本发明的分离的多核苷酸包4舌核苷酸序列/片断，其包含围绕EML4-ALK融合多核苷酸的融合接头(SEQ ID NO: 2的核苷酸700-701或SEQ ID NO: 19的核苦酸1486-1487)的至少6个邻接核苷酸(参见图1A-B,图片B(SEQ IDNOs:8和))。在另一种优选的实施方式中，本发明的分离的多核普酸包括编码多肽的核普酸序歹'J/片断，该多肽包含围绕EML4-ALK融合多肽的融合接头(SEQ ID NO: 1的残基233-234或SEQ ID NO:18的残基495-496 )的至少6个邻接氨基酸(参见图1A-B,底部图片(SEQ ID NOs: 7和24))。
在另一个方面，本发明提供了一种分离的多核苷酸，其在严格杂交条件下杂交于如本文所描述的本发明的突变体ALK多核苷酸的一部分。"严格杂交条件"是指在42。C下在溶液中过夜温育，其中所述溶液包含50%甲酰胺、5X.SSC (750mMNaCl、 75 mM柠4象酸三钠)、50mM石粦酸钠(pH7.6)、 5X Denhardt溶液、10。/。碌u酸右旋糖酐、以及20微克/ml变性的、切变的鲑鱼精DNA,接着在约65°C下在0.1XSSC中洗涤过滤器。
27杂交于多核苷酸的"一部分"的多核苷酸是指这样的多核苷酸
(DNA或RNA )，其杂交于参比多核苷酸的至少约15个核苷酸(nt), 更优选至少约20个nt，进一步更优选至少约30个nt,以及甚至更 <尤选约30-70个nt。如在上文所讨i仑的和在下文更详细描述的，这 些杂交于多核苷酸的"一部分"的多核苷酸可用作it断4笨针和引物。
当然，才艮据本发明，杂交于更大部分参比多核苷酸(例如，在 图2中描述的成熟EML4-ALK融合多核苷酸(SEQ ID NO: 2))，例 如，长度为部分50-750个nt,或杂交于整个长度的参比多核苷酸的 多核普酸也可以用作探针，因为多核苷酸对应于大多数(如果不是 所有)的沉积的cDNA的核苷酸序列或图2A-B所示的核苷酸序列 (SEQ ID NOs: 2或19 ),或图1A-B(图片B)所示的核苷酸序歹'J( SEQ ID NOs: 7和24 )。
"长度至少20个核苷酸"的部分多核苷酸，例如，是指来自 参比多核苷酸的核苷酸序列的20个以上邻接核苷酸。如所指出的， 这样的部分可以诊断上用作探针(按照常规DNA杂交技术)或用 作引物，通过聚合酶链反应(PCR)用于靶序列的扩增，如例如在 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed.， Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T.， eds.， Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)中所描述的，将其全部4皮露内 容以引用方式结合于本文。当然，仅杂交于多聚腺苷酸序列(如图 2所示的EML4-ALK序列(SEQ ID NO: 2 )的3'端多聚(腺香)段)或 仅杂交于T(或U)残基的互补段序列的多核苷酸将不包括在本发明 的用来杂交于本发明的部分核酸的多核苷酸中，因为这才羊的多核苷 酸将杂交于任何包含多聚(腺苷)段或其补体的核酸分子(例如，实 际上任何双链cDNA克隆)。
如所指出的，本发明的核酸分子，其编码本发明的突变体ALK 多肽，可以包括但不限于那些单独地编码成熟多肽的氨基酸序列的 核酸分子；用于成熟多肽和另外序列的编码序列，如那些编码前导 或分泌序列的编码序列，如前体蛋白序列、或原蛋白序列或前原蛋 白序列；成熟多肽的编码序列，具有或没有上述另外的编码序列，
28连同另外的、非编码序列，包括例如但不限于内含子和非编码5， 和3，序列，如转录的、非翻i,序列，其在转录、mRNA加工中起作 用，包括剪接和聚腺苷酸化信号，例如，mRNA的核糖体结合和稳 定性；另外的编码序列，其编码另外的氨基酸如那些提供另外功能 的氨基酸。
因此，编石马多肽的序列可以^皮融合到标i己序列，如对肽进4亍编 码的序列，其促进融合多肽的纯化。在本发明的该方面的某些优选 实施方式中，标记氨基酸序列是六组氨酸肽，如提供在pQE载体中 的标记(Qiagen， Inc.)，其中i午多可商业上获4寻。如在Gentz w "/., 」Va" ^cad t/&4<§<5, 821-824 (1989)中所描述的，例如，六组氨酸 提供融合蛋白的方便纯化。"HA"标记是另一种可用于纯化的肽， 其对应于衍生自流感血凝素蛋白的表位，这已由Wilson a "/.， Ce〃 37.'767(1984)力口以描述。如下面所"i寸i仑的，其它这才羊的融合蛋白包 括本身在N端或C端融合到Fc的EML4-ALK融合多肽。
本发明进一步涉及本发明的核酸分子的变体，其编码本文披露 的EML4-ALK融合多肽的部分、类似物或4汙生物。变体可以是天 然存在的，如天然等位基因变体。"等位基因变体"是指基因的多 种替换形式之一，其中基因占据生物体的染色体上的给定基因座。 参见，4列长口， Genes II， Lewin， B.， ed., John Wiley & Sons, New York (1985)。可以利用本领域已知的诱变技术来产生非天然存在的变体。
这样的变体包括那些由核苷酸取代、缺失或加成(添加)所产 生的变体。取fC、击夹失或力。成可以涉及一个或多个核苷酸。可以在 编码区、非编码区、或两者中改变变体。在编码区中的变化可以产 生保守或非保守氨基酸取代、缺失或加成。其中尤其优选的是沉默 取代、加成以及缺失，其并不改变本文披露的突变体ALK多肽的 性能和活性(例如，激酶活性)。在这方面还尤其优选的是保守取 代。
本发明的进一步的实施方式包4舌分离的多核苷酸，其包含至少 90%相同于，以及更优选至少95%、 96%、 97%、 98%或99%相同于本发明的突变体ALK多核苷酸的核苷酸序列(例如，编码具有 图2所示的完全氨基酸序列(SEQ ID NO: l)的EML4-ALK融合多肽 的核苷酸序列，或编码EML-4的N端和ALK的纟敫酶结构Jt或的核香 酸序列(参见图1，图片B;以及图3和4);或互补于上述典型序 列的核香酸)。
具有至少，例如，95% "相同"于参比冲亥苷酸序列(其编石马突 变体ALK多肽)的核苷酸序列的多核苷酸是指，多核苷酸的核苷 酸序列相同于参比序列，只是对于参比核苷酸序列(其编码突变体 ALK多肽)的每100个核苷酸，多核香酸序列可以包4舌多达5个点 突变。换言之，为了获得其核苷酸序列至少95%相同于参比核苷酸 序列的多核苷酸，参比序列中的多达5%的核苷酸可以击夬失或用另 一种核苷酸取^，或参比序列中的总核苷酸的多达5%的核苷酸可 以被插入参比序列。参比序列的这些突变可以发生在参比核苷酸序 列的5，或3，端位置或这些末端位置之间的任何地方，其单独地散布
4妄组中。
事实上，可以利用已知计算枳4呈序如Bestfit禾呈序(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711 )来常规地确定是否任何特定的核酸分子至少90%、 95%、 96%、 97%、 98%或99%相同于，例如，图2A-B所示的核苷酸序列 (SEQIDNOs:2和19)或相同于上述沉积的cDNA克隆的核香酸 序列。Bestfit釆用Smith和Waterman的局部同源算法，^c/wwces
Ma么'482-489 (1981)，来发现两个序列之间的最好 同源节段。当利用Bestfit或任何其它序列对比程序来确定特定序列 是否，例如，95%相同于才艮据本发明的参比EML4-ALK融合多核苷 酸序列或截短的ALK多核苷酸序列时，当然要设置参数，使得相 对于参比核苷酸序列的全长来计算同一性的百分比，以及在参比序 列中多达核苷酸总数5%的同源缺口 (间隙)是允许的。
30本发明在其范围内包括这样的核酸分子，其至少90%、 95%、 96% 、 97% 、 98%或99%相同于图2所示的核酸序列(SEQ ID NO: 2 )， 或相同于沉积的cDNA的核酸序列，而不考虑它们是否编码具有 ALK激酶活性的多肽。这是因为，甚至在特定核酸分子并不编码具 有ALK激酶活性的融合多肽的情况下，本领域技术人员将仍然知 道如何将核酸分子用作，例如，杂交探针或聚合酶链反应(PCR)引 物。本发明的并不编码具有激酶的多肽的核酸分子的应用尤其包括 (1 )分离cDNA文库中的EML4-ALK缺失基因、或截短的ALK 基因、或其等位基因变体；(2)原位杂交(例如，"FISH")于中期 染色体扩展(染色体铺展，chromosomal spreads )以提供EML4-ALK 缺失基因或截短的ALK基因的精确的染色体位置，如在Verma w Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988)中所描述的；以及RNA印迹分析，用于4企测 在特定组织中EML4-ALK融合蛋白或截短的ALK激酶mRNA的 表达。
然而，优选的核酸分子具有这样的序列，这些序列至少95%相 同于本发明的突变体ALK多肽或相同于沉积的cDNA的核S臾序列， 其事实上编码具有ALK激酶活性的融合多肽。上述活性可以类似 于，但不一定相同于本文披露的EML4-ALK融合蛋白(全长蛋白 质、成熟蛋白质、或保留激酶活性的蛋白质片段)的活性，如用特 定生物分4斤法测-彈的。例如，通过确定ALK ;粦酸4b—个或多个酪 氨酸(其包含肽底物，例如，胰岛素受体底物1或2(IRS1, IRS2)， 其是ALK激酶的底物)的能力可以纟企查ALK的激酶活性。
由于遗传密码的简并，本领域技术人员将立即认识到，大量的 具有的序列至少90%、 95%、 96%、 97%、 98%、或99%相同于沉 积的cDNA的核酸序列或图2A-B所示的核酸序列(SEQ IDNOs: 2 和19)的核酸分子将编码具有ALK活性的突变体多肽。事实上， 因为这些核普酸序列的简并变体都编码相同的多肽，所以这对于本 领域技术人员是显而易见的，即使没有进行上述比较测定。在本领 域将进一步明了，对于这样的并不是简并变体的核酸分子，合理数 目的核酸分子将同样编码保留ALK激酶活性的多肽。这是因为本
31领域技术人员完全明了较少可能或不可能显著影响蛋白质功能的 氨基酸取代(例如，用第二种脂族氨基酸代替一种脂族氨基酸)。
例如，关于如何进行表型沉默氨基酸取代的指导提供在Bowie ef <a/.， "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions," 5Wewce 247.' 1306-1310 (1990)中，其描 述了两种主要方式来研究氨基酸序列对变化的耐受性。第一种方法 依赖进化过程，其中通过自然选择来接收或排斥突变。第二种方法 利用基因工程来在克隆的基因的特定位置《1入氨基酸变化，以及利
用选择或筛选来鉴定保持功能的序列。这些研究已揭示了，蛋白质 惊人地耐受氨基酸取代。熟悉这种技术的技术人员还明了，在蛋白 质的一定位置，哪些氨基酸变化可能是允许的。例如，大多数隐蔽 氨基酸残基需要非极性侧链，而表面侧链的^f艮少特征通常是保守 的。其它上述表型沉默取代描述在Bowie " a/.(上文)，以及其中 引用的参考文献中。
本领域中众所周知的和一般可获得的DNA序列分析的方法可 以用来实施本发明的任何多核普酸实施方式。该方法可以采用这样 的酶如DNA聚合酶I的克林诺片断、SEQUENASE (US Biochemical Corp, Cleveland, Ohio )、 Taq聚合酵(Perkin Elmer )、耐 热T7聚合酶(Amersham， Chicago, IL )、或重组聚合酶和校正外切 片亥@臾酶的纟且合4口由Gibco BRL ( Gaithersburg， Md.)出售的 ELONGASE扩增系统。优选地，该过程是借助于仪器自动进行， 如Hamilton Micro Lab 2200 ( Hamilton, Reno, Nev, )、 Peltier Thermal Cycler ( PTC200; MJ Research, AVatertown， Mass.)以及ABI 377 DNA 观'J序4义(Perkin Elmer )。
编石马本发明的突变体ALK多肽的多4亥普酸序列可以^吏用部分 核苷酸序列加以延伸并釆用本4页i或已知的各种方法来4企测上游序 列如启动子和调节元件。例如，可以采用的一种方法，"限制位点，， PCR，使用通用引物来挽回(恢复，retrieve)相邻于已知基因座的 未知序歹'J ( Sarkar, G., PC7 MeAoA^^//c. 2: 318-322 (1993))。尤其 是，在存在接头序列的引物和对于已知区特异性的引物的情况下首先扩增基因组DNA。示例性的引物是那些在本文的实施例2中描 述的引物。扩增序列然后经受第二轮PCR，其中使用相同的接头引 物和第一种引物内部的另一种特异性引物。借助于适当的RNA聚 合酶转录每轮PCR的产物并利用反转录酶进行测序。
利用基于已知区的趋异性引物，反向PCR还可以用来扩增或 延4申序列(Triglia W a/., iVwc/e/c ^c,'A i 仏8186 (1988))。利用 OLIGO 4.06引4勿分才斤丰欠4牛(National Biosciences Inc., Plymouth, Minn.)、或另一种适当的程序，引物可以被设计成长度为22-30个 核普酸，具有50%或更大的GC含量，以及在约68-72。C的温度下 退火成靶序列。该方法使用多种限制酶以在基因的已知区域中产生 适当的片断。然后通过分子内连接反应环化该片断并用作PCR模 板。
可以使用的另 一种方法是捕捉PCR，其涉及DNA片断的PCR 扩增，其中DNA片断相邻于人和酵母人工染色体DNA中的已知序 歹'J (Lagerstrom " ,尸C7 Afe六111画119 (1991))。在该 方法中，多限制酶消化和连接作用还可以用来在进行PCR以前将工 程双链序列i文入DNA分子的未知部分中。可以用来4免回未知序列 的另一种方；去是4苗述在 Parker " "/., 7Vwc/e/c Jc/ds 79: 3055-3060 (1991)中的方法。另外，可以使用PCR、套式引物、以及 PROMOTERFINDER⑧文库来步查(walk in )基因组DNA( Clontech, Palo Alto, Calif.)。这种方法避免需要筛选文库并且可用于发现内含 子/外显子接头。
当筛选全长cDNA时，优选使用已大小选择的文库以包括更大 的cDNA。并且，随机引物文库是优选的，因为它们将包含更多序 列，其包含基因的5，区。随才几引物文库可以尤其优选用于这样的情 况，其中寡d(T)文库并不产生全长cDNA。基因组文库可以用于延 伸序列到5，和3'非转录调控区。
可商业上获得的毛细管电泳系统可以用来分析测序或PCR产 物的大小或证实测序或PCR产物的核苷酸序列。尤其是，毛细管测
33序可以采用用于电泳分离的可流动聚合物，；敫光活化的四种不同的 荧光染料(对于每种核苷酸用一种)，以及通过电荷耦合器件照相
机检测发射波长。利用适当的软件(例如，GENOTYPERtm和 SEQUENCE NAVIGATORtm , Perkin Elmer)可以将车#出/光强度转 换成电信号并且可以计算机控制从装载样品到计算机分析和电子 凄t据显示的整个过程。毛细管电泳尤其优选用于小片DNA(可能 以有限量存在于特定样品中)的测序。
C.载体和宿主细胞
本发明还4是供重组载体，其包含本发明的分离的多核苷酸； 宿主细胞，其是借助于重组载体而基因工程的；以及通过重组:技术， 重组EML4-ALK多肽或其片断的生产。
利用众所周知的技术如侵染、转导、转染、转位、电穿孔以及 转化，可以将重组构建物引入到宿主细胞中。载体可以是，例如， 噬菌体、质粒、病毒或反转录病毒载体。反转录病毒载体可以是可 复制的或复制缺陷的。在后一种情况下，病毒繁殖通常将仅发生在 互4卜宿主细月包中。
可以将多核苷酸连接于包含用于在宿主中繁殖的选择性标记 的载体。通常，在沉淀物中，如^粦酸4丐沉淀物，或在与带电荷脂质 的复合物中，引入质粒载体。如果载体是病毒，则利用适当的包装 细胞系，它可以被体外包装，然后^皮转导到宿主细力包中。
优选包括相对于感兴趣的多核苷酸的顺式作用调控区的载体。 在引入宿主以后，适当的反式作用因子可以由宿主供》合，由互4卜载 体供给或由载体本身供给。关于这点，在某些优选的实施方式中， 载体提供特异性表达，其可以是可诱导的和/或细胞类型特异性的。 在上述载体中特别优选的是那些通过容易控制的环境因素(如温度 和营养添加剂)可诱导的载体。
可用于本发明的表达载体包括衍生自染色体的载体、衍生自附 加体的载体以及衍生自病毒的载体，例如，衍生自细菌质粒、噬菌
34体、酵母附加体、酵母染色体元件、病毒(如杆状病毒、乳多空病 毒、痘苗病毒、)腺病毒、鸡痘病毒、作i狂犬病病毒以及反转录病毒) 的载体，以及衍生自其组合的载体，如黏粒和噬菌粒。
包含本发明的EML4-ALK多核苷酸的DNA插入片^殳应操:作性 地连4妄于适当的启动子，如X噬菌体PL启动子，大肠杆菌lac、 trp 以及tac启动子，SV40早期和晚期启动子以及反转录病毒LTR的 启动子(仅列举几种)。其它适宜的启动子是本领域4支术人员已知 的。表达构建物将进一步包括转录起始位点，终止位点，以及在转 录区用于翻译的核糖体结合位点。由构建物表达的成熟转录物的编 码部分将优选包括在最初起始的翻i奪和终止密码子(UAA、 UGA
或UAG )，其适当地定位在待翻i爭的多肽的末端。
如所指出的，表达载体将优选包括至少一种选择性标记。这样 的标记包括二氢叶酸还原酶或用于真核细"包i咅养的新霉素抗性基 因以及用于大肠杆菌和其它细菌中培养的四环素或氨节青酶素抗 性基因。适当宿主的代表性实例包括但不限于细菌细胞，如大肠杆 菌、链霉菌以及鼠伤寒沙门氏杆菌细胞；真菌细胞，如酵母细胞； 昆虫细胞如果蝇S2和夜蛾Sf9细胞；动物细胞如CHO、 COS以及 Bowes黑色素瘤细月包；以及才直物细月包。用于上述宿主细胞的适当的 培养基和条件在本领域是已知的。
在载体中，优选供细菌之用的载体包括可获自Qiagen的 pQE70、pQE60禾口 pQE-9;可获自Stratagene的pBS载体、Phagescript 载体、Bluescript载体、pNH8A、 pNH16a、 pNH18A、 pNH46A;以 及可获自Pharmacia的ptrc99a、 pKK223-3、 pKK233-3、 pDR540、 pRIT5。其中优选的真核载体是可获自Stratagene的pWLNEO、 pSV2CAT、pOG44、pXTl和pSG;以及可获自Pharmacia的pSVK3、 pBPV、 pMSG和pSVL。其它适宜的载体对于本领域技术人员来说 将是显而易见的。
在适合于供本发明之用的已知细菌启动子中包括大肠杆菌lacl 和lacZ启动子、T3和T7启动子、gpt启动子、人PR和PL启动子
35以及trp启动子。适宜的真核启动子包4舌CMV立即早期启动子、 HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒LTR 的启动子，如劳氏肉瘤病毒(RSV)的启动子、以及金属硫蛋白启动 子，如小鼠金属硫蛋白-I启动子。
在酵母(酿酒酵母)中，可以^吏用多种载体，其包含组成型或 -漆导型启动子如oc因子、乙醇氧化酶、以及PGH。关于综述，参 见Ausubel " (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, and Grant Me^o<^y五w2y附0/.
"丄516-544 (1997)。
可以通过磷酸钓转染、DEAE-葡聚糖介导转染、阳离子脂质介 导转染、电穿孔、转导、侵染或其它方法来实现将构建物引入宿主 细胞。这样的方法描述在许多标准实验室手册中，如Davis " a/., Basic Methods In Molecular Biology (1986)。
可以通过将增强子序列插入到载体中来增加DNA的转录，其 中DNA通过高等真核生物编码本发明的EML4-ALK融合多肽。增 强子是DNA的顺式作用元件，通常约10至300bp，其用来在^合定 的宿主细胞类型中增加启动子的转录活性。增强子的实例包括 SV40增强子，其位于复制起点的后侧(late side)(在碱基对100 至270处)，巨细胞病毒早期启动子增强子，在复制起点的后侧上 的多瘤增强子，以及l^病毒增强子。
为了将翻译蛋白分泌进入内质网的腔、进入周质间隙或进入胞 外环境，可以将适当的分泌信号加入到表达多肽中。该信号对于多 肽而言可以是内源的或它们可以是异源信号。
可以以-修饰形式，如融合蛋白(例如，GST-融合)，来表达多 肽，并且不l又可以包括分泌信号，而且包括另外的异源功能区。例 如，可以将另外的氨基酸(尤其是带电荷的氨基酸)区加入到多肽 的N端中以在纯化期间或在随后的处理和贮存期间改善在宿主细 胞中的稳定性和持久性。同样地，可以将肽部分加入到多肽中以促 进纯化。可以在多肽的最终制备以后除去这样的区域。将肽部分加
36入到多肽以引起分泌或排泄，从而改善稳定性以及促进纯化(除了 别的之外)，在本领域是熟悉和常身见的技术。优选的融合蛋白包含 来自免疫球蛋白的异源区，其可用来溶解蛋白质。
通过众所周知的方法，包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离 子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用层析、亲和层析、
羟基磷灰石层析和凝集素层析，EML4-ALK融合多肽可以回收和純 化自重组细胞培养物。更优选地，高效液相层析("HPLC")用于 纯化。本发明的多肽包括天然纯化产物，化学合成步骤的产物，以 及通过重组技术由原核生物或真核生物宿主产生的产物，其中上述 宿主包括，例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫以及哺乳动物细月包。 取决于在重组生产过程中采用的宿主，本发明的多肽可以是净唐基化 的或可以是非糖基化的。此外，本发明的多肽还可以包括最初<奮饰 的曱硫氨酸残基，在某些情况下作为宿主介导过程的结果。
因此，在一种实施方式中，本发明提供了一种通过在适合于表 达融合多肽的条件下培养重组宿主细胞并回收(恢复，recover)多 肽而用于产生重组EML4-ALK融合多肽的方法，如下所述。适合 于宿主细胞生长和从上述细胞表达重组多肽的培养条件是本领域 才支术人员^口的。参见，侈寸^口 ， Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel FM o/" eds., Volume 2， Chapter 16, Wiley Interscience。
D.分离的多狀
本发明还部分地提供了分离的突变体ALK激酶多肽以及其片 断。在一种实施方式中，本发明提供了一种分离的多肽，该多肽包 含一种氨基酸序列，而该氨基酸序列至少95%相同于选自由以下组 成的组的序列
(a )编码包括SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 18的氨基酸序列 的EML4-ALK融合多肽的氨基酸序列；(b )编码EML4-ALK融合多肽的氨基酸序列，该EML4-ALK 融合多肽包含EML-4的N端氨基*列(SEQ ID NO: 3的残基 1-233或SEQ ID NO: 3的残基1-495 )以及ALK的激酶结构域(SEQ ID NO: 5的残基1116-1383 );以及
(c )编码多肽的氨基酸序列，该多肽包含围绕EML4-ALK融 合多肽的融合接头(SEQ ID NO: 1的残基233-234或SEQ ID NO: 18 的残基495-496 )的至少6个邻接氨基酸。
在一种优选的实施方式中，4是供了本发明的重组突变体ALK 多肽，如上所述，其可以利用重组载体或重组宿主细月包来产生。
本领域中应当明了 ，可以变化EML4-ALK融合多肽或截短的 活性ALK激酶多肽的某些氨基酸序列而不会显著影响突变体蛋白 质的结构或功能。如果设想在序列中的上述差异，则应当记住，在 蛋白质上将存在关键区域，其决定活性(例如，ALK的激酶结构域)。 通常，可以取代形成三级结构的残基，只要使用了执行类似功能的 残基。在其它情况下，如果变化发生在蛋白质的非关键区，则残基 的类型可以是完全不重要的。
因此，本发明进一步包括EML4-ALK融合多肽的变化，其保 留基本的ALK激酶活性或其包括EML-4或ALK蛋白质的其它区， 如下文讨i仑的蛋白质部分。这样的突变体包括缺失、插入、倒位、 重复、以及类型取代(例如，用一种亲水残基取代另一种亲水残基， 但通常不用强亲水残基取代强疏水残基)。较小变化或上述"中性" 氨基酸取代将通常对活性几乎没有影响。
通常看作保守取代的是脂族氨基酸Ala、 Val、 Leu以及lie之 间的彼此替代，羟基残基Ser和Thr的互换，酸性残基Asp和Glu 的交换，酰胺残基Asn和Gin之间的取代，石威性残基Lys和Arg的 交换以及芳族残基Phe、 Tyr之间的替代。本领域技术人员已知的保 守氨基酸取代的实例是芳族苯丙氨酸色氨酸酪氨酸；疏水的 亮氨酸异亮氨酸缬氨酸；极性的谷氨酰胺天冬酰胺；碱性的精 氨酸赖氨酸组氨酸；酸性的天冬氨酸谷氨酸；较小的丙氨酸丝
38氨酸苏氨酸甲碌^氨酸甘氨酸。如上面详细i兌明的，关于哪些氨基酸 变化可能是表型沉默的(即，不可能对功能具有显著的有害影响)
的进一步指导可以在Bowie ef Science 247，上文中找到。
优选以分离的形式提供本发明的多肽，并且优选基本上是纯化 的。重组产生的本发明的EML4-ALK融合多肽的变体可以通过在 Smith和Johnson,67.. 31-40 (1988)中描述的一步法基本上加以纯化。
本发明的多肽包括图2A-B的EML4-ALK融合多肽(SEQ ID NOs: 1和18 )(不管包括还是不包括前导序列)；氨基酸序列，该序 列编码EML4-ALK融合多肽，其包含EML-4的N端氨基酸序列 (SEQ ID NO: 3的残基1-233或SEQ ID NO: 3的残基1-495 )和 ALK的激酶结构域(SEQ ID NO: 5的残基1116-1383 );和氨基酸 序列，该序列编码多肽，其包含围绕EML4-ALK融合多肽的融合 接头(SEQ ID NO: 1的残基233-234或SEQ ID NO: 18的残基 495-496)的至少6个邻接氨基酸(还参见图1A-B，底部图片)；以 及这样的多肽，其至少90%，优选至少95%,以及进一步更优选至 少96%、 97%、 98%或99%相似于上述多肽。
两种多肽的"％相似性"是指相似性得分，其是通过利用Bestfit 程序(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711 )和用于确定相似性的默认设置来比4交两 种多肽的氨基酸序列而产生的。Bestfit使用Smith和Waterman的局 吾卩同源算法(力dva"ces /"^^//^/A/aAew""" 2z 482-489 (1981))来 发现两种序列之间相似性最好的区段。
具有的氨基酸序列至少，例如，95% "相同"于本发明的 EML4-ALK融合多肽的参比氨基酸序列的多肽是指，多肽的氨基酸 序列相同于参比序列，只是对于突变体ALK多肽的参比氨基酸序 列的每100个氨基酸，多肽序列可以包括多达5个氨基酸变化。换 言之，为了获得具有的氨基酸序列至少95%相同于参比氨基酸序列 的多肽，在参比序列中的多达5%的氨基酸残基可以击夹失或用另一种氨基酸取代，或在参比序列中总氨基酸残基的多达5%的氨基酸 可以一皮插入到参比序列中。参比序列的这些变化可以发生在参比氨 基酸序列的氨基或羧基末端位置或发生在那些末端位置之间的任
内的一个或多个邻4妾基团中。
当利用Bestfit或任何其它序列对比程序来确定特定序列是否， 例如，95%相同于根据本发明的参比序列时，当然要设置参数，使 得相对于参比氨基S臾序列的全长来计算同一性百分比，以及在同源 方面多达5%的参比序列中氨基酸残基总数的缺口 (间隙)是允许 的。
本发明的EML4-ALK融合多肽可以用作SDS-PAGE凝胶或分 子筛凝月交过滤柱上的分子量标记，例如，利用本领域4支术人员熟知 的方法。
如下文进一步详细描述的，本发明的多肽还可以用来产生融合 多肽特异试剂，如多克隆和单克隆抗体，或截短的多肽特异试剂， 其可用于测定来4全测突变体ALK多肽表达(如下所述)，或作为能 够增强或抑制突变体ALK蛋白质的功能/活性的激动剂和拮抗剂。 另外，这样的多肽可以用于酵母双杂交系统以"捕冲足"EML4-ALK 融合多肽或截短的ALK激酶多肽结合蛋白，其还是才艮据本发明的 《吳选激动剂和4吉抗剂。该酵母^又杂交系统4苗述在Fields和Song, iV"&M 340: 245-246 (1989)中。
在另一个方面，本发明提供了一种肽或多肽，其包含本发明的 多肽的含有表4立的部分，例如，包含EML4-ALK融合多肽的融合 接头的表位(参见图1A-B，底部图片)。这种多肽部分的表位是本 发明的多肽的免疫原性或抗原性表位。"免疫原性表位"被定义为 一部分蛋白质，当全蛋白是免疫原时其诱导抗体应答。这些免疫原 性表位^皮i人为限于分子上的几个位置。另一方面，抗体可以结合的 蛋白质分子的区域被定义为"抗原性表位"。蛋白质的免疫原性表 <立的ft目通常少于抗原性表4立的目。参见，例如，Gey sen w a/.，
40尸rac. JV"//.」cfld 5W. S六3998-4002 (1983)。下文更详细地描述 了本发明的融合多肽特异性抗体的生产。
由含有抗原性表位的肽或多肽引起的抗体可用来检测才莫拟蛋 白质，而不同肽的抗体可以用于跟踪蛋白质前体的不同区的命运， 其中蛋白质前体经受翻译后加工。肽和抗肽抗体可以用于各种各样 的用于才莫拟蛋白质的定性或定量测定，例如在竟争测定中，因为研 究表明，在免疫沉淀测定中，甚至较短的肽(例如，约9个氨基酸) 可以结合和代替更大的肽。参见，例如，Wilson W Ce〃 37, 767-778 (1984) at777。本发明的抗肽抗体还可用于才莫拟蛋白质的纯 化，例如，通过吸附层析，其中利用本领i或众所周知的方法。下文 更详细;也描述免疫测定形式。
重纟且突变体ALK多肽也在本发明的范围内，并且可以利用本 发明的多核苷酸来生产，如在上文部分B中所描述的。例如，本发 明部分地提供了 一种通过在适合于表达融合多肽和回收多肽的条 件下培养重组宿主细胞(如上所述)来生产重组EML4-ALK融合多
肽的方法。适合于宿主细胞的生长和从上述细胞表达重组多肽的培 养条件是本领域技术人员熟知的。
E.突变体特异性试剂
可用于实施所4皮露方法的突变体ALK多肽特异性试剂尤其包 括融合多肽特异性抗体和AQUA肽(重同位素标记肽)，其对应于、 以及适合于检测和量化在生物样品中的EML4-ALK融合多肽表达， 其中生物样品来自癌症，如哺乳动物的实体肉瘤或肿瘤。同样有用 的是截短特异性试剂，如抗体、AQUA肽、或核酸纟笨4十，其适合于 检测是否存在本发明的截短的ALK激酶多核苷酸或多肽。融合多 肽特异性试剂是任何试剂(生物的或化学的)，其能够特异性地结 合于、才企测和/或量化在生物样品中的已表达的EML4-ALK融合多 肽的存在/水平。该术语包括但不限于下文讨论的优选的抗体和 AQUA肽试剂，以及等效试剂是在本发明的范围内。
41抗体
适合于供实施本发明的方法使用的试剂包括EML4-ALK融合 多肽特异性抗体和TFG-ALK融合多肽特异性抗体。本发明的融合 特异性抗体是分离的一个抗体或多个抗体，其特异性地结合本发明 的EML4-ALK融合多肽(例如，SEQ ID NO: 1 )但并不显著地结 合野生型EML-4或野生型ALK,或特异性地结合本文描述的 TFG-ALK融合多肽(例如，SEQ ID NO: 20 )但并不显著地结合野 生型TFG或野生型ALK。其它适宜的试剂包括表位特异性抗体， 其特异性地结合于野生型ALK蛋白质序列的胞外结构域中的表位 (该结构域并不存在于本文披露的截短的、活性ALK激酶中)，因 此能够冲全测冲羊品中野生型ALK的有无。
人EML4-ALK或TFG-ALK融合多肽特异性抗体还可以结合于 其它哺乳动物物种，例如鼠或兔中的高度同源的和相当的表位肽序 列，并且反之亦然。可用于实施本发明的方法的抗体包括(a)单 克隆抗体，(b)纯化的多克隆抗体，其特异性地结合于靶多肽(例 如，EML4-ALK融合多肽(参见图1A-B,底部图片)或TFG-ALK 融合多肽(参见图1C,底部图片)的融合接头，(c)如在以上(a) -(b)中所描述的抗体，其结合其它非人物种(例如，小鼠、大鼠) 中的相当的和高度同源的表位或磷酸化位点，以及(d)上述(a) -(c)的片断，其结合于由本文披露的示例性抗体结合的抗原(或 更优选表位)。
如本文中所使用的，术语"抗体"是指所有类型的免疫球蛋白， 包4舌IgG、 IgM、 IgA、 IgD以及IgE。抗体可以是单克隆或多克隆 的并且可以具有<壬4可起源物种，包括(例如)小鼠、大鼠、兔、马 或人，或可以是嵌合4元体。参见，例如，M. Walker " a/., A/o/ec. 7w附wwo/. 26: 403-11 (1989); Morrision W a/" /Voc. iV<^7. Jcad. Sc/. S六 6851 (1984); Neuberger W a/.， A^fwre 3".. 604 (1984)。抗体可以是4姿 照在美国专利第4,474,893号(Reading)或美国专利第4,816,567号 (Cabilly a a/.)中所披露的方法制备的重组单克隆抗体。抗体还可以
42是按照在美国专利第4,676,980号(Segel " "/.)中所4皮露的方法制备 的化学构建的特异性抗体。
本发明的EML4-ALK融合多肽特异性抗体的优选表位位点是 肽片断，其基本上包括人EML4-ALK融合多肽序列(SEQIDNOs: 1和18)的约11至17个氨基酸，该片断围绕融合4妄头(其存在于 短变体融合蛋白中的残基233-234处和长变体融合蛋白中的残基 495-496处(参见图1A-B(底部图片))。应当明了，特异性地结合更 短或更长的围绕EML4-ALK融合多肽的融合接头的肽/表位的抗体 是在本发明的范围内。
类似地，可用于实施所4皮露方法的TFG-ALK融合多肽特异性 抗体的优选表位位点是一种肽片断，其基本上包括人TFG-ALK融 合多肽序列(SEQIDNO:20)的约11至17个氨基酸，该片断围绕 融合4妻头(其存在于残基137-138处)(参见图1C(底部图片)。
本发明并不限于使用抗体，而是包括相当的分子，如蛋白质结 合结构域或核酸适体，其以融合蛋白质或截短的蛋白质特异性方 式，基本上结合于可用于本发明的方法的EML4-ALK或TFG-ALK 融合多肽特异性抗体所结合的相同表位。参见，例如，Neubergere/ A^ww 372: 604 (1984)。在下文中进一步描述的本发明的方法 中，可以适当地釆用上述相当的非抗体试剂。
可用于实施本发明的方法的多克隆抗体可以4要照标准:技术加 以制备，其中按照已知方法，用围绕所期望的融合蛋白质特异性表 位(例如，本文描述的ALK融合蛋白的融合接头)的抗原免疫适 宜的动物(例如，兔、山羊等)，乂人动物收集免疫血清，,人免疫血 清分离多克隆抗体，以及纯化具有期望特异性的多克隆抗体。抗原 可以是合成的包含期望表位序列的肽抗原，按照众所周知的技术加 以选择和才勾建。参见，侈寸唢口， Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 5， p. 75-76， Harlow & Lane Eds" Cold Spring Harbor Laboratory (1988); Czernik, MeAcxiy 五wz，o/ogy' 207 264-283 (1991); Merrifield， 爿附.C7^附.Soc. S5: 21-49 (1962))。 4口下文进一 步描述的，可以对如本文所述制备的多克隆抗体进行筛选和分离。
43单克隆抗体还可以有利地用于本发明的方法，并且可以4安照
Kohler和Milstein的众所周知的技术，A^^w 265.. 495-97 (1975); Kohler and Milstein,五w/: /附膽wo/. (5: 511 (1976);还参见Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel a/. Eds. (1989), 用杂 交瘤细胞系加以生产。如此产生的单克隆抗体是高度特异性的，并 且改善本发明所提供的测定方法的选择性和特异性。例如，可以将
包含适当抗原(例如，包含EML4-ALK融合多肽的融合接头的合 成肽)的溶液注射到小鼠中，并在足够时间(与常规4支术一致)以 后，处死小鼠并获得脾细胞。然后，通常在存在聚乙二醇的情况下， 通过用骨髓瘤细胞融合它们来固定脾细胞，以产生杂交瘤细胞。兔 融合杂交瘤，例如，可以如在美国专利第5，675，063号(K. Knight， 1997年10月7日/>布)中所描述的来产生。然后在适宜的选4奪培 养基如次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(HAT)中生长杂交瘤细胞，并筛 选上清液以获得具有期望特异性的单克隆抗体，如下所述。通过常 失见方法如沉淀、离子交换或亲和层析等，可以,人组织培养上清液回 收分泌的纟元体。
通过本领i或才支术人员已知的重组技术，还可以在大肠杆菌中产 生单克隆Fab片断。参见，例如，W.Huse，5We"ce2^5: 1275-81 (1989); Mullinax d A/^7爿c"d Sc/. <57: 8095 (1990)。 i口果一种同种
型的单克隆抗体优选用于特定用途，则可以通过利用用来分离类别 转换变体的同胞选择才支术，乂人分泌不同同种型的单克隆抗体的亲4戈 杂交瘤，直接、通过从最初融合进行选择、或二次制备来制备特定 的同种型(Steplewski, " a/.，尸rac. Jcad< 2, 8653 (1985);
Spira " /纖歸/. M"/zo成7(. 307 (1984))。结合单克隆抗体的 位点的抗原可以通过PCR加以克隆并且单链抗体产生为噬菌体展 示重组抗体或在大肠4干菌中的可溶抗体(参见，例如，Antibody Engineering Protocols, 1995, Humana Press, Sudhir Paul editor )。
更进一步i也，美国专利第5,194,392号，Geysen (1990)描述了 才佥测或确定单体(氨基酸或其它化合物)的序列的一^:方法，该序 列是拓朴相当的表位(即，"模拟表位")，其互补于感兴趣抗体的净争定互^hf立(纟元原结合〗立点)。更一顧:i也，该方法涉及4企测或确定 单体的序列，该序列是拓朴相当的配体，其互补于感兴趣的特定受 体的配体结合位点。类似地，美国专利第5,480,971号，Houghten" (1996),披露了线性d-C-烷基全烷基化寡肽和这样的肽的集合 和文库，以及利用上述寡肽集合和文库来确定全烷基化寡肽的序列 的方法，其中全烷基化寡肽优先结合于感兴趣的受体分子。因此， 本发明的含有表位的肽的非肽类似物也可以通过这些方法常失见地 力口以制备。
可以按照标准技术并针对表位和融合蛋白特异性，来筛选可用 于本发明的方法的抗体(不管是多克隆或单克隆)。参见，例如， C，w汰"a/., M"Ws五wz，o/ogy'厕.'264-283 (1991)。例如，可 以相乂于于肽文库并通过ELISA来筛选抗体以确^f呆对于所期望的抗 原的特异性，以及如果需要的^舌，确^f呆〗义与，例如，本发明的 EML4-ALK融合多肽而不与野生型EML-4或野生型ALK的反应性 的特异性。还可以通过相对于包含靶蛋白的细胞制剂的蛋白质印迹 来试验抗体以证实仅与所期望的耙具有反应性以及确保没有明显 结合于涉及ALK的其它融合蛋白。融合蛋白特异性抗体的生产、 筛选、以及应用是本领域^支术人员已知的，并且已有描述。参见， 侈寸^口，美国专矛P^开号20050214301, Wetzel " "/., September 29， 2005。
可用于本发明的方法的融合多肽特异性抗体可以呈现与其它 融合蛋白中的类似融合表位或与野生型EML-4、野生型TFG、以及 野生型ALK(其形成融合接头)中的表位的某些有限的交叉反应性。 这并不是意外的，因为大多数抗体呈现一定程度的交叉反应性，并 且抗肽抗体将经常与相对于免疫肽具有高同源性或同 一性的表位 进4亍交叉反应。参见，例3口， Czer"汝，上文。通过蛋白质印迹连同 已知分子量的标记可以容易地表征与其它融合蛋白的交叉反应性。 可以检查交叉反应蛋白质的氨基酸序列以鉴定高度同源于或相同 于EML4-ALK或TFG-ALK融合多肽序列并且抗体与其结合的位
45点。通过阴性选择并利用肽柱上的抗体纯化可以除去不期望的交叉
反应性(例如，选出结合野生型EML-4和/或野生型ALK的抗体)。
可用于实施本文所4皮露方法的本发明的EML4-ALK融合多肽 特异性抗体(以及TFG-ALK融合多肽特异性抗体)对于人融合多 肽是理想地特异性的，但并不仅限于结合人类本身。本发明包括抗 体的生产和应用，其中抗体还结合其它哺乳动物物种(例如，小鼠、 大鼠、猴)的保守的和高度同源的或相同的表位。通过与本文4皮露 的人EML4-ALK融合多肽序列(SEQ ID NOs: 1和18 )或本文4皮露 的人TFG-ALK融合多肽序列(SEQ ID NO: 20 )进行标准序列比较， 如利用BLAST,可以容易地鉴定在其它物种中的高度同源的或相 同的序列。
可以通过在4争定测定形式中的应用，例3口;;庇式细月包术(FC)、 免疫组织化学(IHC)、和/或免疫细胞化学(ICC)，来进一步表征 和i正实在本发明的方法中采用的抗体。在下面的部分F中进一步描 述了在上述方法中ALK融合多肽特异性抗体的应用。抗体还可以 有利地共轭于荧光染料(例如，Alexa488、 PE )、或标记如量子点， 连同其它信号转导(磷酸-AKT、磷酸-Erk 1/2 )和/或细胞标记物(细 胞角蛋白)抗体用于多参数分析，如在下面的部分F中进一步描述 的。
在实施本发明的方法时，利用这些野生型蛋白质的抗体(z畴酸 特异性或总抗体)还可以有利地检查在给定生物样品中野生型 EML-4、野生型TFG、和/或野生型ALK的表达和/或活性。例如， 总ALK和^岸酸化-位点特异性抗体可商业上获^寻(参见Cell Signaling Technology, Inc., Beverly MA, 2005/06 Catalogue, #，s 3341,3342)。如上所述，还可以4姿照标准方法来产生上述4元体。公 开了人EML-4 、 TFG、以及ALK的氨基酸序列(参见图3A和4A-4C, 以及参比的SwissProt Accession Nos. )， 4口同7>开了来自其它4勿种的 这些蛋白质的序列那样。
在生物才羊品(例^。，月中瘤才羊品)中，5f生型EML-4、 TFG、以 及野生型ALK表达和/或激活的4企测，连同EML4-ALK和/或
46TFG-ALK融合多肽表达，可以4是供关于是否融合蛋白单独驱动肿 瘤、或是否野生型ALK也^L激活并驱动肿瘤的信息。这样的信息 临床上可用于评估耙向融合蛋白或野生型蛋白质、或两者，或可能 最有利于抑制肿瘤的进展，以及有利于选择适当的疗法或它们的组 合。对野生型ALK激酶胞外结构域特异的抗体(其并不存在于本 文披露的截短的活性ALK激酶中)，可以特别用于确定突变体ALK ;敫酶的有无。
应当明了，在实施上述方法时，可以4吏用多于一种的抗体。例 如，可以同时采用一种或多种EML4-ALK融合多肽特异性抗体连 同对于另一种激酶、受体、或激酶底物(在其中表达EML4-ALK 融合多肽的癌症中，其怀疑被、或潜在被激活)特异的一种或多种 抗体，以在包含来自上述癌症的细胞的生物样品中才企测这样的其它 信号分子的活性。
本领域技术人员将明了 ，上述本发明的EML4-ALK融合多肽
分恒定结构域，从而、产生嵌合多:。这些融合i白可促进纯化并i
示出增加的体内半寿期(半衰期)。例如，对于由人CD4-多肽的开 始的两个结构i或和哺乳动物免疫J求蛋白的重链或轻链的恒定区的 各种结构i或构成的嵌合蛋白，情况就是如此(EPA 394，827; Traunecker " a/., A^we 33/: 84-86 (1988))。具有二石克连接的二聚体 结构(由于IgG部分)的融合蛋白还可以比单独的单体EML4-ALK 融合多肽更有效地结合和中和其它分子(Fountoulakis W "/., / 肠c/z， ， 3958-3964 (1995))。
重同4立素标i己肽(AOUA肽)
可用于实施所4皮露方法的EML4-ALK或TFG-ALK融合多肽特 异性试剂还可以包4舌重同位素标记肽，其适合于生物样品中已表达 的ALK融合多肽或截短的ALK激酶多肽的绝对量化。已描述了 AQUA肽的生产以及AQUA肽用于复杂混合物中蛋白质(AQUA ) 的绝对量4b。参见WO/03016861， "Absolute Quantification of Proteinsand Modified Forms Thereof by Multistage Mass Spectrometry," Gygi W a/.以及Gerber " a/.淑/. JcW. t/.S.A ， . 6940-5 (2003) (将其教导的全部内容以引用方式结合于本文)。
AQUA方法采用将已知量的至少一种重同位素标记肽标准(其
品中，以《更通过与肽标准的比4交来确定生物才羊品中具有相同序列和 蛋白质修饰的肽的绝对量。简单地i兌，AQUA方法具有两个阶,殳 肽内标准选4奪和i正实以及方法开发；以及利用i正实的肽内标准进4亍 实施以检测和量化样品中的耙蛋白。该方法是一种有力的技术，用 于检测和量化在复杂的生物混合物中的给定肽/蛋白质，如细胞溶胞 产物，并且可以用来，例如，量化由于药物处理而引起的蛋白质磷 酸化的变化，或量化在不同生物状态蛋白质水平的差异。
通常，为了开发适宜的内标准，基于其氨基酸序列和用来消化 的特定蛋白酶，选择在靶蛋白质序列内的特定肽(或修饰肽)。然 后通过固相肽合成产生该肽，使得 一 个残基被相同的包含稳定同位 素(13C、 15N)的残基替代。结果是这样的肽，其化学上相同于通 过蛋白水解形成的其天然配对物，但容易通过MS并借助于7-Da 质量移动加以区分。然后通过LC-MS/MS评估新合成的AQUA内 标准肽。通过反向层析、电离效率、以及借助于碰撞诱导解离的片 段化，该方法提供了关于肽保留的定性信息。选择用于天然和内标 准肽集合的信息和丰富的片断离子，然后作为层析保留的函数快速 连续加以具体监测以形成基于肽标准的独特分布的选择反应监测
(LC-SRM)方法。
AQUA策略的第二阶段是其实施以测量来自复杂混合物的蛋 白或《务饰蛋白的量。通常通过SDS-PAGE凝月交电泳来分级分离全细 胞溶胞产物，然后切除与蛋白质迁移一致的凝胶区。该过程以后接 着是在有AQUA肽存在的情况下进行凝胶内蛋白水解以及 LC-SRM分析(参见Gerber W 上文)。将AQUA肽掺加(穿刺， spiked )到通过用蛋白酶消化全细胞溶胞产物所获得的复杂肽混合 物，然后经受免疫亲和纯化，如上所述。通过消化(例如胰蛋白酶消化)形成的天然肽的〗呆留时间和片,殳化才莫式相同于先前确定的
AQUA内标准肽；因此，利用SRM实验的LC-MS/MS分冲斤导致内 标准和直接来自极端复杂肽混合物的分析物的高度特异和敏感的测量。
因为加入AQUA肽的绝对量(例如，250 fmol),所以曲线下 面的面积比可以用来确定在最初细月包溶月包产物中蛋白质或蛋白质 的磷酸化形式的精确的表达水平。此外，在凝胶内消化过程中当形 成天然肽时，内标准是存在的，使得从凝胶片的肽4是取效率、样品 处理(包括真空离心)过程中的绝对损失、以及在引入LC-MS系 统期间的易变性并不影响天然和AQUA肽丰度的确定的比率。
开发了 一种AQUA肽标准，其用于通过IAP-LC-MS/MS方法 先前在靶蛋白内鉴定的已知序列。如果位点被》务饰，则可以开发一 种AQUA肽，其在位点内掺入特定残基的修饰形式；以及开发第二 种AQUA肽，其掺入残基的未修饰形式。以这种方式，两种标准可 以用来检观'J和量化在生物样品中位点的修饰和未修饰形式两者。
还可以通过检查蛋白质的基本氨基酸序列和确定由蛋白酶剪 切产生的肽的边界来产生肽内标准。可替4奐地，可以用蛋白酶实际 消化蛋白质，然后可以对产生的特定肽片断进4亍测序。适宜的蛋白 酶包括但不限于丝氨酸蛋白酶(例如，胰蛋白酶， 一种与膜締合的 丝氨酸蛋白酶)、金属蛋白水解酶(例如，PUMP1 )、胰凝乳蛋白酶、 组织蛋白酶、胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、羧肽酶等。
按照一个或多个准则选择靶蛋白内的肽序列，以优化使用该肽 作为内标准。优选地，选择肽的大小以将在其它非輩巴蛋白中重复肽 序列的机会降到最低程度。因此，肽优选为至少约6个氨基酸。还 优化肽的大小以4吏电离频率最大化。因此，比约20个氨基酸更长 的肽并不是优选的。优选的范围为约7至15个氨基酸。还选4奪在 质"i普法过考呈中不可能是化学活性的肽序列，因此避免包含半胱氨 酸、色氨酸、或曱硫氨酸的序列。
49可以选择并不包括靶区的修饰区的肽序列，使得肽内标准可以 用来确定蛋白质的所有形式的量。可替换地，围绕修饰氨基酸的肽
内标准可以期望用来^U企测和量化革巴蛋白的修_饰形式。可以一起4吏
用用于》f饰和未^f奮饰区两者的肽标准，以确定在特定才羊品中 <奮饰的 程度(即，确定修饰形式相当于蛋白质总量的多少部分)。例如， 用于已知在特定位点被磷酸化的蛋白质的磷酸化和非磷酸化形式 两者的肽标准可以用来量化才羊品中石粦酸化形式的量。
利用一种或多种标记氨基酸来标记肽(即，标记是肽的实际部
分)，或4交少伊0选:l也可以在4要照标准方法合成以后连4妄才示i己。优选
地，标记是基于以下考虑事项所选择的质量变化标记质量应是只
有移动片断质量才有的，其中移动片断质量是对低本底的光谱区进
4亍MS分析所产生的；离子质量特4i成分是标记部分的一部分，其 在MS分析中优选呈现独特的离子质量特4正；标记的组分原子的质 量总和优选独特地不同于所有可能的氨基酸的片断。因此，通过在 所得到的质谱中的离子/质量模式，标记氨基酸和肽容易与未标记的 分开。优选地，离子质量特征成分将质量赋予并不匹配4壬何20种 天然氨基酸的残基质量的蛋白质片断。
标记在MS的片革殳化条件下应是耐用的并且不会经受不利的片 段化。在一定范围的条件下，尤其是在变性条件下，标记化学性能 应是有效的，并且标记标志优选仍然可溶于所选4奪的MS 1￡冲系统 中。标记优选并不抑制蛋白质的电离效率并且不是化学活性的。标 记可以包含两种或更多种同位素不同的物质的混合物以在每个标 记片断位置产生独特的质谱才莫式。稳定同位素，如2H、 13C、 15N、 17o、 180、或"S，属于优选的标记。还可以制备掺入不同同位素标 记的肽内标准对。重同位素标记可以掺入其中的优选的氨基酸残基 包括亮氨酸、脯氨酸、缬氨酸以及苯丙氨酸。
按照它们的质荷(m/z)比，以及优选地还按照它们在色i普柱(例 如，HPLC柱)上的保留时间来表征肽内标准。与相同序列的未标 记肽共洗脱的内标准^皮选择为最佳内标准。然后通过任何适当的方 式，例如通过利用例如氩或氦作为碰撞气体的碰撞诱导解离(CID)对肽进4亍分割，来分冲斤内标准。然后例如通过多级质"i普法(MSn)对 片断进行分析，以获得片断离子i普，乂人而获得肽片^殳化特^正。优选 地，肽片断具有显著的m/z比差异，以使得峰值对应于每个很好分 开的片断，以及获得靶肽特有的特征。如果在第一阶段未获得适宜 的片断特征，则进行MS的另一阶段，直到获得独特的特征。
MS/MS和MSS谱中的片断离子对于感兴趣的肽通常是高度特 异的，并且，连同LC方法，可以高度选择性地检测和量化复杂蛋 白质混合物，如细胞溶胞产物，中的靶肽/蛋白质，其中细胞溶胞产 物包含凄t千或上万种蛋白质。可以测定潜在地包含感兴趣的革巴蛋白 /肽的任何生物样品。优选采用粗制或部分纯化的细胞提取物。通常， 样品具有至少0.01 mg的蛋白质，通常浓度为0.1-10 mg/mL，并且 可以调节到期望的緩沖浓度和pH。
然后将对应于待检测/量化的靶蛋白的已知量的标记肽内标准， 优选约10飞摩尔，加入到生物样品，如细胞溶胞产物中。然后用 一种或多种蛋白酶消化掺加样品适当的时间，以允许进行消化。然 后进4亍分离(例3口，通过HPLC、反才目HPLC、毛细管电;永、离子 交换层冲斤法等)以乂人才羊品中的其它肽分离标记内标准和其相应的靶 肽。樣t毛细管LC是一种优选的方法。
然后通过监测MS中的选择反应来检查每种分离的肽。这涉及 利用通过表4正肽内标准所获得的先前知识，然后获得MS,以连续 监测在MS/MS或MS"谱用于感兴趣的肽和内标准两者的特定离子。 在洗脱以后，计算肽标准和草巴肽峰的曲线下的面积(AUC)。两个 面积的比率提供绝对量化，其可以加以归一化，以获得在分冲斤中佳: 用的细胞数目和蛋白质的分子量，从而提供每个细胞的精确的蛋白 质拷贝数。AQUA方法的进一步的细节描述在Gygi " 以及Gerber 上文中。
如上所述，可以期望制备AQUA内肽标准(重同位素标记肽) 以检测和量化在本发明的突变体ALK多肽内的任何独特位点(例 如，所4皮露的EML4-ALK融合多肽内的融合4妄头)。例如，可以制
51备AQUA磷酸肽，其对应于EML4-ALK融合多肽的融合接头序列 (参见图1A-B(底部图片))或其对应于EML4、 TFG、或ALK的 截杀豆点。肽才示准例:^可以产生用于EML4-ALK或TFG-ALK融合4妄 头并且在AQUA方法中这样的标准用来检测和量化生物样品中的 融合接头(即，EML4-ALK融合多肽的存在)。
例如，本发明的示例性的AQUA肽包括氨基酸序列INQVYR (参见图1，底部图片)，其对应于直接地旁侧EML4-ALK融合多 肽中的融合接头的每个位点的三个氨基酸(参见SEQ ID NO: 7 )。 应当明了，还可以构建包含融合接头序列(和另外的残基，其下游 或上游)的更大的AQUA肽。类似地，可以可替换地构建更小的 AQUA肽，其包含少于上述序列的所有残基U旦仍然包含融合4妾头 本身的点)。上述更大或更短的AQUA肽在本发明的范围内，并且 可以如上所述进行优选AQUA肽的选择和生产(参见Gygi " "/., Gerber ", 上文)。
核酸探针
如在上述部分B中详细描述的，由本发明提供的融合特异性试 剂还包括适合于检测EML4-ALK多核苷酸或截短的ALK激酶多核 普酸的核酸探针和引物。上述期望的探针其中包括断裂点探针，该 断裂点l采4十只于应于产生融合的野生型EML4和/或野生型ALK基因 中的断裂点的两侧。在下面的部分F中描述了在测定中上述探针的 特定应用，如荧光原位杂交(FISH)或聚合酶链反应(PCR)扩增。 可以制备类似的断裂点:探针以检测TFG-ALK融合多核苷酸的存在 (参见图1C(SEQIDNO:21))。
F.诊断应用和测定形式
可以以本领域技术人员已知的各种各样的不同测定形式来实 施本发明的方法。
52免疫测定
多相免疫测定。在均相测定中，免疫反应通常涉及突变体ALK激 酶多肽-特异性试剂(例如，EML4-ALK融合多肽-特异性抗体)、 标记分析物、以及感兴趣的生物样品。在抗体结合于标记分析物以 后，产生自标记的信号被直接或间接地修饰。在均相溶液中进行免 疫反应和检测其程度两者。可以釆用的免疫化学标记包括自由基、 》文射性同位素、荧光染坤+、酶、噬菌体、辅酶等。还可以有利地采 用半导体纳米晶体标记、或"量子点"，并且它们的制备和应用已得 到4艮好的描述。 一般i也参见，K. Barovsky, iV""ofec/z. Law cfe Article 14 (2004)以及其中引用的专利。
在多相测定方式中，试剂通常是生物样品， 一种突变体ALK 激酶多肽-特异性试剂(例如，EML4-ALK融合特异性抗体)，以及 用于产生可检测信号的适宜方式。可以使用如下文进一步描述的生 物样品。抗体通常^皮固定在载体上，如珠、平4反或载玻片，并且接 触在液相中的怀疑包含抗原的样品。然后从液相中分离载体，并采 用用于产生这才羊的信号的方式来4企查载体相或液相的可4全测信号。 该信号与生物样品中分析物的存在有关。用于产生可检测信号的方 式包括W吏用放射性标记、荧光标记、酶标记、量子点等。例如，如 果待检测的抗原包含第二结合位点，则在分离步骤以前，结合于该 位点的抗体可以共轭于可4企测基团并加入到液相反应溶液中。在固 体载体上可检测基团的存在表明在试-验样品中存在抗原。适宜的免 疫测定的实例是放射免疫测定、免疫荧光方法、酶联免疫测定等。
可以用于实施本文纟皮露的方法的免疫测定形式及其变化在本 4贞i或是众戶斤周^口的。通常参见E. Maggio， Enzyme-Immunoassay, (1980) (CRC Press, Inc., BocaRaton，Fla.);还参见，例如，美国专利 第 4,727,022 号 (Skold W a/., " Methods for Modulating Ligand画Receptor Interactions and their Application"); 美国专矛J第 4,659,678号(Forrest e/1 a/" "Immunoassay of Antigens"); 美国专 矛J第 4,376,110 号(David & a/.," Immunometric Assays UsingMonoclonal Antibodies")。适合于形成试剂-抗体复合物的条件是本 领域技术人员熟知的。参见同前。EML4-ALK融合多肽-特异性单 克隆抗体可以用于"两4立点，，或"夹心，，测定，其中单杂交瘤细月包 系作为标记单克隆抗体和结合单克隆抗体两者的来源。这才羊的测定 描述于美国专利第4,376,110号中。可检测试剂的浓度应是足够的， 4吏得和本底相比可以4全测EML4-ALK或TFG-ALK融合多肽的结 合。
^安照已知^支术，如沉淀，可用于实施本文所4皮露方法的抗体可 以共轭于适合于诊断测定的固体载体(例如，多朱、平板、载玻片或 孔，其形成自诸如胶乳或聚苯乙烯等材料)。按照已知技术，抗体 或其它ALK融合多肽-结合试剂或截短的ALK激酶多肽-结合试剂 可以同样共轭于可才企测基团如》文射性标记(例如，35S、 1251、 1311)、 酶标记(例如，辣根过氧化物酶、石威性磷酸酶)、以及荧光标记(例 如，荧光素)。
基于细胞的测定，如流式细胞术(FC)、免疫组织化学(IHC)、 或免疫荧光(IF),特别期望用于实施本发明的方法，因为这样的测 定形式是临床适用的，可以体内4全测突变体ALK激酶多肽表达， 以及避免活性人为变化的风险，其起因于为了获得提取物而操作获 自例如肺瘤样品的细胞。因此，在某些优选的实施方式中，本发明 的方法是以流式细胞术(FC)、免疫组织化学(IHC)、或免疫荧光 (IF)测定形式力口以实施。
流式细胞术(FC )可以用来确定，在用目标在于抑制ALK激 酶活性的药物进行治疗之前、期间、以及以后，突变体ALK激酶 多肽在哺乳动物胂瘤中的表达。例如，可以通过流式细胞术分析来 自骨髓样品的肿瘤细胞的EML4-ALK或TFG-ALK融合多肽表达和 /或激活、以及鉴定癌症细胞类型的标记等(如果希望如此)。可以 按照才示准方法来实施;克式细月包术。参见，例如，Chow " a/., C>towe^y 广Co附附ww/c加'om1 C7/w/cof/ Q^ow掛力4(5.. 72—78 (2001)。 简单和举 例来说，可以采用用于血细胞计数分析的以下程序在37。C下用 2%多聚曱醛固定细胞10分钟，接着在冰上的90%曱醇中进行透化
54作用30分钟。然后可以用第一 EML4-ALK或TFG-ALK融合多肽-特异性抗体对细胞进行染色，洗涤并用焚光标记第二抗体加以标 记。然后用流式细月包4义(例如，Beckman Coulter FC500 )并按照所 用仪器的具体程序对细胞进行分析。这样的分析将鉴定在肿瘤中表 达的EML4-ALK或TFG-ALK融合多肽的水平。用ALK-抑制治疗 剂治疗肿瘤以后类似的分析将揭示ALK融合多肽-表达月中瘤对ALK 激酶的耙向抑制剂的反应性。
免疫组织化学(IHC)染色还可以用来确定在用目标在于抑制 ALK激酶活性的药物进行治疗以前、期间、以及以后在哺乳动物癌 症(例如，实体瘤样NSCLC)中突变体ALK激酶多肽的表达和/ 或激活状态。可以按照众所周知的技术进行IHC。参见，例如， Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 10, Harlow & Lane Eds.， Cold Spring Harbor Laboratory (1988)。简单和举例来"i兌，通过 用二曱苯接着用乙醇对组织切片进行脱蜡；在水中然后在PBS中进 行水合；通过在柠檬酸钠緩沖液中加热载玻片来暴露抗原；在过氧 化氢中温育切片；在阻断溶液中阻断；在第一抗-EML4-ALK或抗 -TFG-ALK融合多肽抗体和第二抗体中温育载玻片；以及最后利用 ABC亲和素/生物素方法并按照制造商的说明进行检测来制备用于 免疫组织化学染色的石蜡包埋组织(例如，来自活检的肿瘤组织)。
免疫荧光(IF)测定还可以用来确定在用目标在于4中制ALK 激酶活性的药物进行治疗以前、期间、以及以后，在哺乳动物癌症 中突变体ALK激酶多肽的表达和/或激活状态。可以按照众所周知 的才支术来进4亍IF。参见，例如，J.M. Polak and S. Van Noorden(1997) Introduction to Immunocytochemistry， 2nd Ed.; Royal Microscopy Society Microscopy Handbook 37, BioScientific/Springer-Verlag。简单和举例来i兌，患者才羊品可以净皮固 定在多聚甲醛中，4妾着固定在甲醇中，用阻断溶液如马血清阻断， 用相对于EML4-ALK或TFG-ALK融合多肽的第一抗体，4妻着用用 荧光染料如Alexa 488标记的第二抗体进行温育，然后用落射荧光 显微镜进行分析。
55Alexa488、 PE)，或其它标记，如量子点，连同其它信号转导(例 如，EGFR、石粦酸-AKT、石粦酸-Erk 1/2)和/或细月包标记物(例如， 细胞角蛋白)抗体用于多参数分析。
用于测量突变体ALK激酶多肽的各种各样的其它程序，包括 酶联免疫吸附测定(ELISA)、》文射免疫测定(RIA)、以及荧光5敫 活细胞分选术(FACS)，在本技术领域是已知的，并且提供用于i貪 断改变或异常7K平的EML4-ALK或TFG-ALK融合多肽表达的基 础。通过获自正常哺乳动物受治疗者(优选人)的体液或细月包4是取 物在适合于复合物形成的条件下结合于相对于EML4-ALK或 TFG-ALK融合多肽的抗体来建立这些融合多肽表达的正常或标准 值。可以通过各种方法，但优选通过光度法，来量化标准复合物形 成的量。将在受治疗者、对照、以及来自活检组织的疾病样品中表 达的EML4-ALK或TFG-ALK融合多肽的量与标准值进4亍比较。标 准和受治疗者值之间的偏差建立用于it断疾病的参数。
肽和核酸测定
类似地，可以制备用于在生物样品(包括来自肿瘤的细胞)中 检测/量化已表达的突变体ALK激酶多肽的AQUA肽并用于标准 AQUA测定，如在上面的部分E中详细描述的。因此，在本发明的 方法的某些4尤选实施方式中，ALK融合多肽-4争异性试剂包4舌重同 位素标记的磷酸肽(AQUA肽)，其对应于包含EML4-ALK融合多 肽或TFG-ALK融合多肽的融合接头的肽序列，如在上面的部分E 中所描述的。
可用于实施本发明的方法的突变体ALK多肽-特异性试剂还可 以是mRNA、寡核苷酸或DNA探针，其可以直4妄杂交于、以及才企 测生物样品中的融合或截短的多肽表达转录物。在上面的部分B中 详细讨论了这样的纟笨针。简单和举例来说，可以用荧光素标记的 RNA探针来探测甲醛固定的、石蜡包埋的患者样品，接着用曱酰胺、 SSC以及PBS洗涤，然后用荧光显孩i镜进行分析。同样优选的是FISH探针(包括断裂点探针)，其允许荧光检测基因重排，如在第2号染色体上的EML4-ALK缺失突变(参见实施例6 )。
编码突变体ALK激酶多肽的多核苷酸还可以用于i貪断目的。可以使用的多核苷酸包括寡核苷酸序列、反义RNA和DNA分子、以及PNA。多核普酸可以用来^r测和量化在活才企实体瘤iE织中的基因表达，其中EML4-ALK或TFG-ALK融合多肽或截短的活性ALK;敫酶多肽的表达可以与疾病有关。例3口， i貪断测定可以用来区别EML4-ALK或TFG-ALK融合多肽的缺少、存在、以及过表达，以及在治疗性干预过程中监测ALK融合多肽水平的调节。
在一种优选的实施方式中，与PCR探针的杂交可以用来鉴定对突变体ALK多肽进行编码的核酸序列，其中PCR探针能够检测多核苷酸序列，包括基因组序列，其编码ALK融合多肽或截短的ALK^敫酶多肽、或紧密相关分子。在上面的部分B中4苗述了这才羊的探针的构建和应用。探针的特异性，不管是制备自高度特异区，例如，在融合4妾头中的IO个单一核苷酸，或4交少特异区，例如，3，编码区，以及杂交或扩增的严格性(最大、高、中、或低)将确定探针是否仅鉴定天然存在序列(其编码突变体ALK多肽)、等位基因、或相关序列。
探针还可以用于检测相关序列，并且应优选包含至少50%的来自任何突变体ALK多肽编码序列的核苷酸。本发明的杂交探针可以是DNA或RNA并且衍生自SEQIDNO:2、 19、以及21的核苷酸序列，最优选围绕融合接头(参见图1A-C，底部图片以及SEQ IDNO: 7、 24、以及26),或书亍生自基因纟且序列，其包4舌天然存在的EML-4、 TFG、以及ALK多肽的启动子、增强子元件、以及内含子，如在上面的部分B中进一步描述的。
例如，本发明的EML4-ALK融合多核苷酸可以用于DNA或RNA分析、斑点印迹、或其它力荑基才支术；用于PCR才支术；或用于纤维素试纸、针、ELISA或芯片测定，其利用来自患者活4企的流体或组织以检测改变的ALK多肽表达。这样的定性或定量方法在本领域是众所周知的。在一个特定方面，编码本发明的突变体ALK多肽的核香酸序列可以用于这样的测定，其检测各种癌症(包括肺癌)的激活或诱导。突变体ALK多核苷酸可以通过标准方法加以标记，并在适合于形成杂交复合物的条件下加入到来自患者的流体或组织样品中。在适当的温育时间以后，洗涤样品，量化信号，并与标准值比较。如果活检或提取样品中的信号量显著不同于可比较的对照样品，则核苷酸序列已杂交于样品中的核苷酸序列，并且样品中编码EML4-ALK融合多肽或截短的ALK激酶多肽的核苦酸序列的改变的水平的存在表明存在有关疾病。这样的测定还可以用来在动物研究中、在临床试验中、或在监测个体患者的治疗中评估特定治疗方案的功效。
为了提供以突变体ALK激酶多肽的表达为4争征的疾病的i貪断基础，建立了表达的正常或标准分布。这可以通过在适合于杂交或扩增的条件下，使获自正常受治疗者(动物或人)的体液或细胞4是取物结合于编码EML4-ALK或TFG-ALK融合多肽的序列或其片断来完成。可以通过比较获自正常受治疗者的值与来自实验的值(其中使用了已知量的基本上纯化的多核苷酸)来量化标准杂交。可以将获自正常样品的标准值与获自有疾病症状的患者样品的值进4亍比较。标准值与受治疗者值之间的偏差用来确定疾病的存在。
在确定疾病并开始治疗方案以后，可以^L则i也重复杂交测定以评估患者中表达水平是否开始近似在正常患者中观测到的表达水平。由连续测定获得的结果可以用来显示在几天至数月期间范围的治疗功效。
本发明的突变体ALK多核苷酸的另外的诊断应用可以涉及使用聚合酶链反应(PCR)， 一种优选的测定形式，其对于本领域技术人员而言是才示准的。参见，例^口 ， Molecular Cloninc^ ALaboratory Manual, 2nd. edition, Sambrook, J.， Fritsch, E. R andManiatis, T" eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, N.Y. (1989)。 PCR寡聚体可以化学合成、酶促产生、或制备自重组源。寡聚体将优选由两种核苷酸序列构成， 一种具有有义定
58向(5'至3，)以及另一种具有反义定向(3'至5'),在优4匕条件下用于鉴定特定基因或条件。相同的两个寡聚体、寡聚体的嵌套集合、或甚至寡聚体的兼并库可以在较少严格的条件下用于检测和/或量H紧密相关的DNA或RNA序列。
还可以用来量化ALK融合多肽或截短的ALK激酶多肽的表达的方法包括》文射性标记或生物素化核苷酸、对照核酸的共扩增、以及实-验结果^皮内插到其上的标准曲线(Melby ef "/., 乂 /wmw"o/.MdWs, ， . 235-244 (1993》Duplaa w 如a/. S/oc/z纖229-236(1993))。可以通过以ELISA形式进行测定来加速多个样品的量化速度，其中以不同稀度提供感兴趣的寡聚体，以及分光光度或比色反应给出快速量化。
在本发明的另一种实施方式中，本发明的突变体ALK多核苷酸、以及它们近侧和远侧的相邻基因ia区，可以用来产生杂交4果4十，其可用于对天然存在的基因组序列进行作图。利用众所周知的4支术，可以将序列作图到特定染色体或到染色体的特异区。这样的技术包括荧光原位杂交(FISH)、 FACS、或人工染色体构建，如酵母人工染色体、细菌人工染色体、细菌Pl构建或单染色体cDNA文库，如在Price, C. M, 5/00di ev. 7, 127-134 (1993)以及Trask, B. J.,7^"AG^"w. 7.. 149-154 (199l)中所综述的。
在一种优选的实施方式中，采用了 FISH (如在Verma w a/.Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, PergamonPress, New York, N.Y. (1988)中所描述的)并且FISH可以与其它物理染色体作图技术和基因图谱数据有关。基因图谱的实例可以在1994 Genome Issue of Sc^wce (2(55: 1981f)中找到。在物5里染色体图谱上编码EML4-ALK或TFG-ALK融合多肽或截短的活性ALK激酶多肽的基因的位置和特定疾病、或特定疾病的素因之间的相关性可以有助于限制与遗传疾病有关的DNA区。本发明的核苷酸序列可以用来4企测在正常、载体、或受影响个体之间的基因序列差异。双色断裂点FISH探针，例如，可以用来检测样品中突变体EML-4、TFG、和/或ALK基因的存在或缺少。
59染色体制备的原位杂交和物理作图技术如利用确定的染色体标记进行的连锁分析可以用于延伸基因图谦。将基因放置在另 一种哺乳动物物种(如小鼠)的染色体上，经常可以揭示相关标记，即
使特定人染色体的数目或臂是未知的。通过物理作图，可以将新序列分配给染色体臂、或其部分。这为研究者提供有价值的信息，以便利用定位克隆或其它基因发现技术来寻找疾病基因。在通过基因
连锁将疾病或综合征粗略地定位到特定基因组区，例如，AT到11q22画23 ( Gatti " a/" 7W^"re 336: 577-580 (1988))以后，4壬何序列作图到该区域可以表示用于进一步研究的相关或调节基因。本发明的核苷酸序列还可以用来检测在正常、载体、或受影响个体之间起因于易位、倒位等的染色体位置差异。
其它用于核酸检测的适宜方法，如小沟结合共轭寡核苷酸探针(参见，例如，美国专利第6，951 ，930号，"Hybridization-TriggeredFluorescent Detection of Nucleic Acids")对于本领域技术人员来说已知的。
生物样品
可用于实施本发明的方法的生物样品可以获自任何哺乳动物，其中存在或正发展以EML4-ALK或TFG-ALK融合多肽的表达为特征的癌症。在一种实施方式中，哺乳动物是人，并且该人可以是用于治疗癌症，例如NSCLC,的ALK-抑制治疗剂的候选者。该人4美选者可以是目前正用、或考虑用ALK激酶抑制剂，如WHI-131和/或WHI-154，进4亍治疗的患者。在另一种实施方式中，哺乳动物是大动物，如马或奶牛，而在其它实施方式中，哺乳动物是小动物，如狗或猫，已知其均发展癌症，包4舌肺癌。
任何包含来自哺乳动物癌症的细胞(或细胞4是取物)的生物才羊品适合于本发明的方法。在EML-ALK融合多肽的情况下，任何癌症，不管是实体还是非实体，都将是适宜的。在TFG-ALK的情况下，实体瘤是在本发明的方法的范围内。例如，生物才羊品可以包含获自渗出液的细胞，如胸膜渗出液的细胞。已知在许多晚期肺癌(包括NSCLC)患者中形成胸膜渗出液(形成在胸月空中的肺外侧并且包含癌细胞的液体)，并且这样的渗出液的存在是不良结果和短存活时间的预兆。已描述了用于获得胸膜渗出液的标准技术并且在本领域是众所周知的(参见Sahn， C"" C/ eWMW 3(2): 443-52 (1982))。利用肿瘤标志、细^^角蛋白标志或如所描述的阴性选择的其它方法，循多不胂瘤细月包还可以获自血;青(参见Ma W "/., ^""c"wcer23(1A): 49-62 (2003))。对于白血病患者，血清和骨髓样品可以是特别优选的。对于涉及实体瘤的癌症，如肉瘤和癌，生物才羊品可以包含获自肿瘤活检的细胞，其可以按照标准临床技术来获得。例如，在各种各样的癌症(包括成神经细胞瘤和神经外胚层癌症)中已 见
测到ALK的异常表达。参见，例如，Pulford""/.，上文。然而，仅在淋巴瘤中描述了 TFG-ALK易位突变体，而在实体瘤中先前未》见测到。
生物样品可以包含来自癌症的细胞(或细胞提取物)，其中ALK融合多肽被表达和/或激活，但野生型ALK激酶则没有。可替换地，4^品可以包含来自癌症的细^0其中突变体ALK多肽和野生型ALK激酶两者均被表达和/或激活，或其中野生型ALK激酶和/或EML-4和/或TFG ^皮表达和/或活性的，但突变体ALK多肽则没有。
按照标准技术，上述生物样品的细胞提取物可以制备成粗制物，或经过部分(或完全)纯化，并用于本发明的方法。可替换地，可以以优选的测定形式采用包含全细胞的生物样品，如免疫组织化学(IHC)、流式细胞术(FC)、免疫荧光(IF)、以及荧光原位杂交(FISH),如上文进一步描述的。这样的全细胞测定是有利的，因为它们将肿瘤细胞样品的操作降到最低程度，因此降低了改变细胞的体内信号/激活状态和/或引入人工信号的风险。全细胞测定还是有利的，因为它们仅在肿瘤细胞中表征表达和信号，而不是肿瘤和正常细力包的混合物。
在实施所披露的用于确定是否一种化合物抑制以EML4-ALK或TFG-ALK融合基因和/或融合多肽为特征的肿瘤的进展的方法时，还可以有利地采用包含来自哺乳动物骨髓移植模型或异种移档:
61的细J包的生物冲羊品。优选的异种移才直(或移植受体)是小哺乳动物，
如小鼠，其躲藏(harbor)表达突变体ALK激酶多肽的人肿瘤。躲藏人肿瘤的异种移植在本领域是众所周知的(参见Kal, Omcer 7>eWi 仏72: 155-69 (1995))并且躲藏人肿瘤的哺乳动物异种移植的生产被很好地描述(参见Winograd " /" Wvo. 1(1): 1-13 (1987))。类似地，骨髓移档》溪型的产生和应用#^艮好地描述(参见，例如，Schwaller, e/"/.,五MS(9J /7.. 5321-333 (1998); Kelly W a/., 5/ood99.'310-318 (2002))。"以EML4-ALK或TFG-ALK融合多#亥苷酸和/或融合多肽为特征的癌症"是指这样的癌症，其中与不存在这样的融合基因和/或融合多肽的癌症相比，存在这样的突变体ALK基因和/或表达的多肽。
在评估包含来自哺乳动物癌症肿瘤的细胞的生物样品中的突变体ALK多核苷酸存在或多肽表达时，代表细月包的对照样品(其中没有发生上述易位和/或融合蛋白)可以期望用于比4交目的。理想地，对照样品包含来自特定癌症(例如，NSCLC)的亚型的细胞，上述亚型4戈表这才羊的亚型，其中并没有发生突变(例如，EML4-ALK缺失突变)和/或并没有表达融合多肽。因此，对照样品与试验生物样品中水平的比较可以确定是否存在突变体ALK多核苷酸和/或多肽。可替换地，因为EML4-ALK和/或TFG-ALK融合多核苷酸和/或多肽可能不存在于大多数癌症中，所以类似地并不表达这样的突变体ALK多肽(或躲藏突变体多核普酸)的任4可组织可以用作对照。
以下描述的方法对于以突变体ALK多核苷酸和/或多肽为特4￡的癌症、以及与其有关的治疗决策将具有有价^直的诊断应用。例如，生物样品可以获自这样的受治疗者，其先前并没有诊断为具有以EML4-ALK *夹失突变和/或融合多肽为特征的癌症，也纟殳有经受4十对上述癌症的治疗，并且该方法用来it断上鉴定在这样的受治疗者中的肿瘤为属于肿瘤(例如，NSCLC)的亚型，其中存在和/或表达EML4-ALK融合多核香酸和/或多肽。本发明的方法还可以用来监测在用组合物(包括ALK激酶-抑制治疗剂或治疗剂的组合)对受治疗者进4于治疗以后表达突变体ALK激酶多肽的癌症的进展或 抑制。
可以在初步评估或外科监#见步骤以后或以前进行这样的诊断 测定。本发明的鉴定方法可以有利地用作诊断来确定患有癌症的患 者，如NSCLC ，其由EML4-ALK和/或TFG-ALK融合蛋白或由截 短的ALK激酶所驱动，这些患者将很可能对目标在于抑制ALK激 酶活性的疗法起反应，如WHI-131和/或WHI-154或它们的类似物。 选择上述患者的能力也将用于临床评估未来ALK-把向疗法的功效 以及用于给予患者的上述药物的未来处方。
诊断方法
选择性地鉴定癌症(其中存在EML4-ALK和/或TFG-ALK融 合多核苷酸和/或融合多肽)的能力使得能够实现重要的新方法，其 用于精确地鉴定上述肿瘤(用于诊断目的)，以及获得信息，当作 为单药剂用来治疗癌症时，该信息可用于确定这4羊的肿瘤是否可能 对ALK-抑制治疗剂组合物起反应，或可能部分或完全地对靶向不 同激酶的抑制剂不起反应。
因此，在一种实施方式中，本发明提供了一种用于在来自哺乳 动物癌症的生物样品中4全测突变体ALK多核苦酸和/或其编码的突 变体ALK多肽的存在的方法，所述方法包括以下步骤
(a) 乂人哺乳动物癌症获得生物才羊品；以及
(b) 利用至少一种试剂，其冲企测融合多核苷酸、或其编码的 融合多肽(包含部分具有部分二级蛋白质的ALK)，以确定在所述 生物才羊品中是否存在ALK突变体多核苷酸和/或其编码的突变体 ALK多肽。
在某些优选的实施方式中，癌症是实体瘤肉瘤或癌，而在一种 实施方式中，癌是肺癌，如NSCLC。在另一种优选的实施方式中， 突变体ALK多肽是一种融合多肽，其包含ALK ( SEQ ID NO: 5 ) 的残基1116-1383并具有部分所述二级蛋白质。在另一种优选的实
63施方式中，二级蛋白质选自由EML-4 ( SEQ ID NO: 3 )和TRK-融 合基因(TFG)蛋白质(SEQ ID NO: 22)组成的组。在又一种优选 的实施方式中，融合多肽包含EML-4 ( SEQ ID NO: 3 )的残基1-233 或残基1-495或TFG ( SEQ ID NO: 22 )的残基1-138。
在其它^尤选的实施方式中，融合多4亥苷酸包4舌EML4-ALK融 合多核苷酸(SEQ ID NO: 2或19 )或TFG-ALK融合多核苷酸(SEQ ID NO: 21),而在又一种实施方式中，融合多肽包4舌EML4-ALK融 合多肽(SEQIDNO: 1或18)或TFG-ALK融合多肽(SEQ ID NO: 20)。在又一种优选的实施方式中，融合多核苷酸是上述的一种 EML4-ALK融合多才亥香酸或多肽。
在更4尤选的实施方式中，该方法采用一种试剂，其包含 EML4-ALK融合多核芬酸和/或至少一种EML4-ALK融合多肽-净争 异性试剂(抗体或AQUA肽)，如上所述。在某些优选的实施方式 中，该试剂包括一种分离的试剂，其特异性地结合于或检测 TFG-ALK融合多肽(SEQ ID NO: 20 )或TFG-ALK融合多核苷酸 (SEQ ID NO: 21)， <旦并不结合于或冲企测野生型TFG或野生型 ALK。在其它优选的实施方式中，试剂是聚合酶链反应(PCR)採L 针或荧光原位杂交(FISH)探针。某些优选的实施方式采用重同位 素标记(AQUA )肽，其包含野生型ALK内的TFG-ALK融合多肽 或截短点的融合接头的氨基酸序列。
在某些优选的实施方式中，以如上所述的流式细胞术(FC)、 免疫組织化学(IHC)、或免疫荧光(IF)测定形式来实施本发明的 诊断方法。在另一种优选的实施方式中，检测了 EML4-ALK或 TFG-ALK融合多肽的活性。在其它优选的实施方式中，以如上所 述的荧光原位杂交(FISH)或聚合酶链反应(PCR)测定形式来实 施本发明的i貪断方法。
本发明进一步提供了 一种用于确定化合物是否抑制以 EML4-ALK或TFG-ALK融合多核苦酸和/或融合多肽为特征的癌 症的进展的方法，所述方法包括以下步骤确定所述化合物是否抑制所述EML4-ALK或TFG-ALK融合多肽在所述癌症中的表达和/ 或活性。在一种优选的实施方式中，利用至少一种试剂来确定ALK 融合多肽的表达和/或活性的抑制，其中所述i式剂检测本发明的 EML4-ALK融合多核苷酸或多肽和/或本文披露的TFG-ALK融合 多核苷酸或多肽。在下面的部分G中更详细地讨论了适合于抑制 ALK激酶活性的化合物。
在上面的部分B和D中，进一步详细地描述了可用于实施本 发明的方法的突变体ALK多核香酸4笨4十和多肽-特异性试剂。在一 种优选的实施方式中，ALK融合多肽-特异性试剂包含一种融合多 肽-特异性抗体。在另一种优选的实施方式中，融合多肽-特异性试 剂包含一种重同位素标记磷酸肽(AQUA肽)，其对应于ALK融合 多肽的融合接头(参见图1A-C(底部图片))。在又一种优选的实施 方式中，融合多核苷酸-特异性试剂包含FISH探针，其对应于ALK 融合基因和/或野生型EML4、 TFG、或ALK基因的断裂点的融合 接头。
上述本发明的方法还可以可选地包括以下步骤确定所述生物 样品中其它激酶，如野生型ALK和EGFR,或其它下游信号分子的 表达或激活水平。描出ALK融合多肽表达/激活和其它激酶的表达/ 激活的4仑廓以及在纟合定生物才羊品中的途径可以4是供以下有价值的 信息哪些激酶和途径正驱动疾病，以及哪种治疗方案因此可能是 最有益的。
化合物筛选
本文描述的新EML4-ALK融合多肽的发现还使得可以开发新 化合物，其抑制这种突变体ALK蛋白质的活性，尤其是其ALK激 酶活性。因此，本发明还部分地提供了一种用来确定一种化合物是 否抑制以EML4-ALK融合多核普酸和/或融合多肽为特^正的癌症的 进展的方法，所述方法包括以下步骤确定所述4匕合物是否抑制所 述EML4-ALK融合多肽在所述癌症中的表达和/或活性。在一种优 选的实施方式中，EML4-ALK融合多肽的表达和/或活性的抑制是
65利用至少 一种试剂力口以确定，其中所述试剂检测本发明的融合多核 香酸和/或融合多肽。上面已描述了本发明的优选试剂。在下面的部
分G中更详细地描述了适合于抑制ALK激酶活性的化合物。
化合物可以是，例如，激酶抑制剂，如小分子或抗体4中制剂。 它可以是相对于多种不同的激酶具有活性的泛激酶抑制剂，或激酶 特异性抑制剂。在下面的部分G中进一步详细地讨论了 ALK激酶-抑制化合物。可以在用抑制剂进4于治疗之前和以后获得患者生物冲羊 品，然后利用上述方法分析抑制剂对ALK激酶活性的生物效应， 包括下游底物蛋白的磷酸化。这样的药效测定可以用于确定药物的 生物活性剂量，其可以优选于最大耐受量。这样的信息还可用于提 出通过证明药物作用机制而认可的药物。在下面的部分G中进一步 描述了具有上述期望的抑制特性的化合物的鉴定。
G癌症的治疗性抑制
根据本发明，现已表明，其中表达EML4-ALK融合蛋白的哺 乳动物实体瘤癌症(NSCLC )的进展可以通过抑制上述癌症中ALK 激酶的活性加以体内抑制。类似地，如本文所描述的，其中表达 TFG-ALK融合蛋白的哺乳动物实体瘤癌症的活性可以类似地通过 抑制上述癌症中的ALK激酶活性加以体内抑制。通过用ALK激酶 -抑制治疗剂，如小分子激酶抑制剂如WHI-131或WHI-154接触癌 症(例如，肿瘤)可以抑制以突变体ALK多肽的表达为特4正的癌 症中的ALK活性。如在下面的实施例2中进一步描述的，利用示 例性类型的ALK-抑制治疗剂，siRNA，通过抑制融合激酶可以实 现例如表达ALK融合蛋白的肿瘤的生长抑制。因此，本发明部分 地提供了 一种通过抑制突变体ALK激酶在癌症中的表达和/或活性 而用于抑制表达EML4-ALK融合多肽的癌症或表达TFG-ALK融合 多肽的实体瘤的进展的方法。
ALK激酶-抑制治疗剂可以是4壬4可组合物，该组合物包含至少 一种化合物(生物的或化学的)，其直接或间接地抑制ALK激酶体 内的表达和/或活性，并且包括下面描述的示例性类型的化合物。这才羊的^:合物包4舌这才羊的治疗剂(therapeutics),其直4妾4乍用于ALK 激酶本身、或改进ALK活性的蛋白质或分子，或其通过抑制ALK 的表达而间接起作用。这样的组合物还包括仅包含单一 ALK激酶 抑制化合物的組合物，以及包含多种治疗剂(包括那些相对于其它 RTK的治疗剂)的组合物，其还可以包4舌非特异性治疗药剂如化疗 药物或通用转录抑制剂。
小分子抑制剂
在某些优选的实施方式中，可用于实施本发明的方法的ALK-抑制治疗剂是靶向小分子抑制剂，如WHI-131和WHI-154、或它 们的类似物。WHI-131和WHI-154是ALK的会唑啉类小分子靶向 抑制剂，并且已描述了它们的性能。参见Marzec " a/., Lab. Invest. 85(12): 1544-54 (2005)。已经表明，这些4匕合物可以在'淋巴瘤细月包 中诱导凋亡和抑制增殖。激酶的其它小分子靶向抑制剂在本领域是 众所周知的。例如，Gleevec (STI-571， Imatinib)，其特异性地结 合于并阻断BCR-ABL融合激酶(以及其它激酶)的ATP-结合位点 从而防止该酶的石粦酸化和激活，可商业上获得并且其性能是众所周 ^口6勺。参见，侈寸^口， Dewar "/., S/ooc/ 7Q5(^人3127-32 (2005)。 Novartis, Inc.和Cephalon， Inc.目前正开发ALK的其它小分子抑制 剂。
小分子靶向抑制剂是一类分子，其通常通过特异性地、并且经 常不可逆地结合于酶的催化部位、和/或结合于酶内的ATP-结合槽 或其它结合位点(其防止酶采取其活性所必须的构象)来抑制它们 的耙酶的活性。可以利用ALK激酶三维结构的X射线晶体学模拟 或计算机模拟来合理地设计小分子抑制剂，或可以通过高通量筛选 抑制ALK的化合物文库来发现小分子抑制剂。这冲羊的方法在本领 域是众所周知的，并且已加以描述。例如，如上所述，通过才企查这 样的化合物抑制ALK活性、^旦不抑制其它激酶活性的能力(在一 组激酶中)，和/或通过检查在包含肺癌细胞的生物样品中ALK活性 的抑制，可以证实ALK抑制的特异性。下面将进一步描述这样的 篩选方法。
67抗体抑制剂
可用于本发明的方法的ALK激酶-抑制治疗剂还可以是靶向抗 体，其特异性地结合于ALK活性所需要的关键催化或结合位点或 结构域，以及通过阻止配体、底物或次级分子接近ALK,和/或防 止酶釆取其活性所必须的构象，来抑制激酶。已^艮好地描述了人源 4b革巴特异性抗体的生产、婶选、以及治疗应用。参见，Merluzzi W"/.， 爿c/v C/,'w Pa仇4(2): 77-85 (2000)。可获4寻用于高通量产生和筛选人 源化草巴特异性4中制抗体的商用4支术和系统，如Morphosys， Inc.的 Human Combinatorial Antibody Library(HuCAL⑧)。
已描述了各种抗受体激酶靶向抗体的生产以及它们在抑制靶 向受体的活性中的应用。参见，例如，美国专利7>开号20040202655, "Antibodies to IGF-I Receptor for the Treatment of Cancers," October 14， 2004， Morton W "/.;美国专矛P^开号20040086503， "Human anti-Epidermal Growth Factor Receptor Single-Chain Antibodies," April 15， 2004， Raisch ; 美国专利7>开号20040033543,
"Treatment of Renal Carcinoma Using Antibodies Against the EGFr，" February 19, 2004, Schwab "/。用于产生和应用受体酪氨酸激酶活 性-抑制抗体的准化方法在本领域中是已知的。参见，例如，欧洲专 利号EP1423428, "Antibodies that Block Receptor Tyrosine Kinase Activation, Methods of Screening for and Uses Thereof," June 2， 2004， Borges W a/。
噬菌体展示方式还可以用来产生ALK-特异性抗体抑制剂，并 且用于噬菌体文库构建和重组抗体选择的程序提供在众所周知的 参考教科书Current Protocols in Immunology, Colligan (Eds.), John Wiley & Sons, Inc. (1992-2000), Chapter 17， Section 17.1 中。还参见美国专利第6,319,690号，2001年11月20曰，Little W a/.; 美国专利第6,300,064号，2001年10月9日，Knappik Wa/.;美国 专利第5,840,479号，1998年11月24日，Little""/.;美国专利爿^ 开号20030219839， 2003年11月27曰，Bowdish可以产生展示在噬菌体表面上的抗体片断的文库(参见，例如，
美国专利6,300,064， 2001年10月9日，Knappik " a/.)并筛选用 于结合于受体蛋白质酪氨酸激酶(如ALK)的可溶的二聚体形式。 结合于RTK的可溶二聚体形式并用于筛选的抗体片断被鉴定为候 选分子，用于阻断细胞中草巴RTK的组成型激活。参见欧洲专利第 EP1423428号，齡gM " a/"上文。
在如上所述的抗体文库筛选中鉴定的结合靶向抗体的ALK然 后可以进一步筛选它们在体外激酶测定和体内(在细胞系和/或肿瘤 中)激酶测定中阻断ALK的活性的能力。如上所述，例如，通过 检查这样的抗体治疗剂抑制ALK激酶活性、但并不抑制其它激酶 活性的能力(在一组激酶中)，和/或通过检查在包含癌细胞的生物 样品中ALK活性的抑制，可以证实ALK抑制。上文进一步描述了 筛选这样的用于ALK激酶抑制的化合物的方法。
间4妄承卩制剂
可用于实施所4皮露方法的ALK-抑制化合物还可以是这样的化 合物，其通过抑制蛋白质或分子而不是ALK激酶本身的活性来间 接地抑制ALK活性。这样的抑制治疗剂可以是靶向抑制剂，其调 节关键调节激酶的活性，其中关键调节激酶磷酸化或去磷酸化(因此 活化或去活化)ALK本身，或干^尤配体的结合。如同其它受体酪氨 酸激酶一样，通过连接物蛋白和下游激酶(包括STAT5和AKT) 的网络，ALK调节下游信号。因此，通过乾向这些相互作用或下游 蛋白质，可以抑制通过ALK活性的细胞生长的诱导和存活。目前 正在开发的可以以这种方式4吏用的药物包括AVartmanin。
通过利用抑制为ALK采取其活性构象所必须的激活分子的结 合的化合物还可以间接地抑制ALK激酶活性。类似地，例如，已 描述了负调节PDGF受体酪氨酸激酶的抗PDGF抗体的生产和应 用。参见美国专利,>开号20030219839, "Anti-PDGF Antibodies and Methods for Producing Engineered Antibodies," Bowdisha/.。
69利用ALK三维结构的X射线晶体学模拟或计算机模拟可以合 理地设计ALK活性的间接抑制剂，或可以通过高通量筛选用于抑 制关键上游调节酶和/或必要的结合分子的化合物文库来发现ALK 活性的间接抑制剂，其导致ALK激酶活性的抑制。这样的方式在 本领域是众所周知的，并且已有描述。如上所述，例如，通过检查 上述化合物抑制ALK活性、^旦不抑制其它激酶活性的能力(在一 组激酶中)，和/或通过检查在包含癌细胞(例如，NSCLC细胞)的 生物样品中ALK活性的抑制，可以证实通过上述治疗剂的ALK抑 制。下面将进一步描述用于鉴定化合物的方法，其中化合物抑制以 EML4-ALK或TFG-ALK融合多核苷酸和/或融合多肽为特;f正的癌 症。
反义和/或转录抑制剂
ALK抑制治疗剂还可以包括反义和/或转录抑制化合物，其通 过阻断编石马ALK的基因和/或EML4-ALK或TFG-ALK融合基因或 截短的ALK基因的转录来抑制ALK激酶活性。例如，已描述了通 过用于治疗癌症的反义疗法来抑制各种受体激酶，其包括VEGFR、 EGFR、 IGFR、 ^乂及FGFR。参见，侈'j^口，美国专矛J第6,734,017号； 第6,710,174号；第6,617,162号；第6,340,674号；第5，783，683号； 第5,610,288号。
按照已知技术，可以将反义寡核苷酸设计、构建，并用作相对 于輩巴基因的治疗药剂。参见，例^口 ， Cohen， J, 7VewA i^"rmaco/.
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70对于哺乳动物ALK基因的反义寡核苷酸(参见图4(SEQ ID NO: 6)) 或EML4-ALK或TFG-ALK融合多核普酸或截短的ALK多核苷酸 (参见图2A-C(SEQIDNO: 2、 19、以及21))。如下文进一步描述 的，可以制备和给予包含ALK-抑制反义化合物的药物组合物。
小分子干涉RNA
小分子干涉RNA分子(siRNA )组合物(其通过RNA千涉过 程抑制ALK的翻译，因而抑制其活性)，也可以期望用于本发明的 方法中。已很好地描述了 RNA干涉，以及通过引入外源性小双链 RNA分子(其包含互补于编码靶蛋白的mRNA的序列)来选择性 沉默靶蛋白表达。参见，例如，美国专利公开号20040038921， "Composition and Method for inhibiting Expression of a Target Gene，" February 26, 2004， Kreutzer W "/.;美国专利/>开号20020086356， "RNA Sequence-Specific Mediators of RNA Interference," June 12， 2003, Tuschl " a/.;美国专利^>开号20040229266， "RNA Interference Mediating Small RNA Molecules," November 18， 2004， Tuschl "/.。
例如，如目前示出的(参见实施例2)，在表达融合蛋白的人 NSCLC细胞系中siRNA-介导的EML4-ALK融合蛋白表达的沉默选 择性地抑制在那些细胞中的疾病的进展，但在并不表达突变体ALK 蛋白质的对照细月包中则不是如此。
已表明，双链RNA分子(dsRNA)以高度保守的调节机制，称作 RNA干涉(RNAi)，阻断基因表达。简单地i兌，RNAse III Dicer将 dsRNA处理成大约22个核苷酸的小分子干涉RNA(siRNA)，其作 为引导序列，以通过RNA诱导的沉默复合RISC来诱导靶特异 mRNA剪切(参见Hammond " 淑脚(2000) 404: 293-296 )。 RNAi涉及催化型反应，从而通过更长dsRNA的连续剪切来产生新 的siRNA。因此，不同于反义，RNAi以非化学计量方式降解靶RNA。 当给予细胞或生物体时，夕卜源性dsRNA显示出可以引导通过RNAi 的内源性信使RNA(mRNA)的序列特异降解。现在可商业上获得各种各样的靶特异性siRNA产品，包括用于 它们表达和应用在哺乳动物细月包中的载体和系统。参见，例如， Promega, Inc. (promega.com); Dharmacon， Inc. (dharmacon.com)。 可 获得关于用于RNAi的dsRNA的设计、构建、以及应用的详细技术 手册。参见，侈寸长口, Dharmacon，s "RNAi Technical Reference & Application Guide"; Promega,s "RNAi: A Guide to Gene Silencing"。 ALK-抑制siRNA产品也可以商业上获得，并且可以适当地用于本 发明的方法。参见，例长口 ， Dharmacon, Inc., Lafayette, CO (Cat Nos. M-003162-03， MU-003162-03， D-003162-07至-10 (siGENOME SMARTselection and SMARTpool siRNAs)。
最近已确定，在哺乳动物中介导RNAi方面最有效的是长度少 于49个核苷酸、并且优选19-25个核苷酸的小dsRNA,其包含至 少一个基本上相同于部分輩巴mRNA序列的序列，以及该dsRNA最 佳地在一端具有至少一个l-4个核苦酸的突出端。参见美国专利7> 开号20040038921， Kreutzer a/.,上文；美国专利开号 20040229266, Tuschl ^ ,上文。在上述出X反物中详细地描述了这 样的dsRNA的构建，以及在药物制剂中它们用来沉默靶蛋白的体 内表达。
如果在哺乳动物中待耙向的基因序列是已知的，例如，则可以 产生和试-验21-23 ntRNA在哺乳动物细胞，如人或其它灵长类细胞 中介导RNAi的能力。如果需要，可以以适当的动物模型试验那些 显示出介导RNAi的21-23 ntRNA分子，以进一步评估它们的体内 有效性。已知的革巴位点，例如，基于对其它核酸分子(例如核酶或 反义)的研究确定为有效靶位点的靶位点，或那些已知与疾病或病 症有关的靶位点如那些包含突变或缺失的位点，也可以用来设计靶 向那些卩立点的siRNA分子。
可替4奂地，例如通过利用计算扭^斤叠算法，可以合理地i殳计/ 预测有效dsRNA的序列，其筛选感兴趣的耙mRNA的耙位点。耙 序列可以被电子(电脑模拟，/ww7/co)分析成特定长度的所有片断 或亚序列的清单，例如23个核苦酸片断，其中利用定制Perl原本
72或商用序列分冲斤禾呈序3口 Oligo、 Mac Vector 、或GCG Wisconsin Package。
各种参数可以用来确定哪些位点是靶RNA序列内的最合适耙 位点。这些参^t包括^旦不限于二级或三级RNA结构、輩巴序列的核 香酸碱基组成、靶序列的各种区之间的同源度、或在RNA转录物 中耙序列的相对位置。基于这些确定，可以选4奪RNA转录物内的 4壬<可凄史目的把位点以筛选siRNA分子的功效，例如通过利用体外 RNA剪切测定、纟田胞培养、或动物才莫型。参见，例如，美国专利/> 开号20030170891， September 11， 2003， McSwiggen J。最近还描述了 一种用于鉴定和选择RNAi靶位点的算法。参见美国专利7>开号 20040236517， "Selection of Target Sites for Antisense Attack of RNA，，' November 25, 2004， Drlicaa/.。
通常使用的基因转移技术包括磷酸钓、DEAE-葡聚糖、电穿孔 和《效注射以及病毒方法(Graham W (1973) Wra/. 52: 456; McCutchan a/., (1968), / Cawcer /wW. 4/: 351; Chu
(1987)， iVwc/.」c/<*": 1311; Fraley " (1980)， / 5/o/. CAe附.
10431; Capecchi (1980)， Ce〃 22: 479)。还可以利用阳离子脂质 体4夸DNA引入到细月包中(Feigner et al. (1987)， iVoc. 爿c"c .
7413)。商业上可获4f的阳离子脂质剂型包括Tfx 50(Promega)或Lipofectamin 200(Life Technologies)。 可替换地,病 毒载体可以用来将dsRNA递送到细胞并介导RNAi。参见美国专利 />开号20040023390, "siRNA-mediated Gene Silencing with Viral Vectors," Feb. 4， 2004， Davidsono/.。
用于哺乳动物细月包中的RNAi的寿争染和载体/表达系统是商业 上可获得的，并且已得到4艮好描述。参见，例如，Dharmacon， Inc., DharmaFECTTM系统；Promega, Inc., siSTRIKE U6 Hairpin系统； 还参见Gou " a/. (2003)尸五^S. 548， 113-118; Sui, G. W a/. A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells (2002)尸腦.淑/. ^c"d 99， 5515-5520; Yu " (2002)尸亂淑/. JcW.99， 6047-6052^ Paul, C. d C (2002)胸訓Ao&c/mo/c^ 19， 505-508; McManus " (2002) i 崩& 842-850。
然后通过将包含dsRNA的药物制剂主会予哺乳动物，可以在哺 乳动物中利用制备的dsRNA分子来进4亍siRNA干涉。以足以4中制 靶基因表达的剂量给予药物组合物。通常可以以小于5 mg dsRNA/ 千克体重/天的剂量给予dsRNA，并且足以抑制或完全抑制靶基因 的表达。通常，dsRNA的适宜剂量将在0.01至2.5毫克/受体的千 克体重/天的范围内，优选在0.1至200孩t克/千克体重/天的范围内， 更优选在0.1至100微克/千克体重/的范围内，甚至更优选在1.0至 50微克/千克体重/天的范围内，以及最优选在1.0至25微克/千克体 重/天的范围内。包含dsRNA的药物组合物每天给予 一次，或例如 利用本领域众所周知的緩释剂型以多个亚剂量给予。如下文进一步 描述的，可以按照标准技术来制备和给予这样的药物组合物。
如上所述，通过制备包含治疗有效量的这样的dsRNA的药物 制剂，并将该制剂给予患有表达EML4-ALK或TFG-ALK融合蛋白 或截短的活性ALK激酶的癌症的人受治疗者，例如，通过直接注 射到肿瘤，上述dsRNA可以用来在癌症中抑制ALK表达和活性。 最近已描述了利用siRNA抑制剂来类似i也抑制其它受体酪氨酸激 酶，如VEGFR和EGFR。参见美国专利^>开号20040209832， October 21， 2004, McSwiggen ef ; 美国专利z>开号20030170891， September 11， 2003, McSwiggen;美国专利7>开号20040175703， September 9, 2004， Kreutzer 。
治疗组合物；*合药
可以通过本领域已知的任何方式，包括^旦不限于口服或腹膜途 径，其包括静脉内、肌内、腹膜内、皮下、经皮、气道(气雾剂)、 直肠、阴道和局部(包括颊和舌下)给药，将可用于实施本发明的 方法的ALK激酶-抑制治疗组合物给予哺乳动物。
对于口服给药，将通常以片剂或胶嚢剂的形式、作为散剂或颗 粒剂、或作为含水溶液或混悬剂，来提供ALK-抑制治疗剂。用于口服的片剂可以包括与药用赋形剂如惰性稀释剂混合的活性组分、 崩解剂、粘合剂、润滑剂、甜味剂、增香剂、着色剂以及防腐剂。 适宜的惰性稀释剂包括碳酸钠和碳酸钙、磷酸钠和磷酸钙、以及乳
if唐，而玉米淀4分和海藻酸是适宜的崩解剂。粘合剂可以包括淀4分和 明胶，而润滑剂，如果存在的话，将通常是硬脂酸镁、硬脂酸或滑 石粉。如果需要的话，片剂可以涂布有一种材料如甘油单硬脂酸酯 或二石更脂酸甘油酯，以延迟在胃肠道中的吸收。
用于口服的胶嚢剂包括硬(明胶)胶嚢剂，其中活性组分与固 体稀释剂混合，以及软胶嚢剂，其中活性组分与水或油混合，如花 生油、液状石蜡或橄榄油。对于肌内、腹膜内、皮下以及静脉内应 用，本发明的药物组合物将通常以无菌含水溶液或混悬剂提供，其
^L緩冲到适当pH和等渗性。适宜的含水载体包括林格氏液和等渗 氯化钠。载体可以仅仅由含水緩沖液构成("仅仅"是指不存在任 何助剂或包胶物质，其可能会影响或介导ALK-抑制治疗剂的摄 取)。这样的物质包括，例如，胶束结构，如脂质体或衣壳，如下 所述。含水混悬剂可以包括悬浮剂如纤维素衍生物、海藻酸钠、聚 乙烯吡咯烷酮和黄芪树胶，以及湿润剂如卵磷脂。用于含水混悬剂 的适宜的防腐剂包4舌对羟基苯曱酸乙酯和对羟基苯甲酸正丙酯。
ALK激酶-抑制治疗组合物还可以包括孩i嚢剂以防止治疗剂 (例如，dsRNA化合物)快速从体内消除，如控释剂型，其包括植 入物和微嚢化递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容聚合物， 如乙烯乙酸乙烯酯、聚肝类、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯类、以及
而易见的。还可以从Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals, Inc.
商业上获得该材料。脂质体混悬剂(包括脂质体，其靶向具有相对 于病毒抗原的单克隆抗体的感染细胞)也可以用作药用载体。这些 混悬剂可以4要照本领域4支术人员已知的方法加以制备，例如，如在 美国专利第4,522,811号、PCT7^开WO 91/06309、以及欧洲专利 公开EP-A-43075中所描述的。微囊剂可以包含病毒外壳蛋白。该 病毒外壳蛋白可以衍生自或伴随病毒，如多瘤病毒，或它可以是部
75分或全部人工的。例如，夕卜壳蛋白可以是多瘤病毒的病毒蛋白l和
/或病毒蛋白2、或其书f生物。
ALK-抑制组合物还可以包含递送载体(包括脂质体，用于给 予受治疗者)、载体和稀释剂以及它们的盐，和/或可以存在于药用 剂型中。例如，用于递送核酸分子的方法描述在以下文献中Akhtar a/" 1992, r訓A Ce〃 Wo., 2， 139; Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics, ed. Akbtar, 1995, Maurer "a/.， 1999， Mo/. Me*. Ao/" M， 129-140; Hofland和Huang, 1999， 尸/^附,/" "7, 165-192;以及Lee " a/" 2000， ACS Symp. Ser.， 752， 184-192。。 Beigelman等人，美国专利第6,395,713 号和Sullivan等人PCT WO 94/02595进一步描述了用于递送核酸分 子的一45:方法。这些程序可以用来递送实际上任何核酸分子。
可以通过本领域:技术人员已知的各种方法将ALK-抑制治疗剂 给予哺乳动物肺瘤，上述方法包括^旦不限于，月交嚢化在脂质体中， 通过离子导入，或通过加入到其它载体中，如水凝月交、环糊精、生 物可降解的纳米月交嚢、以及生物粘附孩"求，或通过蛋白质载体 (O'Hare和Normand,国际PCT ^>开号WO 00/53722 )。可替换地， 通过直接注射或通过使用灌注泵，局部递送治疗剂/载体组合。可以 利用标准针和注射器方法，或通过无针4支术如那些在Conry " "/., 1999， C7/". Ca"cw 5， 2330-2337和Barry " "/.,国际PCT 7>开 号WO 99/31262中所描述的无针:技术进^f亍组合物的直4妄注射(不管 是皮下、肌内、或皮内)。
ALK激酶-抑制治疗剂的药用剂型包括上述化合物的盐，例如， 酸加成盐，例如，盐酸、氢溴酸、乙酸、以及苯磺酸的盐。药物组 合物或剂型是指具有一定形式的组合物或剂型，其适合于给予(例 如，系统给予)细胞或患者，包括例如人。适当的形式部分地取决 于应用或进入途径，例如口月良、经皮、或通过注射。这样的形式应 当不会阻止组合物或剂型到达草巴细l包。例如，注入血流的药物组合 物应当是可溶的。其它因素是本领域已知的，并且包括诸如毒性和 形式等的考虑事项，其阻止组合物或剂型发挥其效应。导致系统吸收(即，药物系统吸收或蓄积在血流中，接着分布
于全身)的给予途径是所期望的并且包括但不限于静脉内、皮下、 腹膜内、吸入、口服、肺内以及肌内。这些症会予途径的每一种将 ALK-抑制治疗机暴露于可接近的疾病组织或肿瘤。已表明，药物进 入循环的速率是分子量或大小的函数。使用包含本发明的化合物的 脂质体或其它药物载体可以潜在地将药物定4立在，例如，某些组织 类型，如网状内皮系统(RES)的组织。可以促进药物締合于细胞 (如，淋巴细胞和巨噬细胞)表面的脂质体剂型也是有用的。通过 利用巨噬细胞和淋巴细胞免疫识别异常细胞(如癌细胞)的特异性， 这种方式可以提供增强药物递送到革巴细月包。
"药用剂型"是指一种组合物或剂型，其便于将本发明的核酸 分子有效分布在最适合于它们所期望活性的物理位置。适用于具有 本发明的核酸分子的剂型的制剂的非限制性实例包括P糖蛋白抑 制剂(如Pluronic P85 ),其可以增强药物进入CNS ( Jolliet-Riant 和Tillement， 1999, Fw油m. C"w. Ptom,/" /3, 16-26 );生物可降 解聚合物，如聚(DL-交酯-共羟基乙酸)微球，用于在脑内植入后的 纟爰释递送(Emerich " 1999， Ce〃 7harrap/^^ S， 47-58 ) ( Alkermes， Inc. Cambridge, Mass.);以及负荷纳米孩吏粒，如那些由聚氰基丙烯 酸正丁酯构成的负荷纳米孩i粒，其可以递送药物穿过血脑屏障并可 以？文变3申纟至元才聂取才几命J ( /Vog 7Vewro-/ 5^c/w/ /^rwaco/ J5/o/ 尸矽c/n'"^乂 23， 941-949, 1999 )。可用于本发明的方法的ALK-抑制化 合物的递送策略的其它非限制性实例包括在Boado d a/.， 1998, 尸/wr附.5W.' S7, 1308-1315; Tyler W "/., 1999, FE^S427， 280-284; Pardridge W "/" 1995,尸A04S L^4.， 92， 5592-5596; Boado, 1995， Wv Z>wgZ)e//\^y Aev., 75, 73-107; Aldrian-Herrada W a/.， 1998， 脸由cy4"A i &y" 2(5, 4910-4916;以及Tyler W "/" 1999, n, 96, 7053-7058中所描述的材料。
包含表面修饰脂质体(其含有聚乙二醇脂质(PEG修饰、或长 循环脂质体，或隐形脂质体))的治疗组合物还可以适当地用于本发 明的方法。这些剂型提供一种用于在耙组织中增加药物蓄积的方 法。通过单核吞噬细胞系统(MPS或RES)，这类药物载体耐调理和消除，从而可以获得更长的血液循环时间并增强组织暴露于月交嚢
化药物(Lasic " /. C7z缀細.1995， 95, 2601-2627; Ishiwata " a/,, CTze附."t/〃. 1995, 43， 1005-1011 )。已表明，这才羊的脂质体选 择性地蓄积在肿瘤中，大相无通过外渗和捕纟足在新血管形成的把组织 中(Lasic & "/.， 5We腳1995， 267， 1275-1276; Oku "《1995, Aoc/wTw. 1238， 86-90 )。长循环脂质体可增强DNA和
RNA的药物动力学和药凌丈学，尤其与已知蓄积在MPS的组织中的 常夫见阳离子脂质体相比(Liu W "/.， J. Biol. Chem. 1995， 42, 24864-24870; Choi W "/.,国际PCT公开号WO 96/10391; Ansell et al.，国际PCT />开号WO 96/10390; Holland " a/.,国际PCT 7〉开 号WO 96/10392)。与阳离子脂质体相比，长循环脂质体还可以在 更大程度上保护药物免受核酶降解，其是基于它们避免蓄积在代谢 侵袭性MPS组织如肝和脾中的能力。
治疗组合物可以包括药物有效量的在药用载体或稀释剂中的 所期望的化合物。用于治疗用途的可接受的载体或稀释剂在制药领 ;或是众戶斤周^口 6勺，并且4苗述在<列^口 Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro, Ed. 1985)中。例如， 可以提供防腐剂、稳定剂、染料以及增香剂。其包括苯甲酸钠、山 梨酸以及对羟基苯甲酸的酯。此外，可以4吏用抗氧化剂和悬浮剂。
药物有效剂量是防止、抑制疾病状态的发生、或治疗疾病状态 (减轻症状到一定程度、优选所有症状)所需要的剂量。药物有效 剂量耳又决于疾病类型、所用的组合物、给药途径、4寺治疗哺乳动物 的类型、所考虑的特定哺乳动物的物理特性、同时发生的用药、以 及医疗领域技术人员将明了的其它因素。通常，给予0.1 mg/kg到 100mg/kg体重/天的活性组分之间的量，其取决于带负电荷聚合物 的效能。
约O.l mg至约140 mg/千克体重/天的剂量水平可用于治疗上述 病症(约0.5 mg至约7 g/患者/天)。可以结合于载体材料以产生单 剂量形式的活性组分的量随待治疗的宿主和特定的给予方式而变 化。剂量单位形式通常包含约1 mg至约500 mg之间的活性组分。
78应当明了，用于任何特定患者的具体剂量水平取决于各种因素，包 括所釆用特定化合物的活性、年龄、体重、 一般健康状态、性别、 饮食、给药时间、给药途径、排泄速率、药物组合以及接受治疗的 特定疾病的严重性。
为了给予非人动物，还可以将组合物加入到动物饲料或饮用水 中。可以方偵j也配制动物祠料和々欠用水组合物，佳j寻动物连同其々欠 食获得治疗适宜量的组合物。还可以方便地提供组合物作为预混合 料，用于加入到饲料或饮用水中。
可用于实施本发明的ALK-抑制治疗剂可以包含如上所述的单 一化合物，或多种化合物的组合，不管是相同类型的抑制剂(即， 抗体抑制剂)、或不同类型的抑制剂(即，抗体抑制剂和小分子抑 制剂)。这样的化合物组合在抑制融合蛋白-表达癌症的进展时可以 增加总治疗效应。例如，治疗组合物可以是小分子抑制剂，如单独 的WHI-131和/或WHI-154,或连同輩巴向ALK活性的其它4中制剂和 /或其它小分子抑制剂。除一种或多种靶向抑制剂之外，治疗组合物 还可以包括一种或多种非特异性化疗药物。最近已表明，这样的组 合可以在许多癌症中提供协同肿瘤杀伤效应。这样的组合在抑制 ALK活性和胂瘤体内生长方面的有效性可以如下所述加以评估。
突变体ALK激酶-抑制化合物的鉴定
本发明还部分地提供了 一种方法，用来确定一种化合物是否抑 制以EML4-ALK或TFG-ALK融合多核苷酸和/或融合多肽为特征 的癌症的进展，其中通过确定该4匕合物是否4中制EML4-ALK或 TFG-ALK融合多肽或截短的ALK激酶多肽在癌症中的活性。在某 些优选的实施方式中，通过才全查包含来自骨髓、血液、胸膜渗出液、 或胂瘤的细力包的生物才羊品来确定ALK活性的抑制。在另一种〗尤选 的实施方式中，利用本发明的至少一种突变体ALK多核苷酸或多 肽-特异性试剂来确定ALK活性的抑制。试-验化合物可以是如上所述的任何类型的治疗剂或组合物。用 于评估化合物功效(体外和体内)的方法一皮^艮好建立并且在本领域
是已知的。例如，利用其中ALK ^皮激活的细胞或细胞提取物可以 试验组合物体外抑制ALK的能力。 一组化合物可以用来试-验化合 物对于ALK的特异性(不同于其它輩巴，如EGFR或PDGFR)。
可以4吏用的另 一种药物筛选^支术可以高通量筛选对于感兴趣 的蛋白质具有适当结合亲合力的化合物，如在7>开的PCT申请 W084/03564中所描述的。以这种方法，当应用于突变体ALK多肽 时，大量的不同小试验化合物被合成在固相基板上，如塑料针或某 些其它表面。试验化合物与突变体ALK多肽、或其片断反应，然 后洗涤。然后通过本领域众所周知的方法4企测结合的突变体多肽 (例如，EML4-ALK融合多肽)。还可以将纯化的突变体ALK多肽 直接涂布在平板上，用于上述药物筛选技术。可替换地，非中和抗 体可以用来捕才足肽并将它固定在固体载体上。
对于发现是ALK体外活性的有效抑制剂的化合物，然后可以 检查其体外抑制表达EML4-ALK或TFG-ALK融合多肽和/或截短 的ALK激酶多肽的癌症的进展的能力，其中利用，例如，哺乳动 物异种移才直躲藏人胂瘤，如NSCLC。以这种方式，可以在最冲竒密 地类似患者的生物装置中观测药物的效应。可以通过用磷酸化-特异 性抗体进行分析来确定在癌细胞或周围基质细胞中药物改变4言号 的能力。还可以通过用凋亡特异性标志如剪切的胱冬裂酶3和剪切 的PARP进行分析来，见测药物在i秀导细胞死亡或抑制细胞增殖中的 有效性。类似地，可以采用由突变体ALK蛋白质驱动的哺乳动物 骨髓移植物(例如，小鼠)，其躲藏人白血病。在这种方式中，将 已知由突变体ALK激酶驱动的骨髓细胞移才直到小鼠中。可以监测 癌细胞的生长。然后可以用药物治疗小鼠，并外部观测药物治疗对 癌症表型或进展的影响。然后处死小鼠并除去移植的骨髓，供通过 IHC和蛋白质印迹等进行分析。
这样的化合物的毒性和治疗功效可以通过在细胞培养或实—验 动物中的才示准药学禾呈序来确定，例4口，用于确定LD50 ( 50%群体
80的致死剂量)和ED50 (在50%群体中的治疗有效剂量)。毒性和治 疗效应之间的剂量比率是治疗指数并且它可以表示为比率 LD50/ED50。呈现高治疗指数的化合物是优选的。
上文和下文引用的所有参考文献的教导以引用方式结合于本 文。以下实施例^又用来进一步说明本发明，而不是限制其范围，其 由所附的^又利要求所限定。本发明包括本文教导的方法的改进和变 化，其对于本领域技术人员来说是显而易见的。
实施例1
通过全面磷B分布鉴定实体瘤中的ALK激酶活性
A.人NSCLC细胞系的分布
利用最近描述的、用于从复杂混合物分离和质"i普表征^f多饰肽的 有力技术("IAP"4支术，参见Rush " "/.，上文)冲企查了在22种人 NSCLC细胞系(包括H2228)中激酶激活的全面磷酸化分布。利 用石舞酸酪氛&臾净争异寸生4元体(Cell Signaling Technology, Inc., Beverly, MA, 2003/04 Cat. #9411 )实施IAP才支术，来乂人NSCLC细 胞系的4是取物中分离并随后表征含磷酸酪氨酸的肽。
具体地说，IAP方式用来促进鉴定酪氨酸激酶，其对每个 NSCLC细胞系中的蛋白质磷酸化负责。尤其是，考虑到非典型的 或异常的激酶活性。
细胞培养
所有细胞培养试剂购买自Invitrogen， Inc.。检查了总共41种人 NSCLC细胞系。人NSCLC细胞系，H520、 H838、 H1437、 H1563、 HI568、 HI792、 HI944、 H2170、 H2172、 H2228、 H2347、 A549、 H441、 HI703、 HI373、以及H358，获自American Type Culture Collection,并培养在RPMI 1640培养基中，该培养基含有10%FBS 并加以调节以包含2 mML-谷氨酰胺、1.5 g/L石灰酸氢钠、4.5 g/L葡
81萄糖、10mMHEPES、 l.OmM丙酮酸钠、青霉素/链霉素。另外的 6种人NSCLC细胞系，HCC78、 Cal-12T、 HCC366、 HCC15、 HCC44、 以及LOU-NH91,购买自DSMZ并在包含10%FBS和青霉素/链霉 素的RPMI 1640中进行培养。将细胞保持在37。C的5% C02培养 箱中。
为了进行免疫亲和沉淀和免疫印迹实-验，4吏细力包生长至80%汇 合，然后在收获以前在没有FBS的RPMI培养基中饥饿过夜。
石舞酸肽免疫沉淀
将1亿个细胞溶解在脲裂解緩冲液(20 mM N-羟乙基哌嗪 -N，-2-乙烷石黄酸、pH8.0、 9M脲、1 mM钒酸钠、2.5mM焦磷酸钠、 1 mM p-甘油磷酸)中。超声处理溶胞产物并通过离心作用清除溶 月包产物。用DTT还原清除的溶月包产物，然后用石典乙酰胺烷基^R:, 如先前所描述的(参见Rush， & "/.，舰5/o&c/2"o/. Z (7人94-101 (2005))。然后用20 mM N-羟乙基哌"秦->^，-2-乙烷磺酸稀释样品4次 以降低脲浓度至2M，然后在室温下用胰蛋白酶消化过夜同时温和 摇动。
用Sep-Pak C18柱粗略纯化消化的肽，如先前描述的(参见Rush Wa/.,上文)。冷冻并干燥洗脱物并将干燥肽〉容解在1.4 ml的MOPS IP緩冲液(50 mM MOPS/NaOH pH 7.2、 10 mM Na2P04、 50 mM NaCl)中并通过离心作用除去不溶物质。在4。C下用耦联于蛋白质 G琼脂糖珠(Roche)的160 的磷酸酪氨酸100抗体(细胞信号传 导^支术)进4亍免疫;兄淀过夜。然后用1 ml MOPS IP纟差冲液洗涤该 玉朱3次，并用1 mlHPLC级冷dH20洗涤两次。用60 jal 0.1% TFA 乂人珠洗脱石舞酸肽，4妄着用40 Jul 0.1% TFA进4亍第二次洗脱，然后汇 集级分。利用ZipTip柱(Millipore)浓缩洗脱的肽，并用LC-MS/MS 进4亍分才斤。用LTQ离子阱质i普4义(ThermoFinnigan )收集质i普。
82通过LC-MS/MS质谱法进行分析
浓缩IP洗脱物(IOO jil)中的肽并利用停止之后再行的提取尖管 (StageTips)(参见7 ，禍er " 」wa/. C7z缝，7抑..663-70 (2003)) 与洗脱的抗体分离。用1 pl的60。/。MeCN、 0.1% TFA将肽从樣吏柱 洗脱到7.6 pl的0.4%乙^/0.005°/。七氟丁酸(HFBA )中。
对每个磷酸肽样品进行LC-MS分析两次。用C18反相树脂 (Magic C18AQ， 5pm颗粒，200 A孑L径，Michrom Bioresources, Auburn, CA )装填熔凝;圭石孩i毛细管柱(125 pim x 18 cm )。用自动 进样器(LC Packings Famos， San Francisco, CA )将样品(4 pL)装到 此4主上，然后通过在0.1%曱酸中的7至30%乙腈的55分4中线']"生梯 度将样品洗脱到质"i普4义中。利用具有在管线中的流动分流器的二元 HPLC泵(Agilent 1100， Palo Alto， CA )并以大约abc nl/min来递送 梯度。用混合线性离子阱-7 Tesla离子回^走共振傅里叶变换」义 (LTQ画FT, Thermo Finnigan， San Jose， CA ) 5寸洗脱肽离子进4亍质量 分析。
采用了顶七方法，从而基于在ICR细胞中的先前MS测量扫描 期间获得的测量结果收集在线性离子阱中的7个数据相关MS/MS 扫描，其中同时才喿作线性离子阱和4專里叶变换J义。以375-1800 m/z 进行MS扫描，其中自动增益控制(AGC)靶为8x106以及质量分 辨率为105。对于MS/MS， AGC是8xl06,动态排斥时间是25s， 以及通过电荷态筛选来4非斥单电4肓离子。
数据库分析和赋值
利用TurboSequest專id牛(v.27， rev.l2)(ThermoFinnigan )和复合 正向/反向IPI人蛋白质数据库，将MS/MS谱赋予肽序列。搜索参 数是胰蛋白酶作为蛋白酶；1.08 Da前体质量耐受性；在半胱氨 酸上的静态修饰(+57.02146，酰胺曱基化)；以及在丝氨酸、苏氨 酸和酪氨酸(+79.96633 Da,石粦酸化)，赖氨酸(+8.01420，
8313C615N2)，精氨酸(+6.02013, 13C6)以及曱硫氨酸(+15.99491， 氧化)上的动态修饰。靶/引诱物数据库方式用来建立适当的得分-过滤准则以使建立的假-正贝武值率小于1%。除了过电荷相关XCorr 阈值(z-l, XCorr^1.5，对于z=2, XCon^2.2,对于z=3， XCorr^3.3 ) 以夕卜，需要赋值包含磷酸酪氨酸，以具有-5至+25 ppm的质量精度， 以及包含所有轻的或所有重的赖氨^/精氨酸残基。
利用定制量化考呈序，Vista (Bakalarski " "/.，原稿在准备中) 进一 步评估通过这些准则的f武值以计算峰面积以及最终的每种肽 的重和轻形式之间的相对丰度。用在MS扫描中低于15的信噪鉴 定的肽不认为是定量。对于那些仅在条件之一下发现的肽而是使用 信噪比。
搜索了于2004年8月24日发布的NCBI人数据库，该数据库 包含27,175种蛋白质，其允许氧化型曱石克氨酸(M+16)和石粦酸化 (Y+80)作为动态修饰。由至少三位科学家综述了支持赋值序列的最 终清单的所有i普(本文未示出)以确定它们的可靠性。
1,500种以上的磷酸酪氨酸位点、以及大于1，000种的酪氨酸磷酸化 蛋白质，其大多数是新的，并来自已检查的细胞系(数据未示出)。 在i午多细月包系中，如EGFR、 Her2、 Her3、 EphA2以及Met,已知 与NSCLC信号有关的受体酪氨酸激酶观测到被酪氨酸磷酸化。在 多种细胞系中观测到高水平的EGFR磷酸肽，上述多种细胞系包括 HCC827和H3255,已知该两种细月包系表达增加水平的EGFR的基 因活化形式，这证实了该方法可以鉴定已知在NSCLC细胞系中为 活性的受体酪氨酸激酶。
三种细胞系表达的受体酪氨酸激酶未在其它NSCLC细胞系中 〉(见测到。在HCC78、 H2228、以及H1703细月包系中分别^L测到来自 Ros、 ALK、以及PDGFRoc的大量酪氨酸石粦酸化肽。选择高度表达 ALK的NSCLC细胞系H2228，用于进一步4全查。
84B.人NSCLC月中瘤才羊品的分布
IAP才支术，基本上如在上面的部分A中所描述的，随后用来检 查来自NSCLC患者的一组154个人肿瘤样品的全面磷酸分布。组 织获自中国第二湘雅医院。
将冷冻组织样品切成小片，均化在裂解緩冲液(20mMN-羟乙 基哌唤-N，-2-乙烷磺酸pH8.0、 9M脲、1 mN机酸钠，补充有2.5 mM焦磷酸钠、1 mM b-甘油磷酸，1 ml裂解緩冲液用于100 mg冷 冻组织)中，其中4吏用polytron两次，每次20秒。然后对匀浆液进 4亍简单超声处理。用DTT还原清除的溶月包产物并用石典乙酰胺加以 烷基4匕，如先前所述(参见Rush W a/., 7V"A万/o&c/wo/. 23(7" 94-101 (2005))。然后用20 mM N-幾乙基旅。秦->^，-2-乙烷磺酸稀释样品4次 以将脲浓度降低至2M，并在室温下用胰蛋白酶消化过夜同时温和 摇动。
用Sep-Pak C18柱粗略纯化消化的肽，如先前描述的(参见Rush "a/.,上文)。冷冻并干燥洗脱物并将干燥肽溶解在1.4 ml MOPS IP 緩冲液(50 mM MOPS/NaOH pH 7.2、 10 mM Na2P04、 50 mM NaCl) 中并通过离心作用除去不溶物质。在4°C下用耦联于蛋白质G琼脂 糖珠(Roche)的160 的磷酸酪氨酸100抗体(细胞信号传导技术) 进行免疫沉淀过夜。然后用1 ml MOPS IP緩冲液洗涤该珠3次， 并用1 ml HPLC级冷dH20洗涤两次。用60 pi 0.1% TFA从珠洗脱 磷酸肽，接着用40^10.1。/()TFA进行第二次洗脱，然后汇集级分。 利用ZipTip柱(Millipore)浓缩洗脱的肽，并用LC-MS/MS进行分 牙斤。用LTQ离子阱质i普4义(ThermoFinnigan ) 4t集质i普。
如上文在部分A中所描述的，进行磷酸肽免疫沉淀，接着进行 LC-MS/MS分光测定分析。基本上如上文在部分A中所描述的，进 行数据库搜索和序列赋值，但利用于2004年8月24日发布的包含 27，970种蛋白质的NCBI人凄史据库。
上述IAP分析鉴定了 2000种以上的非丰余含磷酸酪氨酸的肽、 1,500种以上的石粦酸酪氨酸位点、以及1,000种以上的酪氨酸石粦酸化
85蛋白质，其来自已检查的人肿瘤样品(数据未示出)。在许多肿瘤
中，如EGFR、 Her2、 Her3、 EphA2以及Met,已知与NSCLC信
号有关的受体酪氨酸激酶再次7见测到^皮酪氨酸z畴酸化。在多个肺瘤 才羊品中再次7见测到高 K平的EGFR石粦酸肽，这i正实了该方法可以鉴 定已知在NSCLC细月包系中为活性的受体酪氨酸激酶。
在其它NSCLC细胞系和肿瘤中未观测到5位患者样品表达的 受体酪氨酸激酶。在患者CS010/11、 CS045、以及CS110L中观测 到大量的来自ALK的酪氨酸磷酸化肽。这些三种肿瘤，其高度表 达ALK， ^皮选择用于进一步检查。
实施例2
三种ALK融^^基因的分离和测序
A.在人NSCLC细胞系的测序
鉴于在NSCLC细胞系H2228中4企测到ALK激酶的高磷酸化 水平，进行了在编码ALK的激酶结构域的序列上的cDNA末端的 5'快速扩增，以便确定是否存在嵌合ALK转录物。
互补DNA末端的快速扩增
RNeasy Mini Kit ( Qiagen )用来/人H2228细月包系才是取RNA。通 过4吏用DNeasy Tissue Kit ( Qiagen )来提取DNA。借助于5'RACE 系统(Invitrogen)来快速扩增cDNA末端，其中引物ALK-GSP1 用于cDNA合成而ALK-GSP2和ALK-GSP3用于嵌套式PCR反应。
5，RACE
图5(图片A )示出了通过5'RACE对EML4-ALK融合基因(短 变体)的检测以及在2轮以后PCR扩增产物的检测。用PCR纯化 试剂盒(Qiagen )纯化PCR产物并利用ALK-GSP3， 一种ABI3130 毛细管自动DNA测序4义(Applied Biosystems )进4亍测序。所得到
86的产物的序列分析揭示了 ALK的激酶结构域和C端纟皮融合到 EML-4基因N端(参见图1，图片B)。 EML4-ALK融合基因(短 变体)是框内的并将EML-4的开始的233个氨基酸融合到ALK的 最后的562个氨基酸(参见图1,图片B)。 EML-4和ALK基因均 位于第2号染色体上，因此通过该两个基因座之间的基因缺失而产 生融合基因。
爿使用了以下引物
ALK-GSP1 ALK-GSP2 ALK-GSP3
;，-GCAGTAGTTGGGGTTGTAGTC (SEQ ID NO: 9) ;，-GCGGAGCTTGCTCAGCTTGT (SEQ ID NO: 10) ;'-TGCAGCTCCTGGTGCTTCC (SEQ ID NO: 11)
PCR测定
进行RT-PCR分析以证实在融合蛋白中EML-4的N端是完整 的(参见图6(图片B))。cDNA的第一条链合成自2.5mg的总RNA， 其中借助于具有寡(dT)20的Superscript III第一条链合成系统 (Invitrogen )。然后，借助于引物对EML-Atg和ALK-GSP3来扩增 EML4-ALK融合基因。4昔助于引物只于EML-4-43和ALK-GSP3、 EML-4-94和ALK-GSP3、以及EML4-202和ALK-GSP3,来4企测 交互融合。对于基因组PCR，通过使用高保真Platinum Taq DNA聚 合酶(Invitrogen)并4昔助于引物对EML-4-atg和ALK-tga来进4亍融合 基因的扩增。
^吏用了以下引物
ALK-GSP3:5，國TGCAGCTCCTGGTGCTTCC (SEQ ID NO:
12)
EML4画Atg: 5'画CGCAAGATGGACGGTTTGGC (SEQ ID NO:
13)
EML4画43: 5'-TGTTCAAGATCGCCTGTCAGCTCT (SEQ ID NO: 14)
87EML4-94: 5'國TGAAATCACTGTGCTAAAGGCGGC (SEQ ID NO: 15)
EML4-202: 5'-AAGCCCTCGAGCAGTTATTCCCAT (SEQ ID NO: 16)
ALK-Tga: 5，-GAATTCCGCCGAGCTCAGGGCCCAG (SEQ ID NO: 17)
值得注意的是，在EML4-ALK融合(短变体)中，ALK部分， 以在其它ALK融合(如发生在ALCL中的NPM-ALK融合)中观 测到的在ALK中精确的相同点，被融合到EML-4部分。按照基因 组DNA，进一步对H2228细胞系中的ALK的激酶结构域进行测序 并发现是野生型。因此，在H2228中发现的缺失突变并不影响ALK 激酶结构域。另外，野生型EML-4仅在EML4-ALK融合蛋白(短变 体)中不存在的位点被酪氨酸磷酸化，这提示在融合蛋白中为保守的 N端巻曲螺旋结构域(参见图1A)可以起作用，以二聚化和活化 ALK、以及促进与虔予生型ALK的相互作用。
B.在人NSCLC细月包系中的测序
类似地，鉴于在来自患者CS010A1、 CS045、以及CSllO的人 NSCLC肺瘤样品中才企测到ALK激酶的高^岸酸化水平，进4亍了在编 码ALK的激酶结构域的序列上的cDNA末端的5'快速扩增，以便 确定在这些肿瘤中是否存在嵌合ALK转录物。
基本上如上面在部分A中所描述的，进行互补DNA端的的快 速扩增和5'RACE,其中引物ALK-GSP1用于cDNA合成而 ALK-GSP2和ALK-GSP3用于嵌套式PCR反应。
图5 (图片C)示出了在两个患者样品中通过5'RACE对 EML4-ALK融合基因(短和长变体两者)的检测，在一位患者中 TFG-ALK融合基因的4企测，以及在2 4仑以后PCR扩增产物的4金测。 基本上如在上面的部分A中所描述的，对PCR产物进行纯化和测 序。所得到的产物的序列分析揭示了 ALK的激酶结构域和C端以两种不同的变体融合到EML-4基因N端(参见图1A-1B，图片B )。 EML4-ALK融合基因是框内的并将EML-4的开始的233个氨基酸 (短变体)或开始的495个氨基酸(长变体)融合到ALK的最后 的562个氨基酸(参见图1A-1B，图片B)。 EML-4和ALK基因均 位于第2号染色体上，因此通过这两个基因座之间的基因缺失来产 生融合基因。在患者CS045中融合基因(短变体)的观测结果证实 了在人细胞系H2228中这种突变体基因的发现。
TFG-ALK融合基因也是框内的并且将TFG的开始的138个氨 基酸融合到ALK的最后的562个氨基酸(参见图1C,图片B)。 TFG和ALK基因位于不同的染色体上(分别为第6号和第2号染 色体)，因此通过这两个基因座之间的基因易位来产生融合基因。 有趣的是，TPG与ALK的融合发生在针对两种EML4-ALK变体的 融合所观测到的在ALK中的精确相同的点，这表明在实体瘤中在 此点ALK的截短可以经常发生。
如在上面的部分A中所描述的，使用相同的引物。基本上如在 上面的部分A中所描述的，进行RT-PCR分析，以证实EML-4和 TFG的N端在融合蛋白中是完整的(参见图6(图片B))。用于EML-4 和ALK的引物对是如在上面的部分A中所描述的。以下引物对用 于TFG:
TFG-F1: 5'-TTTGTTAATGGCCAGCCAAGACCC-3 (SEQ ID NO: 28)
值得注意的是，在两种EML4-ALK融合变体中，ALK部分， 以在其它ALK融合(如发生在ALCL中的NPM-ALK融合)中只见 测到的在ALK中#奮确的相同点，故融合到EML-4部分。另外，野 生型EML-4仅在EML4-ALK融合蛋白中不存在的位点^皮酪氨酸磷 酸化，这提示在融合蛋白中为保守的N端巻曲螺旋结构域(参见图 1A-1B)可以起作用，以二聚化和活化ALK、以及促进与野生型 ALK的相互作用。同样值得注意的是，TG部分与ALK的融合也 发生在ALK中的精确相同的点，并且确实在人淋巴瘤中已描述了
89在此点的TFG与ALK的融合(参见Hernandez " a/. (2002)，上文)， 4旦在人实体瘤，如NSCLC，中先前并没有描述。
实施例3
利用siRNA抑制ALK融合-表达哺乳动物实体瘤的生长
为了i正实ALK的截短的/融合形式正驱动在NSCLC细胞系 H2228以及来自患者CS010/11、 CS045、以及CSllO的NSCLC肿 瘤样品中的细胞生长和存活，可以检查siRNA (相对于ALK )抑制 这些细月包和胂瘤生长的能力。
ALK SMJArpool siRNA双链体(专有靶序列-数据未示出)可 以购买自，侈'B口， DharmaconResearch, Inc. (Lafayette, CO)。非净争异 SM^Wrpool siRNA用作对照。借助于电穿孔并用siRNA转染细胞。 简单;也i兌，利用方形波电穿孑W义(BTX Genetronics， San Diego， CA ) 对2 x 107个细月包(H2228 )发送月永冲一次(20ms; 275V, K562 20ms; 285V )，在室温下温育30分钟，然后转移到含有30 ml RPMI-1640/10% FBS的T150烧并瓦中。
借助于CellTiter 96 AQueousOne溶液细月包增殖测定(Promega) 来确定能生存细月包的凄t目。通过4吏用OriginPro 6.1專欠件(OriginLab ) 来计算IC50 。
可以通过Cleaved-Caspase-3 ( Cell Signaling Technology)的流式细胞分析来确定在48小时时凋亡细胞的百分率。
免疫印迹分析揭示，在siRNA转染进入H2228细胞或来自患 者CS010/11、 CS045、以及CSllO的肿瘤细胞以后72小时，ALK 的表达被特异性地和显著地降低。ALK的负调节预期会导致细胞生 长的强抑制。用ALK siRNA治疗也预期会导致这些实体瘤细胞的 增加的凋亡。这些结果将进一步表明，H2228细胞系和患者胂瘤中 的突变体/融合ALK纟敫酶正驱动这些NSCLC细力包的增殖和生长， 以及通过利用siRNA来抑制ALK激酶表达和活性可以抑制这样的 生长和增殖。实施例4
利用WI-131和/或WI-154来抑制ALK融合-表达哺乳动物 实体瘤的生长
为了进一步i正实突变体ALK融合蛋白正驱动来自患者 CS010A1、 CS045、以及CSllO的NSCLC细胞系H2228和NSCLC 肿瘤细胞的生长和生存，可以用ALK激酶的靶向抑制剂，如WI-131 和/或WI-154,来处理细胞。WI-131和W-154是ALK激酶的喹唑 啉类小分子抑制剂，并且已描述了在T细胞淋巴瘤中它们相对于 NPM-ALK融合蛋白的活性。参见Marzecetal.，上文。
简单;也"i兌，3#养NSCLC纟田月包，然后用CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega)并4安照制造商的建i义，进 行细胞生长抑制测定。简单地说，将1000至5000个细胞接种到平 底96孔平板上并在含有10%FBS的完全培养基中生长。在24小时 以后，细胞培养基改变成含有10%FBS的100 pi完全生长培养基， 其包含各种浓度的药物，然后另外温育细胞72小时。将每种药物 浓度施加于细胞的三个孔。在温育结束时，将20 Jul的CellTiter 96 AQue。usOne溶液加入到每个孔中，并温育平板l-4小时。利用Titan Multiskan Ascent微量板读数器(Titertek Instrument)在490 nm处 读出吸光度。生长抑制可以表示为读自经治疗细胞与未治疗细胞的 吸光度百分率的平均^直土SD^直。重复测定至少三次。
这样的分析预期会证实，ALK融合蛋白(EML4-ALK(短和长 变体)、TFG-ALK)正驱动人NSCLC肿瘤(其中表达这些突变体蛋 白质)亚型的生长和存活，以及通过利用革巴向4中制剂，如WI-131 和/或WI-154,来抑制融合ALK激酶的活性可以抑制上述细胞。实施例5
ALK融合蛋白驱动转化哺乳动物细胞系的生长和存活
为了证实一种或多种ALK融合蛋白的表达可以将正常细胞转 化成癌性表型，可以用上述cDNA构建物(实施例2 )来转化3T# 细胞，其分别表达EML4-ALK (短和长变体)或TFG-ALK融合蛋白。
简单;也i兌，将细月包保持在RPMI-1640培养基(Invitrogen)中， 其含有10。/。小牛血清(FBS)(Sigma)和1.0 ng/ml IL-3(R&D Systems)。 如前所述进4于反转录病毒上清液的生产和转导。参见Schwaller " a/.: 五wZ)o / 77(7》5321-33 (1998)。用包含MSCV-Neo/EML4-ALK (或 TFG-ALK)载体的反转录病毒上清液转导3T3细胞并选择用于 G418 ( 1 mg/ml)。然后在PBS中洗涤细月包三次以后，通过平^反转导 细胞来评估转化细胞在软琼脂上生长的能力。如果需要，为了获得 剂量反应曲线，3o上所述(参见实施例3 )用相》于于ALK的siRNA 处理细胞，并用CellTiter 96 AQue。us One溶液细胞增殖测定 (Promega)来确定能生存细月包的凄t目。可以4昔助于OriginPro 6.1 寿欠4牛(OriginLab )来计算IC5o。可以通过Cleaved-Caspase-3的流式 细月包分冲斤并利用对于此輩巴特异的抗体(Cell Signaling Technology ) 来确定在48小时时的凋亡细胞百分率。这样的分析将表明， EML4-ALK融合蛋白(短或长变体)或TFG-ALK融合蛋白的表达 可以转化3T3细胞，并且当这些细胞由ALK融合蛋白驱动时证实 在软琼脂上的存活和生长，以及进一步，在转化细胞中抑制ALK 表达可导致降低的生存力和增加的凋亡。
实施例6
利用FISH测定iM全测EML4-ALK融合蛋白在人实体瘤中
的表达
如前所述，利用荧光原4立杂交(FISH)测定来检测人NSCLC 肺瘤样品中EML4-ALK融合蛋白(短变体)的存在。参见，例如，Verma ef a/. Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York, N.Y. (1988)。检查了 200个以上的石蜡包 埋人NSCLC肺瘤样品。
ALK双色、断裂重4非才罙4十获自Vysis ( Vysis， Dowers Grove， IL， USA)并按照制造商的说明加以使用，其中具有以下改进。简单地 说，再水化石蜡包埋组织切片并在0.01M柠檬酸緩冲液(pH 6.0 ) 中经受孩"皮抗原恢复11分钟。在37°C下，用蛋白酶(4mg/ml胃蛋 白酶，2000-3000U/mg)消化切片25分钟，脱水并杂交于"i更置在37°C 下的FISH揮:4十18小时。在洗涤以后，将在Vectashield去于固剂(Vector Laboratories, Burlingame, CA )中的4，，6-二脒基-2-苯基吲。呆(DAPI; mg/ml)用于4亥-t比染色。
ALK重排探针包括在野生型序列(SEQ ID NO: 6 )中在ALK 基因的断裂点(在核芬酸3171处)相反侧的两种不同标记的探针。 当被杂交时，天然ALK区将呈现为橙色/绿色融合信号，而在此基 因座处的重排(如在EML4-ALK缺失突变体中所发生的)将导致 分开的橙色和绿色信号。参见图6。
FISH分析揭示了在所研究样本总体中这种短变体EML4-ALK 突变的相对低发生率(229个样品中有一个)。然而，鉴于世界范围 内NSCLC的高发生率U又在美国每年有151，00个以上的新病例)， 预计有显著凄t量的躲藏这种突变体ALK的患者，这些患者可以获 利于ALK-抑制治疗方案。
实施例7
利用PCR测定来险测人实体瘤中的ALK融合蛋白表达
如先前描述的，还可以利用基因组或反转录酶(RT)聚合酶链 反应(PCR)来检测人实体瘤样品中一种或多种ALK融合蛋白的 存在。参见，例3口， Cools " a/.， iV: 乂 Med. 1201-1214
(2003)。简单和举例来i兌，利用标准4支术，实体瘤才羊品可以获自患 有例如NSCLC的患者。构建了相对于截短的ALK激酶或EML4-ALK融合蛋白(短或长变体)或TFG-ALK融合蛋白的PCR #笨针。RNeasy Mini Kit(Qiagen)可以用来乂人胂瘤才羊品4是取RNA 。可 以4昔助于DNeasy Tissue Kit(Qiagen)来^是取DNA。关于RT-PCR， cDNA的第一条链合成自，例如，2.5pg总RNA，其中4吏用，例如， 具有寡(dT)20的Superscript III第一条链合成系统(Invitrogen )。
然后，通过4吏用引物对，例如，EML4-202和ALK-GSP3来扩 增ALK融合基因(参见上面的实施例2)。对于基因组PCR,可以 借助于高4呆真Platinum Taq DNA聚合酶(Invitrogen )并4吏用引物 对，例如，EML4-202和ALK-GSP3进行融合基因(参见上面的实 施例2)的扩增。这样的分析将鉴定患有以截短的ALK激酶(和/ 或EML4-ALK融合蛋白或TFG-ALK融合蛋白)的表达为特征的实 体瘤的患者，该患者是利用ALK-抑制治疗剂，如WHI-131和/或 WHI154,进行治疗的4美选者。
权利要求
1. 一种分离的多核苷酸，包含核苷酸序列，所述核苷酸序列至少95％相同于选自由下述组成的组的序列(a)编码棘皮动物微管结合蛋白样4/间变性淋巴瘤激酶(EML4-ALK)融合多肽的核苷酸序列，所述融合多肽包括SEQID NO1或SEQ ID NO18的氨基酸序列；(b)编码EML4-ALK融合多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列包括SEQ ID NO2或SEQ ID NO19的核苷酸序列；(c)编码EML4-ALK融合多肽的核苷酸序列，所述融合多肽包括EML-4的N端氨基酸序列(SEQ ID NO3的残基1-233或SEQ ID NO3的残基)以及ALK的激酶结构域(SEQID NO5的残基1116-1383)；(d)包括EML-4的N端核苷酸序列(SEQ ID NO4的核苷酸1-700或SEQ ID NO4的核苷酸1-1486)以及ALK的激酶结构域核苷酸序列(SEQ ID NO6的核苷酸3348-4149)的核苷酸序列；(e)包括围绕EML4-ALK融合多核苷酸的融合接头(SEQID NO2的核苷酸700-701或SEQ ID NO19的核苷酸1486-1487)的至少6个邻接核苷酸的核苷酸序列；(f)编码包括围绕EML4-ALK融合多肽的融合接头(SEQID NO1的残基233-234或SEQ ID NO18的残基495-496)的至少6个邻接氨基酸的多肽的核苷酸序列；以及(g)互补于(a)-(f)的任何核苷酸序列的核苷酸序列。
2. —种分离的多核苷酸，其在严格杂交条件下杂交于根据权利要 求1所述的多核苷酸，其中，所述进行杂交的分离的多核苷酸 在严格杂交条件下并不杂交于具有仅由A残基或仅由T残基 构成的核苷酸序列的多核苷酸。
3. 根据权利要求2所述的分离的多核苷酸，其中，所述多核苷酸 进一步包^"可^r测才示i己。
4. 一种用于产生重组载体的方法，包括将根据权利要求1所述的 分离的核酸分子插入到载体中。
5. —种通过根据权利要求4所述的方法产生的重组载体。
6. —种用于制备重组宿主细胞的方法，包括将根据权利要求5 所述的重组载体51入到宿主细胞中。
7. —种通过根据权利要求6所述的方法产生的重组宿主细月包。
8. —种用于产生重组EML4-ALK融合多肽或截短的活性ALK 多肽的方法，所述方法包括在适合于表达所述融合多肽的条件 下培养根据权利要求7所述的重组宿主细胞以及回收所述多 肽。
9. 一种分离的多肽，包括氨基酸序列，所述氨基S拼列至少95% 相同于选自由下述组成的组的序列(a)编码包括SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 18的氨基酸 序列的EML4-ALK融合多肽的氨基酸序列；(b )编码包括EML-4的N端氨基酸序列(SEQ ID NO: 3 的残基1-233或SEQ ID NO: 3的残基l-495)和ALK的激酶结构域(SEQ ID NO: 5的残基1116-1383)的EML4-ALK融合多肽的氛基酸序列；以及(c )编码包括围绕EML4-ALK融合多肽的融合接头(SEQID NO: 1的残基233-234或SEQ ID NO: 18的残基495-496)的至少6个邻接氨基酸的多肽的氨基酸序列。
10. —种利用根据权利要求5所述的重組载体或根据权利要求7所述的重《且宿主细月包产生的重组EML4-ALK融合多肽或截4豆的活性ALK多肽。
11. 一种分离的试剂，其特异性地结合于或^r测^4居权利要求9所述的EML4-ALK融合多肽，1旦并不结合于或4企测野生型EML-4或野生型ALK。
12. 根据权利要求11所述的分离的试剂，其中，所述试剂是抗体或重同位素标记(AQUA)肽。
13. 根据权利要求11所述的分离的试剂，其中，所述试剂是聚合酶链反应(PCR)探针或荧光原位杂交(FISH)探针。
14. 才艮据权利要求12所述的重同位素标记(AQUA)肽，其中，所述肽包括野生型ALK中的EML4-ALK融合多肽或截短点的融合接头的氨基酸序列。
15. —种用于在来自哺乳动物癌症的生物冲羊品中才全测突变体ALK多核苷酸和/或其编码的突变体ALK多肽的存在的方法，所述方法包括以下步艰朵(a) 从哺乳动物癌症获得生物样品；以及(b) 利用至少一种试剂，所述试剂检测融合多核苦酸、或其编码的融合多肽，包含具有部分二级蛋白质的部分ALK，以确定在所述生物样品中是否存在ALK突变体多核苷酸和/或其编码的突变体ALK多肽。
16. 才艮据4又利要求15所述的方法，其中，所述癌症是实体瘤肉瘤或癌。
17. 根据权利要求16所述的方法，其中，所述癌是肺癌。
18. 才艮据斥又利要求17所述的方法，其中，所述肺癌是非小细月包肺癌(NSCLC)。
19. 根据权利要求15所述的方法，其中，所述突变体ALK多肽是融合多肽，所述融合多肽包括具有部分所述二级蛋白质的ALK(SEQ ID NO: 5)的残基1116-1383。
20. 根据权利要求15或16所述的方法，其中，所述二级蛋白质选自由EML-4(SEQ ID NO: 3)和TRK-融合基因(TFG)蛋白质(SEQ ID NO: 22)组成的组。
21. 才艮据权利要求20所述的方法，其中，所述融合多肽包括EML-4(SEQ ID NO: 3)的残基1-233或残基1-495或TFG(SEQID NO: 22)的残基1-138。
22. 根据权利要求15所述的方法，其中，所述融合多核香酸包括EML4-ALK融合多核苦酸(SEQ ID NOs: 2或19)或TFG-ALK融合多核芬酸(SEQ ID NO: 21)。
23. 才艮据4又利要求15所述的方法，其中，所述融合多肽包括EML4-ALK融合多肽(SEQ ID NO: 1或18)或TFG-ALK融合多肽(SEQ ID NO: 20)。
24. 根据权利要求15所述的方法，其中，所述融合多核苷酸是根据权利要求1所述的融合多核苷酸。
25. 才艮据权利要求15所述的方法，其中，所述融合多肽是才艮据权利要求9所述的融合多肽。
26. 根据权利要求15所述的方法，其中，所述试剂包括根据权利要求1所述的多核苷酸和/或根据权利要求11所述的至少一种试剂。
27. 根据权利要求15所述的方法，其中，所述试剂包括分离的试剂，所述分离的试剂特异性地结合于或检测TFG-ALK融合多肽(SEQ ID NO: 20)或TFG-ALK融合多核苷酸(SEQ ID NO:21)， {旦并不结合于或4全测野生型TFG或野生型ALK。
28. 根据权利要求27所述的方法，其中，所述试剂是抗体或重同位素标记(AQUA)肽。
29. 根据权利要求27所述的方法，其中，所述试剂是聚合酶链反应(PCR)探针或荧光原位杂交(FISH)探针。
30. 才艮据权利要求28所述的方法，其中，所述重同位素标记(AQUA)肽包括^f生型ALK中的TFG-ALK融合多肽或截短点的融合接头的氨基酸序列。
31. 才艮据权利要求15所述的方法，其中，所述方法以流式细胞术(FC)、免疫组织化学(IHC)、或免疫荧光(IF)测定形式来实施。
32. 才艮据4又利要求15所述的方法，其中，所述方法以荧光原位杂交(FISH)或聚合酶链反应(PCR)测定形式来实施。
33. 根据权利要求15所述的方法，其中，才企测所述ALK融合多肽的活性。
34. —种用于确定一种化合物是否抑制以ALK融合多肽的表达为特4正的哺乳动物实体瘤的进展的方法，所述方法包括确定所述化合物是否在所述癌症中抑制所述ALK融合多肽的表达和/或活性的步骤。
35. 根据权利要求34所述的方法，其中，所述ALK融合多肽包括ALK(SEQ ID NO: 5)的残基1116-1383和一部分所述二级蛋白质。
36. 根据权利要求34所述的方法，其中，所述二级蛋白质选自由EML-4(SEQ ID NO: 3)和TRK-融合基因(TFG)蛋白质(SEQ IDNO: 22)组成的组。
37. 冲艮据4又利要求36所述的方法，其中，所述融合多肽包括EML-4(SEQ ID NO: 3)的残基1-233或残基1-495或TFG(SEQID NO: 22)的残基1-138。
38. 根据权利要求34所述的方法，其中，利用至少一种检测根据权利要求1所述的多核苷酸的试剂、和/或至少一种根据权利要求11所述的试剂、和/或至少一种冲佥测TFG-ALK融合多核香酸或多肽的试剂，来确定所述ALK融合多肽的表达和/或活性的抑制。
39. —种用于对表达EML4-ALK融合多肽的癌症的进展进行抑制的方法，所述方法包括抑制所述EML4-ALK融合多肽在所述癌症中的表达和/或活性的步-骤。
40. —种用于对表达TFG-ALK融合多肽的实体瘤的进展进行抑制的方法，所述方法包括抑制所述TFG-ALK融合多肽在所述癌症中的表达和/或活性的步骤。
41. 根据权利要求39或40所述的方法，其中，所述癌症或所述实体瘤是肺癌。
42. 根据权利要求41所述的方法，其中，所述肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)。
43. #4居权利要求39或40所述的方法，其中，用包括WHI-131和/或WHI-154 、或它们的类似物的组合物来抑制所述EML4-ALK融合多肽或所述TFG-ALK融合多肽的表达禾口/或活性。
全文摘要
根据本发明，现已在人实体瘤，例如非小细胞肺癌(NSCLC)中鉴定了新的涉及第2号染色体的基因缺失和易位，其导致结合部分间变性淋巴瘤激酶(ALK)激酶与部分二级蛋白质的融合蛋白。二级蛋白质包括棘皮动物微管结合蛋白样4(EML-4)和TRK-融合基因(TFG)。保留ALK酪氨酸激酶活性的EML4-ALK融合蛋白被证实可以驱动以这种突变为特征的NSCLC的增殖和存活。因此，本发明部分地提供了分离的多核苷酸和载体，其编码所披露的突变体ALK激酶多肽，用于检测它的探针，分离的突变体多肽，重组多肽，以及用于检测融合和截短的多肽的试剂。所披露的这种新融合蛋白的鉴定使得可以用新方法来确定在生物样品中这些突变体ALK激酶多肽的存在，本发明还提供了对抑制蛋白质的化合物进行筛选的方法，以及对以突变体多核苷酸或多肽为特征的癌症的进展进行抑制的方法。
文档编号C07H21/02GK101466721SQ200780021431
公开日2009年6月24日 申请日期2007年4月13日 优先权日2007年4月13日
发明者建 俞, 克拉里萨·里科瓦, 劳拉·沙利文, 安东尼·波塞马托, 琼·麦克尼尔, 赫伯特·哈克, 郭爱兰, 顾挺磊 申请人:细胞信号技术公司