专利名称：一种新的人肿瘤抑制基因kiaa0157及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的人肿瘤抑制基因，还涉及组成该基因的DNA及该DNA编码的
蛋白质和在肿瘤诊断及治疗中的应用。
发明背景 肿瘤发生是环境致癌因素与宿主基因相互作用，逐渐导致并不断累积一系列基因 的异常，造成细胞增殖与死亡的动态平衡失调的结果。从正常细胞发展到危及生命的侵袭 性恶性肿瘤，大多需要经过癌前病变阶段。恶性肿瘤的发生是一个多阶段逐步演变的过程， 大致可分为激发、促进、进展和转移等几个阶段。在癌变多阶段性演变过程中，常积累了一 系列基因的突变，可涉及不同染色体上多种基因的变化，包括癌基因、抑癌基因、损伤修复 相关基因、细胞周期调控基因等。研究表明，肿瘤的发生、发展过程中涉及由于基因缺失或 突变引起的肿瘤基因的激活和肿瘤抑制基因的灭活，其中抑癌基因的失活是在大多数肿瘤 细胞中经常发生的事件.目前，对包括RB1、P53、WT1等的多个抑癌基因的认识已很深入，这 些研究不仅揭示了肿瘤发生发展的分子机制，还为肿瘤的早期诊断\分子分型\治疗药物 研发等提供了靶点.因此，这方面的研究一直是学术界的热点之一，新的抑癌基因也正不 断的得到发现和应用。 如下文所要描述的，在THAP11蛋白相互作用蛋白质的研究中，本发明者发现某些 基因的编码产物可以与THAP11蛋白质相互作用，并在分离后系统鉴定了该基因。KIAA0157 定位于10q26. 13(NM_032182.) ， mRNA全长3008bp， cDNA1248bp，编码416个氨基酸(序列
2) ，分子量为47KD的蛋白质。小鼠、大鼠与人的KIAA0157同源性高达90%以上，说明它在 进化过程中高度保守，可能发挥着重要的生物学功能。利用生物信息学分析显示，KIAA0157 蛋白内部215-266位氨基酸处存在着一个coiled coil结构域，此结构域通常存在于单体 蛋白质中，且高度保守，通常介导蛋白与蛋白之间的相互作用。在对抗凋亡蛋白BPE(BRCA 复合体亚基4)的相互作用蛋白筛选过程中，KIAA0157被筛选到。但目前对其功能，至今尚 未见任何研究报道。
发明内容
本发明从人骨髓文库中克隆到KIAA0157全长cDNA，并利用GFP-KIAA0157融合蛋 白技术检测了 KIAA0157的细胞定位，结果表明KIAA0157为全细胞分布(图2)。利用cDNA 微阵列芯片检测显示KIAA0157表达在多种组织，并在多种肿瘤组织中明显下调表达(图
3) ;此外，利用Real-time PCR检测了 12例肝癌病人中KIAA0157的表达情况，表明在10例 病人中KIAA0157在肝癌组织中表达水平明细高于癌旁组织(图4)。高表达KIAA0157可抑 制包括肝癌细胞\肺癌细胞\神经母细胞瘤细胞的生长(图5)，并导致细胞发生G0/G1期 阻滞(图6)。因此本发明专利者得出结论，该基因可能是一种新的肿瘤抑制基因。 因此，本发明提供了一种构成人基因的DNA，具有序列1所述核苷酸序列或有一个 或多个碱基缺失、取代或增加的核苷酸序列。 本发明提供了一种蛋白质，它具有序列2所示氨基酸序列或相对于所述氨基酸序
本发明提供了一种探针，它包含与组成前述核苷酸序列组成的DNA杂交的DNA。
本发明提供了一种蛋白抗体，包括多克隆抗体和单克隆抗体。用本领域熟知的方 法很容易制得针对本发明的肿瘤抑制基因编码的蛋白(多肽)或其片断和类似物的多克隆 和单克隆抗体。 一旦纯化，这些抗体可用作与本发明肿瘤抑制基因有关的疾病的实验室试 剂和诊断性试剂。所得抗体可用于制备抗体柱、免疫沉淀和用Western印迹鉴定抗原。以毫 克规模制备针对本发明KIAA0157基因所编码蛋白的单克隆抗体的通用方法如下用家兔、 马、小鼠和豚鼠作为受免疫动物，用本领域已知的免疫动物的一种方案接种抗原蛋白，然后 从收集的血清中分离IgG等(图l)。本发明的单克隆抗体也可用常规方法制得用抗原蛋 白接种小鼠进行免疫，从表现出足够抗体滴度的小鼠体内取出脾脏。分离脾细胞，使所选B 细胞与B细胞米源的骨髓瘤细胞融合形成分泌抗体的杂交瘤细胞。用亲和层析柱、离子交 换或凝胶过滤等方法从培养基中纯化获得杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体。
本发明提供了一种重组病毒载体，它包括组成前述一种核苷酸序列组成的DNA。
本发明提供了一种DNA片段，该片段可用作引物，并由前述一种核苷酸序列的部 分序列组成。 本发明提供了一种人用诊断制剂，它包括前述探针及前述蛋白质的抗体。可用于 肝癌、肺癌、结肠直肠癌、乳腺癌、白血病、肾癌、神经系统肿瘤等恶性肿瘤中基因表达的检查。 本发明还提供了含有前述蛋白的抗肿瘤药物制剂。 因此，构成本发明基因的DNA，它们的转录物mRNA及其翻译的蛋白质可用作多种
肿瘤的治疗、诊断和预防用药。 结合附图更好地说明本发明 图l KIAA0157全细胞分布。KIAA0157-GFP转染NIH3T3细胞，荧光显微镜下观察 荧光信号分布情况。结果显示KIAA0157为全细胞分布。 图2 KIAA0157抗体的制备。KIAA0157 (151-311aa)-GST载体转化 E. coliBL21 (DE3)菌株，纯化蛋白(A，B) 。 (C)KIAA0157抗血清检测KIAA0157在HEK293中 的表达。血清滴度为l : 500即可检测到目的蛋白的表达。 图3利用肿瘤组织芯片检测KIAA0157的表达。通过杂交方法检测KIAA0157在19
种癌症及相应癌旁组织及9种肿瘤细胞株的表达情况。 图4Real-time PCR检测KIAA0157在肝癌组织及癌旁组织中的表达。结果显示， 在所检测的12例病人中有10例病人的KIAA0157在肝癌组织中的表达明显低于癌旁组织。
图5KIAA0157抑制细胞增殖。PcDNA3. 1-KIAA0157或PcDNA3. 1空载体转染不同肿 瘤细胞后，12小时后接种6孔板，培养2周，检测细胞集落数。结果显示，在三种肿瘤细胞 中，KIAA0157过表达可抑制细胞增殖。 图6KIAA0157表达引起SKNSH细胞G0/G1期阻滞。KIAA0157-GFP或GFP空载体分 别转染SKNSH细胞，36小时后利用流式细胞术检测GFP表达及细胞周期。
实施例1人KIAA0157 cDNA的获得 以THAP11基因为诱饵，利用本领域通用的酵母双杂交技术研究其相互作用蛋白， 获得一段DNA序列，采用该DNA序列作BLAST检索，本发明发现与推测的人类基因KIAA0157具有较高的同源性。提出人骨髓细胞总RNA，按反转录试剂盒(Promega公司)说明书进行反 转录。取lii g定量后的RNA，加水补至10. 5iil，70。C、10min，加入2ii1的10Xbuffer、2iU 的MgCl2、2ii 1的dNTP、lii 1的oligo dT、lii 1的rRNasin、 1. 5 ii 1的AMV (15U)，反应体系共 20 ii 1 ;42。C、lh ;94。C、5min ;4。C 、5min。RNA即反转录为cDNA。以5，-CGGAATTCAATGTCCTACAG AGAGCAGGTT-3 ， ；5 ， -GGGGATCCTTAAATCTGGGAGG TCTGAGTG-3'为引物PCR扩增目的片段。PCR 条件为 Cycle 1 (lx)
94°C 5min
Cycle 2(30x)
94°C lmin
55°C 30s
72 °C lmin
Cycle 3(lx)
72°C lOmin PCR产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳，结果产生特异的DNA条带，将该DNA片段与 PMD-18-T载体(TAKARA生物公司)连接，连接产物转化E. coli JM109,菌落PCR鉴定为阳 性克隆后，再经酶切鉴定后测序。测序后的序列为序列l所示。由于DNA序列确认它的真 实性，因此，用下述方法可产生特异性杂交探针使携带质粒的大肠杆菌菌株生长，纯化质 粒DNA，用适当的限制性酶对其进行消化，电泳分离DNA片段。 生物信息学分析显示，KIAA0157蛋白质有一个coil-coil结构域，通常介导蛋白 质相互作用。同源比对显示，人与小鼠KIAA0157蛋白的同源性为93.5%，与大鼠KIAA0157 蛋白的同源性为94. 2 % 。 KIAA0157蛋白在人、小鼠和大鼠中具有如此高的同源性说明 KIAA0157基因在长期的进化过程中高度保守，提示这个基因可能具有重要的生物学功能。
实施例2KIAA0157亚细胞定位 为观察KIAAO157的亚细胞定位，我们将KIAAO157 cDNA构建到pEGFP载体的 EcoRI/Kpnl位点，组成KIAA0157-GFP融合基因表达载体。将该表达载体转染NIH3T3细胞， 激光扫描共聚焦显微镜检测显示荧光信号分布为全细胞(
图1)。
实施例3KIAA0157蛋白的原核表达、纯化以及多克隆抗血清的制备
以KIAA0157-Flag质粒为模板，以5' -CGGAATTCCCAAGGAACAAGAAAGAAGATT-3'; 5' -CCGCTCGAGTTAAATCTGGGAGG TCTGAGT-3'为弓|物，利用PCR技术扩增KIAAO 157的 C端161个氨基酸。PCR产物与PGEX-4T-2载体经EcoRI 、 Xhol 1双酶切后连接，转化 E.coliBL21(DE3)感受态菌株，挑取单克隆，经酶切鉴定后，序列分析正确。将转化有 GST-KIAA0157质粒的E. coliBL21 (DE3)接种LB培养基，37。C培养至OD :0. 6 1. 0，加ImM 的IPTG、3(TC诱导4h，离心收集细菌，SDS-PAGE检测EDAG蛋白表达情况。经B-PER GST Spin Purification Kit纯化获得较纯的GST-KIAA0157融合蛋白。用纯化的GST-KIAA0157 融合蛋白免疫New Zealand大耳白，经过几次加强免疫后，取兔血清，Western blot检测 KIAA0157抗血清的效果，见图2，抗血清在1 : 500稀释时，可以检测到转染KIAA0157-Myc 质粒的HEK29细胞中的目标蛋白。 实施例4KIAA0157在多种癌及相应癌旁组织的表达有明显差异
以5'-CGGAATTCAATGTCCTACAGAGAGCAGGTT-3 ，；5 ，-GGGGATCCTTAAATCTGGGAGGTCTGA GTG-3'为引物，采用PCR技术扩增cDNA片断作为探针模板，a -32p标记后与CancerProf i 1 ing ArrayII杂交，检测它在19种癌及相应癌旁组织以及9种肿瘤细胞系的表达情况。所检测 的154对cDNA来自于154个病人的癌及相应癌旁组织。杂交结果显示，KIAA0157在多种 组织中均有表达，且在不同的肿瘤组织中表达情况差异很大(图3)。在甲状腺(8/10)、肝 (3/3)、皮肤(6/10)、乳房(2/10)、直肠(3/10)、睾丸(5/10)等癌组织中，KIAA0157表达显 著低于相应的癌旁组织；而在胃组织(7/10)、卵巢组织(6/10)、前列腺组织(3/4)当中则 相反，KIAA0157表达水平明显增多。以上结果表明KIAA0157表达没有组织特异性，它的功 能发挥可能与其组织分布不同有关。此外，在膜的右下方，排列了 9种肿瘤细胞系的cDNA， KIAA0157表达于所有9种肿瘤细胞系中，其中HL60、 A549、ML0T4、 SW480和Raji细胞系中 表达水平很高，而在其它肿瘤细胞系的杂交信号相对较弱。 我们进一步检测了肝癌病人中KIAA0157的表达水平。通过常规方法提 取来自12例肝癌病人的肝癌及癌旁组织总RNA。经反转录获得第一链cDNA。以 5 ' -AGGAAATACTAGCCAGCAAGAG-3 ， ； 5 ' -AAGATTCAACAACTCGCTCACT-3'为引物，利用SYBRgreen 试剂，进行Real-time PCR。 PCR条件
Cycle 1 Step 1 : Cycle 2 Step 1 : St印2 : Cycle 3 Step 1 : Cycle 4 Step 1 : Cycle 5 Step 1 :
(IX)
(40X)
(IX)
(IX)
(8IX)
95. 0°C
95. 0°C 65. 0°C
95. 0°C
55. 0°C
for 01:00.
for 00:10. for 00:30.
for 01:00.
for 01:00.
55. 0°C -95. 0°C for 00:10.
使用IQ 5 Multicolor Real-time PCR Detection System对报告荧光染料所发 射的荧光进行实时监测。荧光发射量反映循环数并由序列检测仪的软件读出，给出对PCR 扩增有意义的循环数阈值，循环数的值与基因组DNA对数呈线性关系。结果显示(图4)，12 例肝癌病人中有10例病人的肝癌组织中KIAA0157表达明显低于癌旁组织，表明KIAA0157 在肝癌发生中表达下调。 实施例5KIAA0157过表达抑制细胞集落形成 为了研究KIAA0157是否对细胞增殖有影响，我们构建了 KIAA0157-myc/hisB+真 核表达载体，并采用集落形成实验检测了 KIAA0157在SKNSH细胞中过表达后其增殖的变化 情况。如图5所示，转染KIAA0157-myC/hisB+的SKNSH细胞相对于转空载体的细胞，其集 落形成的能力被明显抑制。在肝癌细胞H印G2细胞及乳腺癌细胞MCF-7细胞中也得到相同 的结果。 实施例6KIAA0157表达引起SKNSH细胞G0/G1期阻滞 为了解KIAA0157对SKNSH细胞周期的影响，我们在SKNSH细胞转染了带GFP标签
6的KIAA0157的真核表达载体，流式细胞仪检测细胞周期各时相的分布。与转染GFP空载体 相比，转染KIAA0157真核表达载体后SKNSH细胞出现明显的G0/G1期阻滞(图6)。
序列表 〈110〉中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 〈120〉 一种新的人肿瘤抑制基因KIAA0157及其应用 〈160>2 〈210>1 〈211>1248 〈212>DNA 〈213〉人禾中(Homo S即iens.)
〈400〉 1atggcggcgtccatttcgggctacaccttcagtgctgtgtgtttccacagcgccaacagc60■cgcggacctttactgggagaggteagacgtttagcatc120agtgactcaccacagaatttttgaaatccataaccatcag180ccttgttcaaaactttttagtttttatgacgg卿gtttg240gacaggattcgtcattgggtccggcgcaat3003CgC3gC3gCagatgtcctaC3g3g3gC3ggttcttcacaagcagctcacccgcatcctc360ggcgtgcccgacctcgtctttcttctcttcagcttcatctccactgccaacaattccact420cacgctttagaatatgtgctcttcagaccaateatcagaggatatcactc480gctattcccatectagccagc^gagtecaaagtgtcttc540acttctcagagttatgccaactgacttttttgac^ggat600ggagtgatgaggcgatttatcaggtttataatgcacttca660c郷cagtgtgtgc卿tgtgagcgagttgttgaatcttgtcaggcag^720teag^gacaaatcactcag■■gg^ca780ttgcagc鄉ccgtctgaaagcttggacccagcgttcagt840cctcggatgccgtcctctgggtttgcagctg^ggcag^gtacacttgg■gcctcggatcctcctcccccttactctgattttcacccaaac^tc^gaaagtectttg960agccactctcgcatgg^aggagtgtctttatgcctcgacctcaagctgtgggctcttcc1020aattatgcttccaccagtgcCgg3Ctg33gtatcctggaagtggggctgaccttcctcct1080 cccc朋3gag C3gctggag3 cagtggtgag gattcagacg acagtgatte tg朋朋tttg 1140 attgacccte cagagccttc teategtgaa tectcacatt caaaggattc tcgacccatg 1200 gcacatcccg acgaggaccc caggaacact cagacctccc agatttea 1248 〈210>2 〈211>416 〈212>PRT 〈213〉人禾中(Homo S即iens.) 〈400>2 Met Ala Ala Ser lie Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ala Val Cys Phe His 16 Ser Ala Asn Ser Asn Ala Asp His Glu Gly Phe Leu Leu Gly Glu Val 32
ArgGinGluGluThrPheSerlieSer AspSerGinlieSerAsnThr48GluPheLeuGinVallieGlulie His Asn His Gin Pro Cys Ser Lys64LeuPheSerPheTyrAspTyr Ala Ser Lys Val Asn Glu Glu Ser Leu80AspArglieLeuLysAspArgArgLys Lys Vallie Gly Trp Tyr Arg96PheArgArgAsnThrGinGinGinMetSerTyrArgGluGinValLeu112HisLysGinLeuThrArglieLeuGlyValProAspLeuValPheLeu128LeuPheSerPhelieSerThrAlaAsnAsnSerThrHisAlaLeuGlu144TyrValLeuPheArgProAsnArgArgTyrAsnGinArglieSerLeu160AlalieProAsnLeuGlyAsnThrSerGinGinGluTyrLysValSer176SerValProAsnThrSerGinSerTyrAlaLysVallieLysGluHis192GlyThrAspPhePheAspLysAspGlyValMetLysAsplieArgAla208lieTyrGinValTyrAsnAlaLeuGinGluLysValGinAlaValCys224AlaAspValGluLysSerGluArgValValGluSerCysGinAlaGlu240ValAsnLysLeuArgArgGinlieThrGinArgLysAsnGluLysGlu256GinGluArgArgLeuGinGinAlaValLeuSerArgGinMetProSer272GluSerLeuAspProAlaPheSerProArgMetProSerSerGlyPhe288AlaAlaGluGlyArgSerThrLeuGlyAspAlaGluAlaSerAspPro304ProProProTyrSerAspPheHisProAsnAsnGinGluSerThrLeu320SerHisSerArgMetGluArgSerValPheMetProArgProGinAla336ValGlySerSerAsnTyrAlaSerThrSerAlaGlyLeuLysTyrPro352GlySerGlyAlaAspLeuProProProGinArgAlaAlaGlyAspSer368GlyGluAspSerAspAspSerAspTyrGluAsnLeulieAspProThr384GluProSerAsnSerGluTyrSerHisSerLysAspSerArgProMet400AlaHisProAspGluAspProArgAsnThrGinThrSerGinlie41权利要求
一种构成人基因的DNA，具有序列1所示核苷酸序列或相对于所述核苷酸序列有一个或多个碱基缺失、取代或增加的核苷酸序列。
2. —种蛋白质，它具有序列2所示氨基酸序列或相对于所述氨基酸序列有一个或多个 氨基酸缺失、替代或增加的氨基酸序列。
3. —种探针，它包含于权利要求1所述的核苷酸序列组成的DNA杂交的DNA。
4. 一种重组病毒载体，它包括由权利要求1所述的核苷酸序列组成的DNA。
5. —种用作引物的DNA片段，由权利要求1所述的核苷酸序列的部分序列组成。
6. —种人用诊断制剂，它包括权利要求3所述探针。
7. 权利要求6所述的诊断制剂在肝癌、肺癌、结肠直肠癌、乳腺癌、白血病、肾癌、神经 系统肿瘤等恶性肿瘤中基因表达检查的应用。
8. —种抗肿瘤药物制剂，它含有权利要求2之一所述的蛋白质。
9. 一种能与权利要求2所述蛋白质特异性结合的多克隆和单克隆抗体。
10. —种诊断性药物制剂，它含有权利要求9所述的抗体用来检测肿瘤基因的表达。
全文摘要
本发明提供了一种新的人肿瘤抑制基因及其编码蛋白。该基因和编码蛋白可抑制肿瘤细胞生长，并在多种肿瘤组织中表达下调，与肿瘤的发生有密切关系。该基因及其编码蛋白质和它们的衍生物可以被多种肿瘤的诊断、治疗和药物筛选。
文档编号A61P35/00GK101712958SQ20081016719
公开日2010年5月26日 申请日期2008年10月8日 优先权日2008年10月8日
发明者李长燕, 杨晓明, 胡德庆, 詹轶群, 许望翔 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所