新的肿瘤抑制基因或蛋白及其应用的制作方法

专利名称：：新的肿瘤抑制基因或蛋白及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种新的肿瘤抑制基因或蛋白及其应用，具体地涉及CMTM8或其可变剪切体CMTM8-v2的基因或蛋白或它们的免疫性片段及其应用。
背景技术：
：众所周知，凋亡在所有动物的发育和稳态中起十分重要的作用，决定一个细胞是否处于凋亡状态的主要标志包括典型的细胞形态的改变以及一些生化和分子标志的改变。就形态而言，凋亡细胞变圆、皱縮、脱落，染色体凝集并分布于核边缘。凋亡发生的主要生化标志有线粒体失去跨膜电位，质膜磷脂酰丝氨酸外翻，胱冬酶(caspase)的活化，蛋白质如IAPs和聚ADP核糖聚合酶(PARP，Poly(ADP-ribose)polymerase)的酶切，基因组DNA的片断化和线粒体质量以及f-肌动蛋白成分的改变等。在哺乳类动物中，胱冬酶是一组与细胞凋亡有关的蛋白酶。胱冬酶激活的一个主要途径是细胞色素c从线粒体的释放，胞浆中的细胞色素c可与Apaf-l形成复合物，此复合物可识别并酶切胱冬酶原-9，活化后的胱冬酶-9酶切并激活胱冬酶-3，从而引起细胞进行一系列凋亡的形态改变。癌症对人类健康和生命的威胁很大，是全世界造成死亡的重要原因。对肿瘤的治疗和诊断，成为现代医学需要解决的重要课题。细胞凋亡异常是肿瘤发生、发展的重要因素，因此通过诱导肿瘤细胞凋亡来清除肿瘤已成为当前肿瘤治疗的一个新的重要策略。在许多表皮的恶性肿瘤细胞中，表皮生长因子受体(EGFR)都是高表达、失调或突变的，EGFR介导信号通路的激活对于肿瘤的生长是非常重要的。
发明内容本发明的一个目的是提供CMTM8或其可变剪切体CMTM8-v2的蛋白或由它们衍生的蛋白或它们的免疫性片段。本发明的另一目的是提供编码以下蛋白或它们的免疫性片段的多核苷酸序列CMTM8或其可变剪切体CMTM8-v2的蛋白或由它们衍生的蛋白。本发明的另一目的是提供CMTM8或其可变剪切体CMTM8-v2的基因或蛋白或它们的免疫性片段在诱导细胞凋亡中的应用。本发明的另一目的是提供CMTM8或其可变剪切体CMTM8-v2的基因或蛋白或它们的免疫性片段在制备治疗和/或抑制肿瘤的药物中的应用。本发明的另一目的是提供一种包含CMTM8或其可变剪切体CMTM8-v2的载体。本发明的另一目的是提供一种用于治疗和/或抑制肿瘤的药物组合物。本发明的另一目的是提供检测CMTM8或其可变剪切体CMTM8-v2的基因和蛋白或它们的免疫性片段的表达的试剂的应用。本发明提供了如下(a)、(b)、(c)或(d)所示的蛋白或其免疫性片段(a)由SEQIDNO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白；(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且与(a)具有相同功能的由(a)衍生的蛋白；(c)由SEQIDNO:4所示的氨基酸序列组成的蛋白；或(d)在(c)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且与(c)具有相同功能的由(c)衍生的蛋白。本发明还提供了编码所述的蛋白或其免疫性片段的多核苷酸序列；所述的多核苷酸序列优选为SEQIDNO:1所示的多核苷酸序列、SEQIDNO:1的核苷酸295813所示的多核苷酸序列或SEQIDNO:3的核苷酸1345所示的多核苷酸序列；所述免疫性片段优选为SEQIDNO:2的氨基酸157173所示的序列、SEQIDNO:2的氨基酸121所示的序列、SEQIDNO:2的氨基酸2242所示的序列或SEQIDNO:2的氨基酸127143所示的序列。本发明还提供了所述的蛋白或其免疫性片段或所述的多核苷酸序列在诱导细胞凋亡中的应用；所述细胞凋亡尤其是肿瘤细胞凋亡；所述的肿瘤细胞凋亡优选为通过降低Bad第112位丝氨酸磷酸化程度而导致的肿瘤细胞凋亡。本发明还提供了所述的蛋白或其免疫性片段或所述的多核苷酸序列在制备治疗和/或抑制肿瘤的药物中的应用；所述的肿瘤优选为表皮生长因子受体高表达的肿瘤；所述的表皮生长因子受体高表达的肿瘤优选为前列腺癌、前列腺增生、宫颈癌或肝癌。本发明还提供了一种载体，其包含所述的多核苷酸序列；所述的载体优选为质粒或病毒；所述的病毒优选为腺病毒。本发明还提供了一种用于治疗和/或抑制肿瘤的药物组合物，该药物组合物含有所述的蛋白或其免疫片段或所述的多核苷酸序列或所述的载体，和一种或多种药用赋形剂或药用载体。本发明还提供了检测所述的蛋白或其免疫性片段或所述的多核苷酸序列的表达的试剂在制备用于检测肿瘤的组合物中的应用。图1A显示CMTM8的PCR产物。图IB显示CMTM8和其可变剪切体CMTM8-v2在人血细胞文库的PCR扩增结果，其中泳道3为DNA标准(100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp);泳道l、2、49分别为活化的〔019+B细胞、静息的CD19+B细胞、活化的CD14+单核细胞、静息的CD14+单核细胞、活化的CD8+T细胞、静息的008+T细胞、活化的CD4+T细胞和静息的CD4+T细胞cDNA的CMTM8和其可变剪切体CMTM8-v2的PCR产物，可以看到两个条带(较大的522bp和较小的348bp)。图2A图2D显示瞬时转染CMTM8或其可变剪切体CMTM8-v2诱导了细胞的凋亡。图2A显示CMTM8转染所引起的细胞形态学的改变；图2B显示ArmexinV单阳性细胞的比率和AnnexinV/PI双阳性细胞的比率；图2C显示瞬时转染CMTM8-v2或CMTM8诱导了细胞的凋亡用对照质粒、CMTM8-v2的表达质粒或CMTM8的表达质粒转染HeLa细胞，转染后48小时采集图像，并用DAPI染细胞核，荧光显微镜观察，可见CMTM8-v2或CMTM8转染引起细胞形态学改变；图2D显示收获转染后的细胞，用AnnexinV/PI染色，如图所示为AnnexinV单阳性细胞的比率和ArmexinV/PI双阳性细胞的比率。图3显示CMTM8或其可变剪切体CMTM8-v2的瞬时转染诱导了细胞色素c的释放和胱冬酶的激活。细胞转染后60小时，Western印迹分析胞浆的细胞色素c、胱冬酶原-9、胱冬酶原-3和PARP的酶切割片段。用e-肌动蛋白作为蛋白上样量的对照。图4显示感染后24、48、72和96小时用荧光显微镜观察的细胞形态变化。图5A图5D显示CMTM8瞬时转染细胞会导致Bad-S112磷酸化程度的降低，瞬时转染CMTM8所诱导的细胞凋亡可被siBad所抑制。其中，图5A显示siCMTM8对内源性CMTM8的抑制效果；图5B显示用Western印迹分析的Bad-pS112和总的Bad的水平；图5C显示用Western印迹观察的siBad对内源性Bad的干扰作用；图5D显示AnnexinV单阳性细胞的比率和AnnexinV/PI双阳性细胞的比率。图6显示用Western印迹检测的内源性CMTM8表达情况。图7显示CMTM8或CMTM8-v2对细胞增殖的影响。用质粒pCDB、pCDB-CMTM8或pCDB-v2转染服K293或PC3细胞。其中，图片(A)和(B)分别显示用MTT观察HEK293和PC3细胞的增殖状况；图片(C)显示用克隆形成实验来观察CMTM8或CMTM8-v2对细胞增殖能力的长期影响。图8显示CMTM8或CMTM8-v2(图中简写为v2)对EGF刺激产生信号的影响。用pCDB、pCDB-CMTM8-v2、pCDB-CMTM8转染HeLa细胞，转染后24小时，撤血清20小时后，用EGF因子刺激并进行Westernblot分析pERK1/2、ERK1/2和P-actin的表达量。图9A和图9B显示Westernblot检测可见CMTM8转染细胞的培养上清中的CMTM8蛋白分泌表达情况。图10A和图10B显示免疫组织化学检测CMTM8或其可变剪切体CMTM8-v2在前列腺增生组织中的表达；其中图10A显示抗兔IgG对照；图10B显示抗CMTM8或其可变剪切体CMTM8-v2兔多抗。具体实施方式根据本发明的一个方面，本发明提供如下(a)、(b)、(c)或(d)所示的蛋白或其免疫性片段(a)由SEQIDNO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白；(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且与(a)具有相同功能的由(a)衍生的蛋白；(c)由SEQIDNO:4所示的氨基酸序列组成的蛋白；或(d)在(c)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且与(c)具有相同功能的由(0衍生的蛋白。如SEQIDNO:2所述的氨基酸序列为本发明的CMTM8蛋白序列，共173个氨基酸。CMTM8基因为编码本发明的SEQIDNO:2的多核苷酸序列，其可以为SEQIDNO:2所示氨基酸的编码序列，除了上述氨基酸序列的编码序列之外，还可以包括非编码序列，例如内含子、编码序列5'或3'端的非编码序列等。所述多核苷酸序列可以是DNA或RNA，其中DNA包括cDNA、基因组DNA以及合成的DNA。其中优选的基因为SEQIDNO:1所示的多核苷酸序列，该序列全长1185个核苷酸，其包含编码CMTM8蛋白的序列(例如编码序列(CDS:核苷酸295813)和5'非编码区(核苷酸1294)及3，非编码区(核苷酸8141185)。或者，更优选一种分离的核苷酸序列，其只包含CMTM8蛋白的编码序列，例如SEQIDNO:1所示的编码序列核苷酸295813。CM頂8-v2蛋白为如SEQIDN0:4所述的氨基酸序列，其编码115个氨基酸。CMTM8-v2为CMTM8的可变剪切体，其中剪切掉了第二个外显子，即CMTM8-v2(SEQIDNO:4)缺少CMTM8(SEQIDNO:2)的氨基酸残基50107。所述CMTM8-v2编码基因优选为SEQIDNO:4所示氨基酸的编码序列，例如本发明SEQIDNO:3所示的多核苷酸序列，其相当于SEQIDNO:1的核苷酸295441加616813，即缺少SEQIDNO:1的编码序列(CDS:核苷酸295813)中的核苷酸442615。本领域普通技术人员已知，本发明CMTM8的核苷酸序列可以完全相同于如SEQIDNO:l所示的编码序列，CMTM8-v2的核苷酸序列可以完全相同于如SEQIDN0:3所示的编码序列，也可以由于遗传密码的简并性，不完全等同于上述核苷酸的编码序列。例如，根据每个具体的原核宿主或者真核宿主所使用的密码子的频率不同，可以选择相应的密码子，从而提高所述的多核苷酸在相应的宿主中表达效率。也可以为了获得比天然的核苷酸序列具有更好性能的多核苷酸(如更长的半衰期)而转换密码子。本发明的CMTM8基因或蛋白的免疫性片段包括本发明的CMTM8蛋白的免疫性片段或本发明的CMTM8基因的免疫性片段。本发明的CMTM8蛋白的免疫性片段可以为CMTM8蛋白的任何具有免疫原性的片段，例如SEQIDNO:2的氨基酸157173所示的序列、SEQIDNO:2的氨基酸121所示的序列、SEQIDNO:2的氨基酸2242所示的序列或SEQIDNO:2的氨基酸127143所示的序列。本发明的CMTM8基因的免疫性片段可以为编码所述CMTM8蛋白的免疫性片段的核苷酸序列。本发明的CMTM8或其可变剪切体CMTM8-v2的多核苷酸序列或其免疫性片段可以依据标准的PCR扩增技术将cDNA、mRNA或者基因组DNA作为模板，并选取合适的寡核苷酸引物扩增得到。这样得到核苷酸可以克隆进合适的载体中，然后利用在所述载体中的复制得到。也可以通过标准DNA合成技术得到，例如，使用可以按本领域熟知的固相亚磷酸酰胺三酯法在DNA合成仪上合成。本发明的CMTM8或其可变剪切体CMTM8-v2的蛋白或其免疫性片段可以通过常规方法获得，例如通过用CMTM8或其可变剪切体CMTM8-v2的基因或其免疫性片段转化宿主细胞并在被转化的宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用适当的方法(如温度变动或化学特质诱导)诱导启动子，然后继续培养。培养完成后，可用离心法收集细胞，并用任何已知的方法，如冻融法、超声处理法、溶菌酶溶解法或机械破碎法破碎细胞。可以用各种已知的方法从宿主细胞培养物中回收和纯化本发明的CMTM8或其可变剪切体CMTM8-v2的蛋白或其免疫性片段，这些方法包括硫酸铵或乙醇沉淀法、酸萃取法、超滤法、离子交换层析法、磷酸纤维层析法、疏水相互作用层析法、凝胶过滤法、亲和层析法及高压液柱层析法。根据本发明的一个方面，提供了CMTM8或其可变剪切体CMTM8-v2的基因或蛋白或它们的免疫性片段在诱导细胞凋亡中的应用。细胞凋亡又称程序性细胞死亡，是一种在特定时空主动发生的、受基因严密调控的细胞逐渐死亡的现象。细胞凋亡在肿瘤发生、肿瘤治疗、胚胎发育、免疫反应、神经系统发育、组织代谢过程中有重要的作用。由于本发明的CMTM8或其可变剪切体CMTM8-v2的基因或蛋白或它们的免疫性片段能够诱导细胞凋亡，所以本发明的CMTM8或其可变剪切体CMTM8-v2的基因或蛋白或它们的免疫性片段可以广泛用于清除衰老、受损或病变的细胞，尤其可以用于诱导肿瘤细胞。本发明的CMTM8或其可变剪切体CMTM8-v2的基因或蛋白或它们的免疫性片段也可以在体外实验中用于诱导细胞凋亡，尤其是肿瘤细胞的凋亡。细胞凋亡异常是肿瘤发生、发展的重要因素，因此通过诱导肿瘤细胞凋亡来清除肿瘤己成为当前肿瘤治疗的一个新的重要策略。在本发明的一个实施例中，证明了本发明的CMTM8或其可变剪切体CMTM8-v2在肿瘤细胞中的表达能够诱导肿瘤细胞的凋亡，从而本发明的CMTM8或其可变剪切体CMTM8-v2或其免疫性片段可用于治疗和/或抑制肿瘤。Bel-2家族的成员之一Bad可以与Bel-2或Bel-xL在线粒体的外膜形成二聚体，从而抑制它们抗凋亡的活性，促进细胞走向死亡。特定位点丝氨酸残基的磷酸化可调节Bad的活性，例如EGF可刺激Bad第112位的丝氨酸磷酸化，磷酸化的Bad与Bel-xL解偶联，而与胞浆中的14-3-3蛋白质结合。在本发明的一个实施例中，CMTM8瞬时转染细胞会导致Bad-S112磷酸化程度的降低，瞬时转染CMTM8所诱导的细胞凋亡可被siBad所抑制。因此，本发明的CMTM8基因或蛋白或它们的免疫性片段可通过降低Bad第112位丝氨酸磷酸化程度而导致细胞凋亡。根据本发明的另一方面，本发明提供CMTM8或其可变剪切体CMTM8-v2的基因或蛋白或它们的免疫性片段在制备治疗和/或抑制肿瘤的药物中的应用。本发明的CMTM8或其可变剪切体CMTM8-v2的基因或蛋白或它们的免疫性片段在肿瘤细胞的表达可以抑制肿瘤细胞生长、诱导肿瘤细胞的凋亡，而且CMTM8在肝癌组织中的表达水平显著低于正常肝组织。因此，本发明的CMTM8基因为新的肿瘤抑制基因。从而，本发明的CMTM8基因或蛋白或它们的免疫性片段可用于制备治疗和/或抑制肿瘤的药物。本发明的CMTM8或其可变剪切体CMTM8-v2的基因和蛋白可以以基因和蛋白的形式直接包含在用于治疗和/或抑制肿瘤的药物中利用其瞬时表达产物进行治疗，也可以以包含在表达载体中的形式包含在用于治疗和/或抑制肿瘤的药物中利用瞬时和稳定的表达产物进行治疗。根据本发明的另一方面，本发明提供一种含有本发明的多核苷酸序列的载体。适当的载体通常为基因工程载体，其可以为染色体、非染色体来源的或合成的DNA序列，例如细菌质粒、噬菌体DNA、酵母质粒、病毒(如痘苗病毒、腺病毒)以及病毒DNA，条件是这些载体能够在所选择的宿主细胞中复制并存活。插入到表达载体中的DNA序列与适当的表达控制序列如启动子可操作地连接，以指导mRNA的合成。这样的启动子的例子包括RSV、HIV、CMV或SV40启动子，大肠杆菌lac或trp启动子、噬菌体入PL启动子及在原核或真核细胞或其病毒中控制基因表达的其他启动子。此外，表达载体可含有启动翻译的核糖体结合位点及转录终止子，还可以包括用于扩增表达的合适序列。必要时，为了提高编码本发明CMTM8或其可变剪切体CMTM8-v2的DNA在高等真核细胞中的转录效率，可在载体中插入增强子序列。简单起见，可以将本发明的CMTM8或其可变剪切体CMTM8-v2的基因导入市售载体中，这样的市售载体包括pGEM(Promega)和pKK223-3(Pharmacia)、pMT-hIL-3(马大龙、狄春辉、庞健等(1991)高技术通讯11:2629)、pQE-9(Qiagen)、pD10、pNH18A(Stratagene)、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia),以及pcDNA3、pCI、pWLNEO、pSG(Stratagene)、pSVL(Pharmacia)。在本发明的一个实施例中(参见实施例l)，将CMTM8或其可变剪切体CMTM8-v2多核苷酸序列的PCR产物克隆至pGEM-TEasy载体中(Promega)。优选将本发明的CMTM8或其可变剪切体CMTM8-v2序列或其免疫性片段或含有CMTM8或其可变剪切体CMTM8-v2序列或其免疫性片段的载体通过转导、转化或转染的方法直接施用于患有肿瘤的动物体的肿瘤部位，从而达到治疗或抑制肿瘤的目的。转导、转化或转染的方法包括本领域已知的病毒感染(尤其是腺病毒介导的转染法和痘苗病毒介导的转染法)、氯化钙转染法、脂质体转染法、电穿孔法或微粒轰击法等。目前构建的腺病毒载体主要有3类，即腺病毒E3区缺失表达载体(非缺陷型载体)、腺病毒E,区缺失表达载体(缺陷型载体)和腺病毒沉默区表达载体。利用同源重组技术，腺病毒所携带的外源基因长度可达7.5kb，能感染处于不同周期的细胞，且不整合于宿主细胞基因组中，其安全性较高。痘苗病毒作为载体有如下特点插入外源基因容量大，可以表达2540kb的DNA，并能同时表达多种外源基因；病毒宿主范围广；病毒在胞浆中繁殖，不与宿主细胞的染色体整合，无致癌性；表达的产物可以糖基化，能保持外源基因产物的生物学和理化性质。表皮生长因子受体在多种肿瘤如肝癌、结直肠癌、乳腺癌、胰腺癌、宫颈癌、前列腺癌和非小细胞肺癌等中都有过表达。由于本发明通过体外实验证实，CMTM8或其可变剪切体CMTM8-v2能够降低EGFR介导的信号通路下游分子ERK的磷酸化程度，CMTM8能够降低EGFR介导的信号通路下游分子Bad第112位丝氨酸的磷酸化程度，从而抑制肿瘤细胞生长、诱导了肿瘤细胞的凋亡，所以CMTM8或其可变剪切体CMTM8-v2特别适用于治疗和抑制表皮生长因子受体高表达的肿瘤，尤其是前列腺癌、前列腺增生、宫颈癌或肝癌。而且本发明还证明CMTM8在肝癌组织中的表达水平显著低于正常肝组织。本发明还提供一种用于治疗和/或抑制肿瘤的药物组合物，该药物组合物含有CMTM8或其可变剪切体CMTM8-v2的基因或蛋白或它们的免疫性片段，和一种或多种药用赋形剂或药用载体。药用赋形剂或药用载体指无毒固态、半固态或液态填充剂、稀释剂、包囊材料或其他制剂辅料。所述药物组合物适于胃肠外、舌下、脑池内、阴道内、腹膜内、直肠内、颊内、肿瘤内或表皮给药。胃肠外给药包括静脉内、肌内、腹膜内、胸骨内、皮下、关节内注射和输注。适于胃肠外给药的药物组合物包括无菌水溶液或非水溶液、分散液、悬浮液或乳液，以及用于在临使用前在无菌可注射溶液或分散液中配制的粉末。适宜的水性或非水性载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇、羧甲基纤维素、植物油和可注射的有机酯如油酸乙酯。这些组合物还可以含有防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂等辅剂。加入等渗剂如糖类、氯化钠等可能是有利的。表皮给药包括在皮肤、黏膜上、以及在肺和眼的表面给药。这样的药物组合物包括粉剂、软膏、滴剂、透皮贴剂、离子电渗疗法装置以及吸入剂等。直肠或阴道给药的组合物优选为栓剂，它可以通过将本发明的CMTM8或其可变剪切体CMTM8-v2序列或其免疫性片段或含有CMTM8或其可变剪切体CMTM8-v2多核苷酸序列或其免疫性片段的载体与适宜的非刺激性药用赋形剂或药用载体如可可脂、聚乙二醇或栓剂蜡混合制备，所述药用赋形剂或药用载体在室温为固态，在体温下为液态，因此在直肠或阴道腔内熔化并释放出活性化合物。当以上述或其他方式进行治疗时，治疗有效量的本发明的CMTM8或其可变剪切体CMTM8-v2可以是本发明CMTM8或其可变剪切体CMTM8-v2的基因或蛋白或它们的免疫片段的纯净形式、药用盐形式，或选择性与药用赋形剂组合。对任何特定患者的具体治疗有效剂量取决于许多因素，包括所治疗的疾病和其严重程度；所用具体化合物的活性；所用的特定组合物；患者的年龄、体重、性别、饮食和一般健康状况；给药时间；给药途径；具体化合物的排泄速度；治疗的持续时间联合或同时服用的其他药物等。本发明还提供检测CMTM8或其可变剪切体CMTM8-v2的基因或蛋白或它们的免疫片段的表达的试剂在制备用于检测肿瘤的组合物中的应用。所述试剂可以为蛋白、核酸、碳水化合物等，优选为抗体、反义RNA或小干扰RNA(siRNA)。本发明的CMTM8或其可变剪切体CMTM8-v2的基因或蛋白或它们的免疫片段可以作为诊断指标。因此，可以利用限制性片段长度多态性分析(RFLP)、反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、荧光原位杂交法(FISH)等方法或它们的组合，检测体内因本发明的CMTM8或其可变剪切体CMTM8-v2表达不足或过量所致的病理状态。同样，也可以使用本发明CMTM8或其可变剪切体CMTM8-v2蛋白的抗体，通过放射性免疫分析、竞争性结合法、Western印迹分析法或酶联免疫吸附法(ELISA)达到相同的目的。实施例下面结合具体实施例进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例lCMTM8基因的克隆利用CKLF2蛋白质序列(参见国际申请PCT/CH00/00026)对蛋白质数据库(NCBI的blastp)和人的表达序列标签(ExpressionSequenceTag,简称EST)进行数据检索和同源性比较，发现一组EST序列(AL528672,AL570224,AL528671,AL543749,BG761693,BE740519,BG761693,BE740519,BG477819,BG340845,BG282018,BG478235,BI459684)，通过ESTAssemblymachine(网址为http:〃爾，tigem.it)进行EST拼接，形成重叠群(contig)再次进行BLAST拼接，找到完整的读码框架；根据EST拼接得到的CMTM8全长cDNA序列设计引物(上游引物ACGATGGAGGAGCCGC，SEQIDNO:5;下游引物TCACTGTATGGTCCTGGATCTC,SEQIDNO:6)，根据EST来源不同和Unigene分析结果，选择高表达该基因的单链扁桃体cDNA文库(购自Clontech)，进行PCR扩增(94°C，5分钟；94°C，20秒，58°C，20秒，72°C，30秒，35循环；72°C，7分钟)。纯化PCR产物(纯化结果见图1A)，克隆至pGEM-TEasy载体中(Promega)，连接产物转化XL-1Blue菌，用蓝白斑筛选阳性克隆。测序质粒用Tip-20Mini-pr印aration试剂盒(Qiagen)进行纯化，3100测序仪进行DNA序列分析，证明EST拼接正确。实施例2CMTM8-v2基因的克隆用CMTM8的引物(上游引物序列为5，〉GAATTCAGATGGAGGAGCC〈3，(SEQIDNO:7)，下游引物序列为5，〉GGATCCTCACTGTATGGTC〈3，(SEQIDNO:8))扩增血液系统文库，PCR产物跑1%的琼脂糖电泳，电泳结果(见图1B)发现除全长CMTM8(522bp)产物外，还有一条较小的条带，将这条小带酶切回收后，与pzeroT载体进行T-A克隆，PCR扩增(仍用CMTM8的引物)鉴定插入目的片段的克隆，经测序验证的克隆命名为T-zero-CMTM8-v2。DNA测序结果表明，这个较小的条带为CMTM8剪切掉了第二个外显子的产物，命名为CMTM8-v2。实施例3CMTM8或其可变剪切体CMTM8-v2表达质粒的构建根据CMTM8或其可变剪切体CMTM8-v2全长cDNA序列设计引物上游引物5'〉GAATTCAGATGGAGGAGCC〈3'(SEQIDNO:7)EcoRI下游引物-5，〉GGATCCTCACTGTATGGTC〈3'(SEQIDNO:8)BamHI上下游引物分别引入了EcoRI和BamHI酶切位点。以实施例1中得到的已克隆有CMTM8的pGEM-TEasy质粒为模板，进行PCR扩增(94°C，5分钟；94°C，20秒，53°C，20秒，72°C，30秒，35循环；72°C，7分钟)。纯化PCR产物，克隆至pGEM-TEasy载体中(表示为T-easy-CMTM8)，连接产物转化XL-1Blue菌，用蓝白斑筛选阳性克隆。测序质粒用Tip-20Mini-pr印aration试剂盒(Qiagen)进行纯化，3100测序仪进行DNA序列分析验证正确的克隆。用EcoRI限制性内切酶(TaKaRa公司)和BaraHI(TaKaRa公司)限制性内切酶双酶切T-easy-CMTM8质粒和真核表达质粒pCDNA3.1/Myc-HisB(-)(缩写为pCDB)(Irivitrogen)，琼脂糖凝胶回收纯化后进行连接反应(16°C，过夜连接)。连接产物转化大肠杆菌XL-1Blue,PCR筛选正向插入克隆，并测序验证无误，表示为pCDB-CMTM8。因为全长CMTM8的上下游引物已分别引入了EcoRI和BamHI的切点，用EcoRI和BamHI双酶切实施例2中得到的克隆T-zero-CMTM8-v2，和pcDNA3.1/Myc-HisB(-)质粒，凝胶回收后进行连接反应，所得质粒表示为pCDB-CMTM8-v2。测序质粒用Tip-20Mini-pr印aration试剂盒(Qiagen)进行纯化，3100测序仪进行DNA序列分析验证正确的克隆。转染细胞所用的空载体质粒pCDB、CMTM8的真核表达质粒pCDB-CMTM8或CMTM8-v2的真核表达质粒pCDB-CMTM8-v2分别用QiagenMaxi纯化柱(Qiagen)制备，过程简述如下。待纯化质粒转化大肠杆菌ToplO后涂至相应抗性的细菌培养皿上，1416小时后挑单细菌菌落于1ml抗性培养基中，37'C摇床(300转/分钟)培养8小时，扩大培养体系至lOOml，继续培养1416小时；6000g离心10分钟收获细菌，加入10mlPI(Qiagen)(含O.5mg/mlRNase)，充分重悬后加入10mlP2(Qiagen)，轻柔翻转34次，液体澄清后加入10ml4t:预冷的P3(Qiagen)，轻柔翻转34次，冰浴10分钟后20000g离心15分钟；用15mlQBT(Qiagen)预先平衡Qiagen纯化柱，将离心上清经滤纸过滤后上柱，用30mlQC(Qiagen)洗涤纯化柱，重复1次；加入10mlQF(Qiagen)洗脱质粒，重复1次，在质粒洗脱溶液中加入12ml异丙醇，翻转充分混匀后4'C离心30分钟；弃上清，加入70%乙醇洗涤，离心15分钟；弃上清，空气干燥10分钟后加入400ul的超纯水，待沉淀完全溶解后移入EP管；紫外分光光度计定量，调整浓度为lug/ul，并进行琼脂糖凝胶电泳检测质量，高速离心除菌并分装备用。实施例4CMTM8或其可变剪切体CMTM8-v2序列的生物信息学分析利用BLAST程序(http:〃ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)对蛋白质序列数据库进行序列比对，结果发现在CMTM8序列的第36168位氨基酸之间有一个MARVEL结构域，这提示CMTM8可能参与膜蛋白的分选和转运。MARVEL结构域是一与膜相关的结构域，可能与膜蛋白的附着(apposition)事件有关，例如转运泡的生物合成，神经递质的分泌和极化细胞膜蛋白的转运等。Physins,Gyrins，Occludin，MAL和CKLFSF家族的成员都具有这-一结构域。另外，有些复杂的疾病如Bardet-Biedl综合症，精神分裂症(schizophrenia)和脑膜炎球菌病(meningococcaldiseases)都与MARVEL结构域分子有关。在CMTM8的胞内Loop区有一个参与内化的共同基序YXX①(①代表一个大的疏水性的残基)。YXX①基序可与接头分子AP2的P2亚单位结合。AP2是膜蛋白通过网格蛋白(clathrin)内化的关键分子。CMTM8-v2是CMTM8的可变剪切体，由于缺少第二外显子所以使编码的蛋白缺少MARVEL结构域和胞桨的YXXO基序。SAGE数据库分析，CMTM8在肺癌组织、肝癌组织、卵巢癌组织、皮肤癌组织的表达较其相对应的正常组织的表达降低。实施例5凋亡形态的观察和磷脂酰丝氨酸(PS)外翻的检测将HeLa(宫颈癌细胞系，ATCCCCL2)和PC3细胞(前列腺癌细胞系，ATCCCRL-1435)培养于含10呢热灭活的胎牛血清(FBS)(Hyclone,USA)、100U/ml青霉素、100g/ral链霉素、2mML-谷氨酸的RPMI1640培养基(LifeTechnologies,USA)中。用实施例3制备的CMTM8或CMTM8-v2表达质粒或对照质粒(空载体)分别转染HeLa细胞和PC3细胞，以约3000个经转染的细胞铺96孔板。转染后60小时，用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染细胞核，通过荧光显微镜观察细胞并拍照。细胞凋亡的典型生物化学的标志是PS从质膜的胞浆侧转位到细胞的外表面，荧光标记的AnnexinV能特异识别暴露在凋亡细胞表面的PS，从而可以用流式细胞计数仪很方便地进行检测。用2X1()5个转染后的细胞铺24孔板，分别在约转染后40小时和60小时后收获细胞，用PBS(磷酸缓冲盐溶液)洗两次，将细胞垂悬在200ix1AnnexinV专用的缓冲液(10mMHEPES、pH7.4、140mMNaCl、1mMMgCl2、5mMKC1、2.5mMCaCl》中，然后加入异硫氰酸荧光素(FITC)偶联的AnnexinV，使其终浓度达到0.5tig/ml。于室温避光孵育20分钟后，加入碘化丙啶(propidineiodide,PI)，使其终浓度为lug/ral，立即用流式细胞计数仪对细胞进行分析。收集的细胞数为1X104，凋亡的细胞数用百分比表示。结果如图2A图2D所示，与对照细胞相比，CMTM8或其可变剪切体CMTM8-v2转染的细胞呈现典型的凋亡形态变化变圆、皱縮、出泡等。MPI染色显示，CMTM8或其可变剪切体CMTM8-v2转染的细胞染色体凝集并断裂(图2A、2C)，Annexin-V阳性染色的比率也明显增加(图2B、2D)。实施例6CMTM8或其可变剪切体CMTM8i2转染细胞中胱冬酶的活化和细胞色素c的释放经典的细胞凋亡途径为胱冬酶依赖的细胞凋亡，所以用Western印迹方法检测了胱冬酶-3和胱冬酶-9的酶原切割情况以及胱冬酶3底物PARP的酶切。另外细胞色素c在凋亡的过程中起十分重要的作用，是胱冬酶3活化的关键分子，所以本发明也检测了细胞色素c从线粒体释放到胞浆中的情况。分别收获CMTM8或其可变剪切体CMTM8-v2转染60小时后的细胞，用PBS洗细胞三次，用裂解液(50mMTris-HCL(pH7.4)、150mMNaCl、l%NonidetP-40、0.25%脱氧胆酸钠、lmMEDTA(乙二胺四乙酸)、2mM歸04、1mMNaF和ProteaseInhibitorCocktailTablets(Roche))在4。C裂解细胞30min。细胞裂解液于18000Xg离心20min，上清液即为所需总蛋白的裂解液。以牛血清白蛋白作为标准品，用BCA蛋白测定试剂盒(Pierce，美国)定量总蛋白的浓度。总蛋白上样量30"g，用8%SDS-PAGE胶分离，并用湿式法将蛋白转到尼龙膜(HybondTM，ECLTM，AmershamPharmacia,英国)上。己转有蛋白条带的尼龙膜用5%BSA(牛血清白蛋白)(用含0.05%Tween-20的TBS-T配制)于室温封闭1小时，用TBS-T于室温洗膜两遍，加入用TBS-T配制的一抗(抗胱冬酶-3、胱冬酶-9和PARP的单克隆抗体均购自美国的信号转导实验室)，于4。C过夜孵育，次日用TBS-T洗膜三次，10min/次，加入AlexaFluor780标记的工gG二抗(LI-CORBIOSCIENCEINC)，室温孵育1.5小时。用TBS-T洗膜三次之后用LI-CORInfraredImagingSystem(Odyssey,Lincoln,NE)扫描成像。细胞色素c的提取方法如下收集细胞，用PBS洗两次，垂悬细胞于0.2ml裂解液(20mMH印es-K0H(pH7.5)、lOmMKCl、1.5mMMgCl2、1mMEDTA-Na2、ImMEGTA-Na2、IraMDTT、0.ImMPMSF、250raM蔗糖)中，细胞悬液用匀浆器(DounceHomogenizer)轻轻地研磨约45次左右，细胞匀浆在4。C于2000rpm离心15分钟，离心后所得上清再在4。C于12000rpm离心30分钟，随后离心所得上清液即为胞浆成分，进行蛋白定量后用Western印迹检测细胞色素c。用间接免疫荧光法观察细胞色素c从线粒体的释放。将用CMTM8表达质粒或对照质粒转染的HeLa细胞以1X103细胞/100u1铺到共聚焦专用的小皿MatTekCultureware(MatTekCorporation,美国)中，于37。C孵育约46小时后，补加1ml新鲜的完全培养基。转染后60小时，细胞用PBS洗两次，用3%多聚甲醛于室温固定30分钟。用含0.1%tritonX-100的3%的多聚甲醛于室温通透30分钟，以PBS洗三次之后，用2%BSA于室温封闭30分钟。封闭后的细胞与用封闭液配制的抗细胞色素c的单抗(美国信号转导实验室)孵育30分钟1小时，于室温用PBS洗三次后，加入若丹明偶联的羊抗鼠二抗(Sigma，St.Louis，M0)，在室温放置30分钟。最后在用PBS洗细胞之后，用75%甘油封片，或用DAPI于室温染色10分钟。用TCS-SP激光扫描共聚焦显微镜(LeicaMicrosystems,Mannheim,德国)观察结果。实验结果表明，在CMTM8或其可变剪切体CMTM8-v2瞬时转染的HeLa细胞中，胱冬酶原-3和胱冬酶原_9明显降低(图3)，可检测到了胱冬酶3底物PARP的酶切片段(24kDa)，但在对照细胞组中几乎没有明显的PARP的切割条带(图3)，这进一步证实了胱冬酶3的活化。CMTM8或其可变剪切体CMTM8-v2的瞬时转染也导致了大量的细胞色素c从线粒体释放到胞浆中(图3)。实施例7腺病毒介导的CMTM8在肿瘤细胞中的表达可以诱导肿瘤细胞的凋亡用HeLa细胞铺96孔板，每孔3000个细胞，于37。C、5%0)2孵箱培养约24小时，用空载体腺病毒对照(Ad5-null)和CMTM8腺病毒(Ad5-CMTM8)都由本元正阳公司按照标准方法进行重组、包装、纯化获得。TCID50亦由该公司按照标准方法测定。用Ad5-null和Ad5-CMTM8感染所培养的HeLa细胞，MOI为500。在病毒感染后24小时、48小时、72小时和96小时，用荧光显微镜观察细胞的形态变化。如图4所示，在感染后24小时，与空载体腺病毒相比，CMTM8腺病毒感染组的细胞有30%开始变圆，随着时间的延长，CMTM8腺病毒感染组细胞出现明显的凋亡形态变化变圆、皱縮、出泡等。实施例8Bad第112位丝氨酸磷酸化程度的降低可能是CMTM8超表达引起细胞凋亡的原因将服K293细胞(人胚胎肾细胞系，ATCCCRL1573)培养于含1(F。热灭活的胎牛血清(FBS)(Hyclone，美国)、100U/ml青霉素、100g/ml链霉素、2mML-谷氨酸的RPMI1640培养基(LifeTechnologies,美国)中。Bad是一个只含BH3结构域的蛋白质，能与拮抗凋亡的蛋白质Bc卜xL结合，因此干扰Bcl-xL的活性。Bad的活性可通过磷酸化的过程进行调节。表皮生长因子(EGF)可以刺激Bad的第112位氨基酸磷酸化，从而导致Bad在胞浆内的聚集，这是因为胞浆内的14-3-3蛋白质可与磷酸化的Bad结合。为了研究CMTM8超表达引起细胞凋亡的原因，观察了CMTM8超表达对Bad磷酸化的影响。首先合成了针对CMTM8的siRNA(siCMTM8，有义链的序列为CCGUCUUCUUCCUCAUUAU，SEQIDNO:9)和作为对照的非沉默siRNA(腿-silencingsiRNA，有义链的序列为UUCUCCGAACGUGUCACGU，SEQIDNO:10)(上海基凯公司)。SiRNAs合成后去RNase处理并纯化。非沉默siRNA经BLAST程序搜索NCBI数据库(vww.ncbi.nlm.nih.gov)进行序列相似性分析结果表明与全人类基因组无匹配。用缓冲液(20mMKCl，6mM服PES(pH7.5)和0.2mMMgCl2)溶解siRNAs冻干粉使其终浓度都达到20uM。siRNAs用电转的方法转染进细胞。电转过程如下，将细胞的密度调整到1x107350iU，将加有siRNAs的细胞悬液移入电转杯，以单脉冲120V，20ms电转，电转后的细胞静置室温约lOmin，随后将细胞转移到预温的完全培养基中于37r培养。应用RT-PCR的方法检测siCMTM8对内源性CMTM8的抑制效果。首先，用TRIZ0L试剂提取细胞总固A。具体方法如下收获对数生长期的细胞，在35mm培养皿中加入lmlTRIZ0L「M试剂，反复吹打破碎细胞，并将其转移到1.5ml无RNA酶的离心管中，于室温静置5分钟，加入0.2ml氯仿，猛烈振荡15秒，在4。C于不大于12000g离心15分钟，收集上层水相，加入500"1异丙醇来沉淀RNA，用70%乙醇洗一遍，于室温干燥后，将沉淀得到的RNA复悬于DEPC(焦碳酸二乙酯)处理的H20中，通过分光光度计定量后将所得RNA溶液用于逆转录。其次，通过逆转录合成单链cDNA，并进行PCR扩增，具体方法如下利用Invitrogen公司的S叩erScriptII试剂盒，用2pg总RNA合成单链cDNA。PCR反应所用引物序列如表1所示，反应条件如表2所示，GAPDH作为系统内参(对照)。表1PCR反应所,目的引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>表2PCR反应条件<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>最后，对PCR产物进行鉴定。以CMTM8和GAPDH的PCR产物分别跑2%和1%的琼脂糖凝胶电泳，以EB染色后用凝胶成像系统成像。从图5A可以看出，siCMTM8明显降低了内源性CMTM8mRNA的水平。为了检测CMTM8表达量的变化对Bad第112位丝氨酸磷酸化的影响，用对照质粒、CMTM8表达质粒、非沉默siRNA或siCMTM8转染HeLa细胞，在转染后60小时收获细胞，用Western印迹方法检测Bad-pSu2的磷酸化水平，具体实验方法与实施例6中所述的Western印迹方法基本相同。如图5B所示，与对照细胞相比，在CMTM8瞬时转染的细胞中，Bad第112位丝氨酸磷酸化的程度显著下降；然而，siCMTM8下调内源性CMTM8的表达对Bad的磷酸化没有显著影响，推断细胞内还存在其它的调节通路可以补偿CMTM8下调引起的Bad磷酸化的变化。随后，本发明合成了针对Bad的siRNA(siBad，有义链的序列为AAGMGGGACUUCCUCGCCCG,SEQIDNO:15)，siRNA的合成和处理见实施例8。并用Western印迹的方法观察了siBad对内源性Bad的下调作用。如图5C所示，siBad能有效降低内源性Bad的表达水平。接着观察了siBad对CMTM8转染诱导凋亡的作用，质粒和siRNA的转染如实施例8，其中通过检测转染细胞PS外翻的情况来判断细胞的凋亡程度。如图5D所示。与对照细胞相比，siBad的转染能显著降低CMTM8瞬时转染引起的凋亡细胞的比率。实施例9CMTM8在肝癌组织中的表达量显著低于正常肝组织本发明利用组织芯片的原位杂交实验证明了CMTM8在肝癌组织的低表达。原位杂交的具体实验方法如下(1)探针的制备。首先制备用于体外转录的模板。以实施例2中制备的pCDB-CMTM8质粒为模板，用引物(上游引物5'-TgCTggAACTgAgTACTTCCg-3'，(SEQIDNO:11);下游引物5'-AgAgAggTACAAgACgAAggC-3'，(SEQIDNO:12))扩增得到长为184个碱基对的DNA片段，将此片段连接在pGEM-TEasy载体中(Promega)上，表示为184-T-easy,并将其转化到处于感受状态的XL-1Blue菌，次日挑取克隆并培养于约lmlLB培养基(内含IOO)^g/ml的青霉素)中。于37。C空气摇床培养约8小时10小时，用T-easy克隆载体的上游引物T7和目的片段的下游引物进行PCR鉴定正向插入的克隆，选一阳性克隆进行测序验证。用Takara公司的限制性内切酶SalI和NcoI于37。C过夜酶切测序正确的质粒，酶切体系(50lil)如下质粒约10ug;内切酶(SalI或NcoI):lul2^1;10X缓冲液(H或K):5"1;10XBSA:5";H20:xul(补充到50ul)。次日，用1%的琼脂糖电泳酶切产物，切胶回收目的条带，目的条带的回收采用玻璃奶(siliC0)进行，具体回收步骤如下①切取含目的条带的凝胶，加入3倍于凝胶体积的6M的Nal(将0.75g的NaS(V溶解于40ml水中，加入Nal45g至完全溶解，过滤除菌保存)和5iil玻璃奶(lul可吸附约0.5ixg的DNA);②于55。C放置至凝胶完全溶化，溶化过程中需颠倒混匀含凝胶的EP管。以S000rpm离心1分钟；③弃掉上清液，用500ii1DNA洗涤缓冲液(20mMTris(pH7.4)、lmMEDTA、100mMNaCl，加入等体积的无水乙醇)洗3次，最后将玻璃奶置于55i:至完全干燥成粉末状，加入50ul水于55。C溶解约1030分钟；以1200015000rpm高速离心约10分钟，将上清液收集于一干净的离心管中，向玻璃奶沉淀再加入约50y1水并于55。C溶解约1030分钟，以④的条件再进行高速离心，将得到的上清液与第一次收集的上清液合并；⑤混匀收集得到的上清液，取l"1跑1%的琼脂糖电泳，观察目的片段的回收量和纯度。将通过玻璃奶回收得到的目的片段用QIAquickNucleotideRemovalKit(QIAGEN)去Rnase(RNA酶)处理，整个实验过程中谨防RNase的污染。具体步骤如下①力口5倍体积的PN缓冲液(500ul)到100ul的样品中，混匀；②将两个试剂盒提供的回收柱置于两个收集管中；③将样品加到回收柱中，以6000rpm离心l分钟；④弃去穿过液，将回收柱放于同一收集管中，加750"1的PE缓冲液，以6000卬m离心l分钟；⑤弃去穿过液，将回收柱再放于同一收集管中，以不低于13000rpm离心l分钟；将回收柱放于一干净的EP管中；⑦加约15"1的DEPC水于回收柱中，于室温放置1分钟，以不低于13000rpm离心1分钟。将得到的无RNase的目的片段用分光光度计定量，并取1P1通过跑1%的琼脂糖电泳来估计目的片段的含量。体外转录。本发明采用DIGRNALabelingKit(SP6/T7)(Roche公司，货号No.11175025910)迸行体外转录标记腦A探针。转录体系(10u1)如下模板(无RNase的目的片段)0.5ullug;NTP标记混合物lul;转录缓冲液1"1;RNase抑制齐廿0.5Pl;T7/SP6聚合酶lul;H20:XUl(补充到10ul)。反应条件37°C，3小时4小时。理论上，lPg的DNA模板可以转录出10ug的RNA探针。反应完毕后，向反应体系中加入15ul甲酰胺，分装后保存于-2(TC冰箱中。注意避免反复冻融以防探针量损失。(2)探针的检测。1)RNA电泳。取1"1标记好的RNA探针用1%的琼脂糖电泳约10分钟(200V)，通过EB染色观察探针的质量。由于RNA二级结构的存在，很难得到单-的探针条带，可煮沸5分钟后电泳即可。2)尼龙膜检测。尼龙膜法可以对标记好的探针进行相对准确的定量。首先要将探针点到尼龙膜上，点样的具体方法是将试剂盒所带的标准品RNA及本实施例中所标记的探针稀释成一定量，例如，首先按l:IO稀释，之后按l:3进行梯度稀释，稀释7个梯度，每个稀释度取lul按一定的顺序点在尼龙膜上。一般将标准品点在第一行，本实施例所标记的探针点在第二行和第三行。待点好的样品完全干透后，将膜放入8(TC的烤箱中交联2小时3小时。接着对膜上的探针进行检测，检测的具体步骤如下①将交联好的膜放入洗涤缓冲液(1乂马来酸缓冲液+0.3%Tween-20，1X马来酸缓冲液的配方是0.1M的马来酸、0.15M的氯化钠、用NaOH调pH至7.5)中于室温洗2分钟；②将膜放入封闭液(Blockingbuffer)(以马来酸缓冲液为溶剂，溶解1%的封闭粉，封闭粉购自Roche公司)中于室温封闭30分钟；③用封闭液配制anti-DIG抗体(Roche)，anti-DIG抗体与封闭液的比例为1:2500，将膜与配制好的抗体于室温孵育30分钟至3小时；用洗涤缓冲液室温洗膜两次，每次15分钟；⑤将膜放入检测缓冲液(O.1MTris-HC1、0.1MNaCl、用Na0H调pH值至9.5)中浸泡2分钟；⑥用检测缓冲液配制NBT/BCIP显色工作液(1ml检测缓冲液、3.3mlBCIP和6.6mlNBT)，将膜放入该工作液中于室温显色；⑦观察结果。根据样品和标准品的点的颜色的深浅，找到相对接近的点，根据样品的稀释度估计探针的浓度。一般在杂交前，用杂交液将探针浓度稀释至2ng/n15ng/u1。(3)原位杂交。将从陕西超英生物科技有限公司买的肝癌组织的芯片(编号CC03-02)6(TC烤过夜，接下来进行一系列下列的步骤①脱蜡二甲苯I，37°C，30分钟；然后二甲苯II，室温，30分钟；然后二甲苯ni，室温，30分钟。②水化梯度酒精100%乙醇1，室温浸泡，5分钟；然后100%乙醇11，室温浸泡，5分钟；然后95%乙醇，室温浸泡，5分钟；然后70%乙醇，室温浸泡，5分钟；然后50%乙醇，室温浸泡，5分钟；然后lxraS，室温浸泡，5分钟。③变性0.2MHC1，室温浸泡，20分钟；然后1XPBS，室温浸泡，3分钟，两次。蛋白酶K处理蛋白酶K(PK)处理，用PBS稀释使其终浓度为100ug/ml，37°C，20分钟，用1XPBS室温浸泡两次，每次2分钟。⑤后固定用新鲜配制的4%的多聚甲醛室温固定5分钟；然后1XPBS，室温浸泡，3分钟；然后1XPBS，室温浸泡，3分钟；然后1XPBS，室温浸泡，2分钟。⑥脱水70%乙醇，室温浸泡，3分钟；然后95%乙醇，室温浸泡，3分钟；然后100%乙醇I，室温浸泡，5分钟；然后100%乙醇11，室温浸泡，5分钟。芯片室温干燥l小时以上。同时将杂交液预热至5(TC。⑦预杂交将预热的杂交液滴到组织芯片上，4CTC孵箱中预杂交约12小时。⑧探针处理将水煮沸，关掉火，探针放入沸水中变性约10分钟，取出后马上置于冰上，待探针冷却后将探针用1X杂交液稀释到应有浓度。⑨杂交:将稀释好的探针(正义链探针(sense)作为对照组，反义探针(Anti-sense)为实验组)滴到预杂交完的组织芯片上，38'C过夜杂交约16小时。⑩杂交后处理含50%甲酰胺的4SSC(用20X的SSC稀释而来，20XSSC的配方是3MNaCl,0.3MNaAc，用NaOH调pH值至7.0)，37°C，30分钟；然后2XSSC，37°C，15分钟；然后2XSSC，37°C，15分钟；然后0.1XSSC，37°C，15分钟；然后1XPBS，室温浸泡，5分钟；然后RNase(40ug/mlRNaseA，10mMTris-HC1(pH7.5)，5mMEDTA，0.3mMNaCl)滴片消化，37°C，15分钟；然后O.1XSSC，37°C，IO分钟；然后1XPBS，室温，5分钟；然后洗涤缓冲液(见上)，室温浸泡，2分钟；然后1X封闭缓冲液(见上)，室温滴片，30分钟；然后碱磷酶(AP)标记的抗DIG抗体(1:250)，滴片，37°C，1小时，吸去抗体；然后洗涤缓冲液，室温浸泡，15分钟；然后洗涤缓冲液，室温浸泡，15分钟；然后检测缓冲液，室温滴片，2分钟；然后NBT/BCIP滴片，室温避光显色，显微镜下随时观察显色效果，以便及时终止反应。显色完毕后用自来水冲洗终止反应，用明胶甘油封片。(4)结果观察。将可疑阳性病人(±)归为阴性进行X2检验。如表3所示，在对照组，X2=0.73，这说明CMTM8在正常肝组织和肝癌组织中的表达无差异；而在实验组，X2=8.40，表明CMTM8在正常肝组织和肝癌组织中的表达具有显著差异。CMTM8在肝癌组织中的低表达进一步证实了CMTM8的肿瘤抑制作用。<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>进行免疫前，将四条KLH偶联的肽段用5ml双蒸水稀释成浓度为lmg/ml，分装，-7(TC保存备用。本发明利用混合免疫的方法制备多抗，免疫的具体过程如下①选择雄性兔子两只；②四条肽各100yg混合，共400ug，将这400yg混合肽与弗氏完全佐剂以1:1的比例混匀，多点注射兔子的足躕部和背部皮下；③两周后加强免疫，四条肽各100"g混合，共40(^g，将这400ug混合肽与弗氏不完全佐剂以1:1混匀，仅背部皮下多点注射。1014天后可以试血，用ELISA检测抗体效价。要是抗体效价不够高的话，两周后可以再次加强免疫，具体方法同第一次加强免疫。本发明采用直接ELISA的方法检测抗体的效价，具体方法如下(1)抗原包被①四条裸肽用双蒸水分别稀释至10mg/ml，分装冻存备用；②混合四条裸肽，用包被液(Na2C031.59g，NaHC032.93g，加双蒸水至1000ml，pH9.6)将混合裸肽稀释至lug/ml;③每孔薩1(相当于每孔100ng)，37'C包被4个小时；用PBS-T(0.5%。Tween-20)洗包被好的酶标板三次；⑤1%BSA37。C封闭4小时，拍干，-20。C备用。(2)检测①用抗体稀释液(PBS-T+0.3y。BSA)将抗血清按照不同的滴度稀释(如102，10:!，104，105，106……)，每孔100ul，37"反应2小时；②PBS-T洗三遍；③加50ul/孔服P偶联的抗兔二抗(抗体稀释液，1:5000)，37°C反应l小时；④PBS-T洗三遍；⑤每孔50u1显色液(5ml显色缓冲液，lulH202，0.5ugOPD粉末)显色。显色缓冲液的配方是Na2HP04.12H20，1.84g;柠檬酸，0.51g;加双蒸水至100ml;⑥用酶标仪490nm读数。本发明也用Western印迹的方法检测了CMTM8或其可变剪切体CMTM8-v2兔多抗对内源性CMTM8的识别情况。Western印迹的具体实施方法与实施例6基本相同。ELISA检测结果显示，CMTM8或其可变剪切体CMTM8-v2多肽免疫产生的多抗效价都达到了1X106以上。如图6所示，第二只兔的CMTM8或其可变剪切体CMTM8-v2兔多抗(用表4所示肽段14混合免疫)能识别内源性的CMTM8蛋白，进一步，将第二只兔的CMTM8或其可变剪切体CMTM8-v2兔多抗血清，经实施例10所示4条肽段各2mg偶联溴化氰活化的S印horose4B的亲和层析柱纯化后用于Western印迹检测和免疫组织化学分析。实施例11CMTM8或其可变剪切体CMTM8-v2对细胞增殖的影响用MTT法检测细胞的增殖情况，将质粒pCDB、pCDB-CMTM8或pCDB-CMTM8-v2转染HEK293,PC3细胞，转染后24小时，用含有20ng/mlEGF的培养液将胰酶消化下来的细胞浓度调整到2x103细胞/100iU，铺96孔板，每组三个复孔，每孔加细胞悬液100ul。每天观察细胞的生长状况。对于MTT测定，每孔加IOn1MTT(5ug/u1PBS)，在含有5%032的37。C孵箱中孵育，46小时后用细胞裂解液(20%SDS,50%DMS0，pH4.7)过夜裂解细胞，用EL-311SXELISAReader测定在570nm波长下的吸光度值。为了观察CMTM8、CMTM8-v2对细胞增殖的长期抑制效果，我们用质粒pCDB、pCDB-CMTM8或pCDB-CMTM8-v2转染HEK293细胞进行了克隆形成实验，转染48小时后的细胞用胰酶消化，并用完全培养基垂悬，每100-mm的平皿铺约1000个细胞，在所铺的100-mm的平皿中加入20ng/mlEGF和600800mg/ml的G418，细胞放入37°C的C02孵箱培养，每两天更换新鲜培养液，同时添加EGF和G418。培养三周后的细胞克隆用5%的多聚甲醛固定，并用结晶紫染色，计数细胞数多于50个的克隆。MTT法检测结果显示，在35天的时间内，pCDB-CMTM8或pCDB-CMTM8-v2转染的细胞生长速度明显慢于空载体对照pCDB转染的细胞(图7中图片A和B)。CMTM8、CMTM8-v2对细胞的生长起负调节作用，CMTM8-v2更明显。克隆形成实验结果显示，如图7中图片C所示，在pCDB-CMTM8或pCDB-CMTM8-v2转染组的细胞克隆数明显少于pCDB转染组。此结果进一步验证了CMTM8、CMTM8-v2对细胞增殖的负调节作用，而且CMTM8-v2更明显。实施例12CMTM8或其可变剪切体CMTM8-v2对EGF刺激产生信号的影响Ras/MAPK通路是EGFR信号向细胞内转导的重要途径，调节着细胞凋亡、生长以及一些重要基因的表达。为了检测了CMTM8、CMTM8-v2对EGFR通路的影响，用对照质粒、CMTM8表达质粒、CMTM8-v2表达质粒转染HeLa细胞，转染24小时后的细胞撤血清20小时，用10ng/mlEGF刺激，在刺激的不同时间检测pERK。刺激后的细胞吸去含EGF的培养液，并用冷的PBS洗细胞三次，用裂解液(50mMTris-HCL,pH7.4,150mMNaCl，1%NonidetP-40，0.25%脱氧胆酸钠，1mMEDTA，2mMNa3V04，1mMNaFandProteaseInhibitorCocktailTablets)4。C裂解细胞30分钟。收获细胞，细胞裂解液18000xg，20分钟离心，上清即为所需总蛋白的裂解液，以牛血清白蛋白作为标准品，用BCA蛋白测定试剂盒(Pierce,USA)定量总蛋白的浓度。总蛋白上样量30ug，用8%SDS-PAGE胶分离，并用湿式法将蛋白转到尼龙膜(HybondTM，ECLTM，AmershamPharmacia,UK)上。已转有蛋白条带的尼龙膜用5%BSA(用含0.05%Tween-20的TBS-T配制)室温封闭1小时，用TBS-T室温洗膜两遍，加入用TBS-T配制的一抗，4'C过夜孵育，次日用TBS-T洗膜三次，10分钟/次，加入AlexaFluor780标记的IgG二抗，室温孵育1.5小时。用TBS-T洗膜三次之后用LI-CORInfraredImagingSystem(Odyssey,Lincoln,NE)扫描成像。Westernblot结果显示用EGF刺激pCDB、pCDB-CMTM8-v2或pCDB-CMTM8转染的HeLa细胞，与pCDB转染组相比，pCDB-CMTM8和pCDB-CMTM8_v2转染的细胞，EGF刺激后的ERK1/2磷酸化程度较低，CMTM8-v2更明显(图8)。结果表明，CMTM8-v2的表达对EGFR介导的信号具有更强的负向调节作用。实施例13抗体检测CMTM8或其可变剪切体CMTM8-v2的表达本发明用Western印迹的方法检测了CMTM8或其可变剪切体CMTM8-v2兔多抗对哺乳动物细胞超表达CMTM8蛋白的识别情况。用实施例3制备的CMTM8或其可变剪切体CMTM8-v2表达质粒或对照质粒(空载体)分别转染HeLa细胞细胞，转染后48小时，用Westernblot的方法检测了CMTM8兔多抗对哺乳动物超标达CMTM8及细胞内源性表达CMTM8的识别情况。Western印迹的具体实施方法与实施例6基本相同。免疫组织化学检测脱蜡组织芯片置于二甲苯中浸泡20分钟，换新鲜二甲苯重复一次；再水化将脱腊后的组织切片于10(F。乙醇中浸泡5分钟x2次，95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、蒸馏水各浸泡3分钟xl次；抗原修复抗原修复液为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，将抗原修复液微波高火加热至沸腾，将切片放入，再用微波高火加热5分钟，补加蒸馏水恢复体积后再用微波高火加热5分钟，自然冷却至室温；去除内源性过氧化物酶新鲜配置3%HA，滴片，室温下避光孵育10分钟；PBS洗5分钟x3次，不时晃动；封闭用1(F。正常羊血清PBS封闭液室温封闭20分钟；一抗反应滴片，加1:100的CMTM8或其可变剪切体CMTM8-v2兔多抗(以封闭液稀释)，4。C过夜反应，以同样稀释度的正常兔IgG作为阴性对照；PBS洗5分钟x3次，不时晃动；二抗反应HRP-抗兔IgG抗体1:1000PBS稀释，37。C反应30分钟；PBS洗5分钟x3次，不时晃动；DAB显色，滴片，镜下观察反应结果，苏木精复染细胞核后，中性树胶封片，于显微镜下观察并记录结果。Westernblot结果显示，如图9A和图9B所示，anti-CMTM8或其可变剪切体CMTM8-v2兔多抗检测到pCDB-CMTM8转染组、pCDB-CMTM8-myc转染组在细胞培养上清出现的条带。anti-myc抗体检测到pCDB-CMTM8-myc转染组在细胞培养上清出现的条带。免疫组织化学检测结果如图10A和图10B显示可以观察到，CMTM8或其可变剪切体CMTM8-v2在前列腺增生中有阳性表达，CMTM8或其可变剪切体CMTM8-v2主要在前列腺增生腺体的细胞浆中表达。序歹U表<iio>北京大学〈120〉新的肿瘤抑制基因或蛋白及其应用<130>GBI07CN0474-C〈160〉15<170>Patentlnversion3.1<210〉1〈211〉1185<212〉腿〈213〉智人(Homosapiens)〈220〉〈221>CDS<222>(295)..(813)cgctcgctctcctcttcctc60ctaggggcaccgcgcactag120cccctcgcacctcctgcccc180ggcgcagggccgcgcgtcca240gcagtggctcgacgatg297Met1gagccgcagcgcgcccgctegC3Cgtc3CC3CC3CCgccage345GluGluProGin5ArgAlaArgSerHis10ThrValThrThrThr15AlaSertecttcgcagagaacttctec3CCageageageagettcgcctacgac393SerPheAla20GluAsnPheSerThr25SerSerSerSerPhe30AlaTyrAspegggagttcetccgcaccctgcccggcUcetcategtggccgagate441ArgGlu35PheLeuArgThrLeu40ProGlyPheLeulie45ValAlaGluliegttctggggctgctggtatggacgcttattgetggaactgagtacUc489ValLeuGlyLeuLeuValTrpThrLeulieAlaGlyThrGluTyrPhe50556065egggtccccgCEltttggctgggtcatgtttgtagetgtattttactgg537ArgValProAlaPhe70GlyTrpValMetPhe75ValAlaValPheTyr80TrpgtcetcaccgtcUcttcetcattatetacataatg3CCtac3CC585ValLeuThrVal85PhePheLeulielie90TyrlieThrMetThr95TyrThraggattccccaggtgccctgggtgggcctgtgctttascggc633ArgliePro100GinValProTrpThr105ThrValGlyLeuCys110PheAsnGlyagtgccttcgtcttgtacetctctgccgetgttgtagsttcttec681SerAla115PheValLeuTyrLeu120SerAlaAlaValVal125AspAlaSerSergtcteccctgag'agggacagtC3Cttctgggcggcctea729ValSerProGluArgAspSerHisAsnPheAsnSerTrpAlaAlaSer130135140145〈400〉1ggcctccacctagggccccaagggacacccgcgcgggccggccccagaccgccttccccggcgcagctcggccgcgcctgcgctcccctccgccggggtcgctgcccggcggagcccgcggacagcccccccccgcgcctcctggggacgagcctcccctcaccgaggcgggcgggcgccgtgtccccagcgccagcccgtcgttctttgccttcctggtcaccatetgctacSerPhePheAlaPheLeuValThrlieCysTyr150155ttcagttttatagcatggagatecaggaccataPheSerPhelieAlaTrpArgSerArgThrlie165170ttttgataattaaaaggaaaaaaaa已ggasgactctcactaatgt已tattccc已gagaattgtattta已ctaattaatgtctcacaaattgtggtttgttac已已ttaaactggatacttaataatgaactcttaagtatcttattaatgtattaatgtctg已caatgtttaaatagat已aattgetaatattgagaatgtttttaagatgccagattcttttttgattaaatgttgcaaa犯getgga犯tacatatAlaGlyAsnThrTyr160cagtgatttaccaGingtaaaaacagtttttatatttttgcaaagttcatagatcagtcaagtttgatcccaaaaactgtaggt已tcttaaatttggttgtagctttattttctta77782388394310031063112311831185〈210〉2<211〉173〈212>PRT〈213〉智人〈400〉2MetGluGluProGinArgAlaArg15SerSerPheAla20GluAsnPheSerAspArgGlu35PheLeuArgThrleu40lieValLeuGlyLeuLeuValTrp5055PheArgValProAlaPheGlyTrp6570TrpValLeuThrVal85PhePheLeuThrArgliePro100GinValProTrpGlySerAla115PheValLeuTyrLeu120SerVal130SerProGluArgAsp135SerSerSerPhePheAlaPheLeuVal145150TyrPheSerPhelieAlaTrpArg165SerHisThrValThrThrThrAla1015ThrSerSerSerSerPheAlaTyr2530ProGlyPheLeulieValAlaGlu45ThrLeulieAlaGlyThrGluTyr60ValMetPheValAlaValPheTyr7580lielieTyrlieThrMetThrTyr9095ThrThrValGlyLeuCysPheAsn105110SerAlaAlaValValAspAlaSer125HisAsnPheAsnSerTrpAlaAla140ThrlieCysTyrAlaGlyAsnThr155160SerArgThrlieGin170〈210〉3<211〉348<212>DNA<213〉智人<220〉〈221〉CDS〈222>(1)..(348)〈400〉3atggaggagccgcagcgcgcccgctcgcacacagtcaccaccaccgcc48MetGluGluProGinArgAlaArgSerHisThrValThrThrThrAla151015agetecttcgcagagaacSerSerPheAlaGluAsn20egggagttcetccgcAspArgGluPheLeuArg35ateggcctgtgctttaaclieGlyLeuCysPheAsn50getgttgtElgatgcatctAlaValValAspAlaSer6570ttc朋cagetgggcggccPheAsnSerTrpAlaAla85tgctacgetggaCysTyrAlaGlyAsnThr1008CCatacagtgaThrlieGin115〈210〉4<211>:L15〈212〉PRT<213〉智人〈400〉4MetGluGluProGinArg15SerSerPheAlaGluAsn20AspArgGluPheLeuArg35lieGlyLeuCysPheAsn50AlaValValAspAlaSer6570PheAsnSerTrpAhAla85CysTyrAlaGlyAsnThr100ThrlieGin115<210>5<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>〈223〉引物<400〉5acgatggaggageegettctecaccagePheSerThrSer25accctgcccggcThrLeuProGly40ggcagtgccttcGlySerAlaPhe55tecgtcteccctSerValSerProteategttctttSerSerPhePhe90tatttcagttttTyrPheSerPhe105ageageagettcSerSerSerPhe30ttcetcategtgPheLeulieVal45gtcttgtacetcValLeuTyrLeu60gagagggacagtGluArgAspSer75gccttcctggtcAlaPheLeuValatagcatggagalieAlaTrpArg110gcctac96AlaTyrgccgag144AlaGlutctgcc192SerAlacacaac240HisAsn80accate288Thrlie95tecagg336SerArg348AlaArgSerHisThr10PheSerThrSerSer25ThrLeuProGlyPhe40GlySerAlaPheVal55SerValSerProGlu75SerSerPhePheAla90TyrPheSerPhelie105ValThrThrThrAla15SerSerPheAlaTyr30LeulieValAlaGlu45LeuTyrLeuSerAla60ArgAspSerHisAsn80PheLeuValThrlie95AlaTrpArgSerArg11016<210>6〈211>22〈212〉■〈213〉人工序列〈220〉<223〉引物<400>6tcactgtatggtcctggatctc22<210〉7〈211〉19<212〉腿〈213〉人工序列<220>〈223〉引物<400>7gaattcagatggaggagcc19<210〉8〈211>19〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉<223>引物〈400〉8ggatcctcactgtatggtc19〈210〉9〈211〉19〈212〉RNA<213>智人(Homosapiens)〈400〉9ccgucuucuuccucaxiuau19〈210〉10〈211〉19〈212〉RNA<213〉人工序列〈220〉〈223〉非沉默siRNA<400〉10uucuccgaacgugucacgu19〈210〉11<211〉21<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉引物<400〉11tgctggaactgagtacttccg21<210〉12〈211>21〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉引物〈400〉12agagaggtacaagacgaaggc21〈210〉13〈211〉26<212>DNA<213〉人工序列〈220〉〈223>引物〈400〉13tgaaggtcggagtcaacggaUtggt26〈210〉14〈211〉24〈212〉DNA〈213〉人工序列<220〉〈223〉引物<400>14catgtgggccatgaggtccaccac24<210〉15<211〉21<212>RNA<213>智人<400〉15aagaagggacuuccucgcccg2权利要求1、如下(a)、(b)、(c)或(d)所示的蛋白或其免疫性片段(a)由SEQIDNO2所示的氨基酸序列组成的蛋白；(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且与(a)具有相同功能的由(a)衍生的蛋白；(c)由SEQIDNO4所示的氨基酸序列组成的蛋白；或(d)在(c)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且与(c)具有相同功能的由(c)衍生的蛋白。2、编码权利要求1所述的蛋白或其免疫性片段的多核苷酸序列；所述的多核苷酸序列优选为SEQIDNO:l所示的多核苷酸序列、SEQIDNO:1的核苷酸295813所示的多核苷酸序列或SEQIDNO:3的核苷酸1345所示的多核苷酸序列；所述免疫性片段优选为SEQIDNO:2的氨基酸157173所示的序列、SEQIDNO:2的氨基酸121所示的序列、SEQIDNO:2的氨基酸2242所示的序列或SEQIDNO:2的氨基酸127143所示的序列。3、权利要求1所述的蛋白或其免疫性片段或权利要求2所述的多核苷酸序列在诱导细胞凋亡中的应用；所述细胞凋亡尤其是肿瘤细胞凋亡；所述的肿瘤细胞凋亡优选为通过降低Bad第112位丝氨酸磷酸化程度而导致的肿瘤细胞凋亡。4、权利要求1所述的蛋白或其免疫性片段或权利要求2所述的多核苷酸序列在制备治疗和/或抑制肿瘤的药物中的应用；所述的肿瘤优选为表皮生长因子受体高表达的肿瘤；所述的表皮生长因子受体高表达的肿瘤优选为前列腺癌、前列腺增生、宫颈癌或肝癌。5、如权利要求4所述的应用，其中所述的多核苷酸序列为SEQIDNO:1所示的多核苷酸序列、SEQIDNO:1的核苷酸295813所示的多核苷酸序列或SEQIDNO:3的核苷酸1345所示的多核苷酸序列，所述免疫性片段为SEQIDNO:2的氨基酸157173所示的序列、SEQIDNO:2的氨基酸121所示的序列、SEQIDNO:2的氨基酸2242所示的序列或SEQIDNO:2的氨基酸127143所示的序列。6、如权利要求4或5所述的应用，其中所述的多核苷酸序列包含于载体中；所述的载体优选为质粒或病毒；所述的病毒优选为腺病毒。7、一种载体，其包含如权利要求2所述的多核苷酸序列；所述的载体优选为质粒或病毒；所述的病毒优选为腺病毒。8、一种用于治疗和/或抑制肿瘤的药物组合物，该药物组合物含有权利要求1所述的蛋白或其免疫片段或权利要求2所述的多核苷酸序列或如权利要求7所述的载体，和一种或多种药用赋形剂或药用载体。9、检测权利要求1所述的蛋白或其免疫性片段或权利要求2所述的多核苷酸序列的表达的试剂在制备用于检测肿瘤的组合物中的应用。10、如权利要求9所述的应用，其中所述的试剂为抗体、反义RNA或小干扰RNA。全文摘要本发明涉及一种新的肿瘤抑制基因或蛋白及其应用，特别是涉及CMTM8或其可变剪切体CMTM8-v2的基因或蛋白或它们的免疫性片段、CMTM8或CMTM8-v2或它们的免疫性片段在诱导细胞凋亡中的应用或在制备治疗和/或抑制肿瘤的药物中的应用、包含CMTM或CMTM8-v2的载体或药物组合物，以及检测CMTM8或CMTM8-v2或它们的免疫性片段的表达的试剂的应用。文档编号C07K14/435GK101148472SQ20071015404公开日2008年3月26日申请日期2007年9月13日优先权日2006年9月13日发明者宋泉声,丹李,应王,靳彩宁,韩文玲,马大龙申请人:北京大学