专利名称：一种检测2型糖尿病易感基因18个位点突变的基因芯片的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因芯片检测领域，具体涉及一种快速检测2型糖尿病易感基因多个位点突变的基因芯片，位点涵盖目前明确与2型糖尿病相关易感基因。
背景技术：
糖尿病是一种由胰岛素分泌缺陷和/或胰岛素作用障碍所致的复杂代谢性疾病， 发病率逐年上升，我国的糖尿病发病人数位居世界第二，其中90%为2型糖尿病，且发病年 龄趋向年轻化。持续高血糖所引发的慢性并发症已成为肾功能衰竭、失明和心脑血管疾病 的主要原因，给个人、社会和国家医疗保健带来了沉重的负担，成为全球性的社会卫生和经 济问题。由于T2DM具有家族性特征，且不同种族间发病率存在明显差异，另外同卵双生和 异卵双生个体发病率和病情也不同，因此遗传成分在该病的发病中起重要作用。因此，通过 连锁或关联分析确定糖尿病的易感或致病基因，对于从基因角度阐释糖尿病发病机制有重 要意义。基因芯片是近年来兴起的一项重要生物技术，越来越多地应用于基因多态性分 析和诊断[1][2]。随着基因芯片技术的发展，到2007年[3]用全基因组SNP基因芯片进行 糖尿病易感基因筛查的研究迅速增多，Diabetes Gene DiscoveryGroup[4]，Finland-US Investigation of NIDDM Genetics (FUSION)[5]，deC0DEGenetics[6]，DiaGenm 等研究使 用 Illumina 100K 或 Illumina 300KSNP 基因芯片，Diabetes Genetics Initiative , Wellcome Trust Case Control Consortium ,Pima[10], Starr County, Texas[11], Old Order Amish[12],Framingham Health Study[13]等研究使用 Affymetrix 100K 或 Affymetrix 500K 芯片，Japanese multi-disease collaborativegenome scan[14]使用 JSNP Genome Scan IOOK SNP 芯片，BioBank Japan[15]使用定制的 268K SNP 芯片。这些研究中发现了许多新的易感基因位点与2型糖尿病有关，总结目前已发现的 与2型糖尿病有关的易感基因位点(risk variants)主要有以下几类(1)通过候选基因关联分析(candidate-gene associations)确定的易感基 因位点Prol2Ala位于过氧化物酶体增殖活化受体gamma基因(PPARG，peroxisome proliferator-activated receptor gamma)，该石马 thiazolidinedione @月夷岛素ii1 敏剂的靶点。Glu23Lys位于内向整流型钾离子通道亚家族J基因(KCNJll，the potassium inwardly rectifying channel, subfamily J, member 11)该基因编码磺脲类降糖药的革巴 点ο(2)通过基于微卫星多态性关联分析确定的易感基因位点rs7903146位于 TCF7L2基因内含子区，该基因编码Wnt信号通路中一种重要的转录因子。该位点在目前所 有已知2型糖尿病相关的易感基因中效应最强。(3)通过大规模候选通路研究确立的易感基因位点rsl0010131位于 WFSl (Wolfram syndrome 1)基因内含子外显子交界，该基因可能参与调解beta细胞功能。 rs757210位于HNFlB (肝细胞核因子1B)基因内含子区，该基因与胰岛发育和功能有关。
(4)通过全基因关联分析确定的易感基因位点rs8050136位于FTO基因内含子 区；rslll875 位于 HHEX/IDE(hematopoietically expressed homeobox[HHEX]/insulin degrading enzyme) SESTffif 7. 7kb^h ；rs7754840^TCDKALl (CDK5 regulatory subunit associated protein 1-like 1)基因内含子区；rs4402960 位于 IGF2BP2 (insulin-like growth factor 2 mRNA binding protein 2)基因内含子区；rsl0811661 位于 CDKN2A/ B (cyclin-dependent kinase inhibitors 2a and 2b)基因上訪,125kb 处；rsl3266634 编 码 SLC30A8 (solute carrier family 30, member 8)基因 R325W 突变。(5)通过对全基 因组关联分析进行meta分析确定的易感基因位点rsl0923931 位于N0TCH2 (Notch homologue 2，Drosophila)基因内含子区，该基因参与胰腺发育； rs4607103 ^ T ADAMTS9(ADAM metallopeptidase withthrombospondin type 1 motif 9)基因上游 38kb 处；rsl2779790 临近 CAMKlD(calcium/calmodulin—d印endent protein kinase ID)基因；rs864745 位于 JAZFl (juxtaposed with another zinc finger gene 1)基因内含子区；rs7961581 位于 TSPAN8/LGR5 (tetraspanin 8 (TSPAN8)/leucine-rich repeat-containing G-proteincoupled(LGR5)) ■ @ 内 ^·〒 IK ；rs7578597 IS 码 THADA (thyroid adenomaassociated) ·@Τ1187Α，$。如何高通量简便快速的对这些已知易感基因位点进行分型，对于验证不同人群这 些位点相关性差异，或重复关联分析结果，即(implication studies)有重要意义。并且 对大样本人群进行这些位点分型，可判断通过这些位点从基因角度预测2型糖尿病的效能 (Meigs, J. B. , Prediction of type 2 diabetes :the dawn ofpolygenetic testing for complex disease. Diabetologia, 2009. 52 (42) :p. 568-570.)。例如 Valeriya Lyssenko 等(Narayan, K. Μ. V. and Μ. B. Weber, Clinical Risk Factors, DNA Variants, and the Development of Type 2 Diabetes. New England Journal ofMedicine,2009. 360(13) p. 1360-1360.)对 16，061 名瑞典人和 2770 芬兰人分析 16 种 SNP(TCF7L2 (rs7903146)， KCNJll (rs5219)，PPARG (rsl801282)，CDKALl (rs7754840)，IGF2BP2 (rs4402960)，CDKN2A/ CDKN2B(rsl0811661)，FTO (rs9939609)，HHEX (rs1111875)，SLC30A8 (rsl3266634)， WFSl (rsl0010131) , JAZFl (rs864745)，CDC123/CAMK1D(rsl2779790)，TSPAN8/ LGR5(rs7961581), THADA(rs7578597), ADAMTS9(rs4607103), and N0TCH2(rsl0923931).) 基因型，以检测这些易感基因位点预测2型糖尿病的效能，发现在常规易感因素上，加入 易感基因信息，可提高预测效能(加入易感基因信息后，ROC曲线下面积AUC由0. 74升为 0. 75，P= 1. OXliT4)。Lango 等(Lango，H. ,et al. ,Assessing thecombined impact of 18 common genetic variants of modest effect sizes on type 2diabetes risk. Diabetes, 2008. 57 (11) :p. 3129-35.)对2，598名对照和2，309名2型糖尿病患者分析18种SNP分型 发现，以携带10-12个易感等位基因组为基准，携带彡25个等位基因组OR为4. 2 (95% CI 2. 11-8. 56)。提示携带大量易感等位基因个体患病可能性更大。对传统的糖尿病易感基因检测方法主要包括PCR-RFLP、AS-PCR和DNA测序方法 等，这些方法在基因突变检测中起了重要作用，但普遍存在着明显的不足，传统的糖尿病易 感基因检测方法主要包括PCR-RFLP、AS-PCR和DNA测序方法等，这些方法在基因突变检测 中起了重要作用，但普遍存在着明显的不足，诸如检测基因位点有限、耗时长、操作繁琐等， 不适用于大批量、系统检测，给糖尿病的临床诊断带来困难。
PCR-RFLP方法是经典的生物学方法，但由于限制性内切酶识别位点有限，难以实 现同时检测多个位点，且耗时较长；AS-PCR方法虽能准确检测突变，但要求扩增条件非常 优化，且引物要有高度的特异性，否则易出现假限性或假阳性结果；DNA测序虽是目前公认 的检测新突变的金标准，但由于其对特殊结构DNA序列无法测序，而且只有异质性水平> 25%时才能检出，而临床常用标本外周血白细胞中异质性水平通常都达不到这个标准，因 此很易漏检。目前常用的SNaPshot和Sequenom技术，应用成本高，则需要购买昂贵的专门设 备。本课题组采用定制基因芯片技术，通过自动化基因芯片点样仪将预先合成的探针点样 于醛 基修饰的玻璃载片上，构成专门针对2型糖尿病大样本关联分析用的基因芯片，为检 测该芯片检测的准确性和重复性，本发明对外周血样本应用该芯片进行检测，并测序验证 芯片检测结果，芯片检测结果与测序结果相符。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测2型糖尿病易感基因18个位点突变的基因芯片。本发明的另一个目的在于提供一种包括上述基因芯片的试剂盒。为实现上述目的，本发明首先提供一种检测2型糖尿病18基因位点突变的基因芯 片，其包括固定在固相载体上的用于检测2型糖尿病易感基因的特异性寡核苷酸探针，其 核苷酸序列如SEQ ID No. 1 36所示。所述固相载体优选为醛基玻片。所述探针5’端有 15个多聚T，5’端经修饰氨基基团后固定在醛基玻片上。上述基因芯片点阵布控为玻璃芯片为117个样点组成的10行X 12列的矩阵见 附图1，包括质控系统和检测系统，质控系统为(1)芯片阳性对照，为SEQID No. 1 14探 针的等量混合的溶液，设计布控于左下角，作为阳性对照点，共3个阳性对照样点；(2)芯片 平行对照，采用25uM的探针溶液点样，每种探针平行点3个点(3个重复)，即每3个点检测 一个等位基因型；左右共6个点，共同构成一个基因位点检测区；(3)芯片阴性对照，为点样 溶液以及双蒸水，各三个点，共6个阴性对照样点，位于右下角。本发明还进一步提供所述基因芯片的制备方法，其包括如下步骤合成SEQID No. 1 36所示的探针，探针在合成时5’端多合成15个多聚T，并经氨基基团修饰，将修饰 后的探针用TE Buffer制成50uM的溶液，点样前按1 1比例与点样溶液混合，终浓度为 25 μ M ；将玻片醛基化修饰；将终浓度为25 μ M的探针溶液按点样矩阵排列在96孔板；PBS 溶液清洗点样仪点样针，校正，按图1矩阵点样；预点20次，点间间距200um，室温水合固定 24h。在固定后按下述步骤进行洗涤室温下2XSSC-0. 1% SDS洗涤液中上下提放2-3次， 1XSSC-0. 1% SDS洗涤液中上下提放2min，0.2 X SSC洗涤液中上下提放2min，双蒸水中抽 提2-3次，离心甩干。进一步，本发明还提供一种含有上述基因芯片的检测试剂盒，其还包括用于扩增 易感基因位点所在区域的引物，引物序列为SEQ ID No. 37 72所示的寡核苷酸，所扩增区 域为SEQ ID No. 73 90所示。此外其还可以包括以下试剂中的一种或多种杂交液、封闭液、PCR缓冲液、 dNTPs、DNA聚合酶以及MgC12。具体地，为实现上述目的，本发明采用以下技术步骤
(1)通过对2型糖尿病易感基因位点突变进行筛选，应用Primer3.0(http:// frodo. wi. mit. edu/primer3/)禾口 NCBI BLAST (http //blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast. Cgi)辅助设计相关探针和引物，使目的片段扩增、杂交反应能在同一条件下进行。其核苷 酸序列如SEQ ID N o. 1 72所示。这些探针分为易感位点检测探针和非易感位点检测探 针，对下述 SNP 位点rsl801282、rs5219、rs7903146、rsl0010131、rs757210、rs4430796、 rs8050136、rsllll875、rs7754840、rs4402960、rsl0811661、rsl3266634、rsl0923931、 rs4607103、rs7578597、rs864745、rsl2779790、rs7961581 (具体如表 1 所示)。(2)芯片点阵布控玻璃芯片为117个样点组成的10行X 12列的矩阵，包括质控 系统和检测系统，质控系统为(1)芯片阳性对照，为所选的各寡核苷酸探针的等量混合的 溶液(SEQ ID No.l 36)，设计布控于左下角，共3个阳性对照样点；(2)芯片平行对照， 采用25uM的探针溶液，各位探针平行点3个点，即每3个点检测一个等位基因型；左右共 6个点，共同构成一个基因位点检测区；(3)芯片阴性对照，为点样溶液(Micro Spotting Solution Plus 2X，Telechem)以及双蒸水，各三个点，共6个阴性对照样点，位于右下角， 探针具体排布见图1。(3)包括玻片醛基修饰，点样，固定，DNA模板提取，PCR扩增和标记，杂交，洗涤，荧 光检测在内的多种复杂反应。(4)荧光信号检测，通过ScanAlyze软件分析各点荧光强度，通过易感位点和非易 感位点荧光信号强度步骤，确定基因型。一种检测2型糖尿病18个易感基因位点的微阵列芯片制备步骤是(1)以醛基玻片为载体玻片经铬酸洗液浸泡过夜，去除表面有机物等杂质，然后蒸馏水清洗，再用25%氨 水浸泡过夜，水洗。pH为4. 5氨丙基三甲氧基硅烷的95%乙醇浸泡20min，再用95%乙醇 超声清洗，纯水超声清洗，115°C烘烤45min，最后在5 %的戊二醛溶液中50min，超声IOmin， 水洗两次，置于室温干燥备用。(2)探针和引物设计本发明研制的微阵列芯片可检测目前国内外报道的与2型糖尿病相关的18 个易感基因位点。应用 Primer3. 0 (http//frodo. wi. mit. edu/primer3/)和 NCBI BLAST (http://blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)辅助设计相关探针和引物，设计探针 36条，退火温度为58士2°C ；以及扩增相应片段的18对引物。位点涵盖了目前明确的与2 型糖尿病相关的易感位点。(3)芯片点阵布控玻璃芯片为117个样点组成的10行X 12列的矩阵，包括质控系统和检测系统， 质控系统为(1)芯片阳性对照，为所选的各寡核苷酸探针的等量混合的溶液(SEQ ID No. 1 36)，设计布控于左下角，共3个阳性对照样点；(2)芯片平行对照，采用25uM的探针 溶液，各位探针平行点3个点，即每3个点检测一个等位基因型；左右共6个点，共同构成一 个基因位点检测区；(3)芯片阴性对照，为点样溶液(Micro Spotting Solution Plus 2X， Telechem)以及双蒸水，各三个点，共6个阴性对照样点，位于右下角，探针具体排布见图1。(4)芯片的点样，固定和洗涤将终浓度为25 μ M的探针溶液按点样矩阵(点样矩阵排布见图1)排列在96孔板；PBS溶液清洗点样仪(SpotBot3，Telechem)点样针，校正，按图1矩阵点样；预点20次，点间间距200um，室温水合固定24h。所述芯片洗涤过程为室温下2XSSC-0. 1% SDS洗涤液 中上下提放2-3次，1XSSC-0. 1% SDS洗涤液中上下提放2min，0. 2X SSC洗涤液中上下提 放2min，双蒸水中抽提2-3次，离心甩一种检测2型糖尿病18个易感基因位点的微阵列芯片检测步骤是(1)收取病人标本，提取DNA模板。(2)采用SEQ ID No. 37 72所示引物，扩增目的片段。PCR反应液是由 10Xbuffer,10ymol/L 的正向引物，lOymol/L 反向弓丨物，25mmol/L MgCl2, IOmmol/ LdNTPs (含0. 5nM Cy3_dCTP，由Amersham公司提供)和无菌双蒸水组成。扩增条件为95°C 预变性3min, 35个循环(94°C变性30s, 55°C退火30s, 72°C延伸30s)，72°C延伸7min。(3斤0 产物1001变性，骤冷。(4) 42°C预杂交30min封闭非特异性结合；预加热变性的Cy3_DNA与杂交液(DIG Easy Hyb，R0Che)按1 10混勻，42°C杂交4h，每个样本同时用两个相同矩阵重复检测。(5)室温下2XSSC-0. 1% SDS洗涤液中上下提放2-3次，1XSSC-0. 1% SDS洗涤 液中上下提放2min，0. 2 X SSC洗涤液中上下提放2min，双蒸水中抽提2_3次，离心甩干。(6) LuxScan 10K-A (CapitalBio, Beijing)芯片扫描仪在 570nm 波长采集芯片图 像(分辨率10um，激光器功率95%，PMT增益650)。所得结果通过ScanAlyze软件分析， 获得芯片分析数据。根据荧光信号强度比值(易感等位基因各点荧光强度均值/非易感等 位基因各点荧光强度均值，具体分析方法同ScanAlyze软件手册介绍)，若比值大于3则判 为易感等位基因纯合型，在0. 3以下非易感等位基因纯合型，介于0. 3-3之间，判为杂合型。 (比值衡量标准参考Du W,Marsac C,Kruschina M,Ortigao F,Florentz C. Functionalized self-assembled monolayer ongold for detection of human mitochondrial tRNA gene mutations. Anal Biochem. 2003 Nov 1；322(1) 14-25.)(7)该芯片具有下优点①一张芯片可同时检测1-5份不同标本的18个易感基 因位点；②操作简单，标记扩增同步完成，在保证目的片段丰度同时，完成标记反应，无需显 色；③可检测目前已明确的18个易感基因位点，无漏检和误诊。④根据野生型和突变型荧 光强度比值，以及背景信号强度，判断被检位点基因型，结果科学客观。各位点片内平行对 照点间荧光强度一致性好，变异系数小于6. 4%，片间同位点间变异系数小于8. 63%，检测 结果假阳性率为2. 65%，假阴性率为0. 76% ；⑤成本低，反应体系微量，一次杂交反应体系 为100微升。发明的优点和效果本发明研制了一种快速检测18个2型糖尿病相关位点的微阵列芯片。该芯片可 ①18对引物扩增和Cy3荧光染料标记可在同一条件下进行，在保证后续反应所需DNA量的 同时完成标记，省时并降低了实验成本。②Cy3荧光染料标记，洗片后可直接荧光扫描仪观 察结果，无需显色，根据两种探针杂交信号强弱，可判定被测位点基因型，省时。③探针退 火温度为58士2°C，在42°C杂交可获得满意的杂交效果；④芯片包含检测系统和质控系统 两个体系，可系统检测2型糖尿病相关18个易感基因位点，并有质量控制；位点涵盖了目 前已确定的与2型糖尿病易感基因明确相关的基因位点。相对于目前常用的SNaPshot和 Sequenom技术，该芯片方法不需要特殊的昂贵仪器，实验室常规的荧光显微镜即可进行检测。该芯片适用于大样本低成本2型糖尿病易感基因关联分析。
图1为2型糖尿病易感基因18个位点突变位点检测微阵列芯片点样矩阵图，其 中·为阳性对照；〇为阴性对照(双蒸水)； 为点样液对照(点样溶液Micro Spotting Solution Plus 2X，Telechem) ；◎为非易感等位基因检测探针；Θ为易感等位基因检测探 针；图2为Cy3标 记18个突变位点检测微阵列玻璃芯片检测结果，同一标本平行做两 矩阵重复对照。图3为微阵列芯片检测的18个易感基因位点测得基因型测序验证结果图。
具体实施例方式以下通过具体实施例来进一步说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特 别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1探针和引物设计本发明通过对2型糖尿病易感基因位点突变进行筛选，设计相关探针，经过反复 试验筛选和验证，得到了一组杂交特异性高准确度好的探针，探针序列如表1所示。表1 18个位点野生型和突变型探针序列
权利要求
一种检测2型糖尿病18基因位点突变的基因芯片，其包括固定在固相载体上的用于检测2型糖尿病易感基因的特异性寡核苷酸探针，其核苷酸序列如SEQ ID No.1~36所示。
2.根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于，所述固相载体为醛基玻片。
3.根据权利要求2所述的基因芯片，其特征在于，所述探针5’端有15个多聚T，5’端 经修饰氨基基团后固定在醛基玻片上。
4.根据权利要求1-3所述基因芯片，其特征在于，该基因芯片点阵布控玻璃芯片为 117个样点组成的10行X 12列的矩阵，包括质控系统和检测系统，质控系统为(1)芯片阳 性对照，为SEQ ID No.广36探针的等量混合的溶液，作为阳性对照点，设计布控于左下角， 共3个阳性对照样点；(2)芯片平行对照，采用25uM的探针溶液点样，每种探针设置平行 点3个点，即每3个点检测一个等位基因型；左右共6个点，共同构成一个基因位点检测区； (3)芯片阴性对照，为点样溶液以及双蒸水，各三个点，共6个阴性对照样点，位于右下角。
5.权利要求广4任一项所述基因芯片的制备方法，其包括如下步骤合成SEQID No.广36所示的探针，探针在合成时5’端多合成15个多聚T，并经氨基基团修饰，将修饰后 的探针用TE Buffer制成50uM的溶液，点样前按1 1比例与点样溶液混合，终浓度为25 mM ；将玻片醛基化修饰；将终浓度为25mM的探针溶液按点样矩阵排列在96孔板；PBS溶液 清洗点样仪点样针，校正，按图1矩阵点样；预点20次，点间间距200um，室温水合固定24h。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，其还包括在固定后按下述步骤进行洗涤 室温下2XSSC-0. P/oSDS洗涤液中上下提放2-3次，1XSSC-0. 1% SDS洗涤液中上下提放 2min, 0. 2 X SSC洗涤液中上下提放2min，双蒸水中抽提2_3次，离心甩干。
7.含有权利要求广4任一项所述基因芯片的试剂盒。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其还包括用于扩增易感基因位点所在区域的引物， 引物序列为SEQ ID No. 37 72所示的寡核苷酸，所扩增区域为SEQ ID No. 73 90所示。
9.根据权利要求7或8所述的试剂盒，其包括以下试剂中的一种或多种杂交液、封闭 液、PCR缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶以及MgCl2。
全文摘要
本发明公开了一种检测2型糖尿病易感基因18个位点突变的基因芯片。该芯片以固定在固相载体上的SEQIDNo.1~36所示的探针作为检测系统，并进一步包括阳性对照、阴性对照和平行对照组成质控系统包。本发明还同开了该基因芯片检测的配套引物，这些引物可在同一退火温度进行PCR反应，扩增同时完成Cy3标记，经过1次杂交反应，即可检测18个基因位点。检测结果准确、快速、效率高，能够系统地筛选目前国内外报导的2型糖尿病易感基因18个位点突变，适用于大样本低成本2型糖尿病易感基因关联分析。
文档编号G01N21/64GK101956017SQ20101051827
公开日2011年1月26日 申请日期2010年10月22日 优先权日2010年10月22日
发明者丁峰, 刘松梅, 周新, 梁纯子, 王春芳, 袁媛, 谢焱, 邓冠华, 郑璇, 马海波 申请人:广州阳普医疗科技股份有限公司;武汉大学