2型糖尿病易感位点rs2241766的检测方法及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种检测2型糖尿病易感位点的方法及试剂盒，所述方法包括步骤：(1)提取样品的基因组DNA，扩增样品的脂联素基因中包含rs2241766位点的区域，得到扩增产物；(2)使用HRM分析技术检测扩增产物中SNP位点rs2241766的基因型。采用HRM分析技术对扩增后的脂联素基因中包含rs2241766位点的区域进行基因型分析，该方法操作简单、快速，使用成本低，结果准确，可以实现批量检测；使用上述试剂盒可以清晰的判断受检人群是否携带2型糖尿病易感基因，将2型糖尿病易感人群从人群中筛选出来，改变不良的生活习惯，达到预防的目的。
【专利说明】2型糖尿病易感位点rs2241 766的检测方法及试剂盒 【【技术领域】】
[0001] 本发明涉及一种检测2型糖尿病易感性的方法及试剂盒，更具体的说是通过测定 与2型糖尿病相关基因脂联素基因的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP)预测受试者对于2型糖尿病的易感性，该方法可用于疾病的辅助诊断、治疗和新药开 发，属于分子生物学和医学领域。 【【背景技术】】
[0002] 2型糖尿病是成人发病型糖尿病，多在35-40岁之后发病，占糖尿病患者90%以 上。病友体内产生胰岛素的能力并非完全丧失，有的患者体内胰岛素甚至产生过多，但胰岛 素的作用效果却大打折扣，因此患者体内的胰岛素是一种相对缺乏。
[0003] 2型糖尿病有更强的遗传性和环境因素，并呈显著的异质性。目前认为发病原因是 胰岛素抵抗（主要表现为高胰岛素血症，葡萄糖利用率降低）和胰岛素分泌不足的合并存 在，其表现是不均一的，有的以胰岛素抵抗为主伴有胰岛素分泌不足，有的则是以胰岛素分 泌不足伴有或不伴有胰岛素抵抗。
[0004] 2型糖尿病的发现一般较缓慢而隐袭，有的以慢性并发症来就诊而被发现，多较轻 或无症状，80 %患者超重或肥胖，老年人在诱因下易患非酮症高渗性糖尿病昏迷，慢性并发 症以大血管并发症为主，病情相对稳定。治疗以饮食治疗和口服药物治疗为主。
[0005] 近年来，单核苷酸多态性（SNP)和单倍型（haplotype)在多基因疾病研究中的广 泛运用，为在分析水平上研究2型糖尿病的发生和发展的机制开辟了全新的思路。同时，高 通量、低成本的SNP检测手段的不断出现也为SNP大规模快速分型提供了可能。然而，现有 检测2型糖尿病易感性的方法均存在或者准确率低、或者成本高、或者难以实现批量生产 等不足。
[0006] 因此，有必要提出一种新的检测方法以解决上述问题。 【
【发明内容】
】
[0007] 本发明的主要目的是提供一种辅助诊断2型糖尿病的方法，该方法操作简单、快 速，使用成本低，结果准确，可以实现批量检测。
[0008] 本发明的另一目的是提供一种用于检测2型糖尿病易感位点的试剂盒，该试剂盒 包括PCR引物及含有该引物的试剂盒，其可以实现扩增与HRM分析。
[0009] 为了解决上述问题，本发明采用的技术方案是：一种检测2型糖尿病易感位点的 方法，包括步骤：（1)提取样品的基因组DNA，扩增样品的脂联素基因中包含rs2241766位点 的区域，得到扩增产物；（2)使用HRM分析技术检测扩增产物中SNP位点rs2241766的基因 型。
[0010] 进一步的，脂联素基因的rs2241766位点的基因型带有G时，该脂联素基因所属样 品的测试者对于2型糖尿病的易感性高于基因型没有G的测试者。
[0011] 进一步的，使用特异性引物扩增样品的脂联素基因中包含rs2241766位点的区 域，该特异性引物是指针对脂联素基因上rs2241766号SNP位点而设计，能特异性扩增出包 含上述SNP位点的DNA片段的引物对。
[0012] 进一步的，所述特异性引物具有SEQ ID N0 :2和SEQ ID N0 :3所示的核苷酸序列。
[0013] 进一步的，使用HRM分析技术直接检测扩增后包含上述SNP位点的DNA片段的引 物对的基因型。
[0014] 进一步的，将扩增后包含上述SNP位点的DNA片段的引物对转移至分析装置，然后 使用HRM分析技术对该引物对的基因型进行分析。
[0015] 进一步的，所述2型糖尿病易感位点的检测方法在体外非诊断性检测2型糖尿病 易感性方面的应用。
[0016] 为了解决上述问题，本发明采用的另一技术方案是：一种用于检测2型糖尿病易 感位点的试剂盒，对脂联素基因中包含rs2241766位点的区域进行扩增及HRM技术分析。
[0017] 进一步的，所述试剂盒包括特异性扩增脂联素基因中包含rs2241766位点的区域 的特异性引物。
[0018] 进一步的，所述特异性引物具有SEQ ID N0 :2和SEQ ID N0 :3所示的核苷酸序列。
[0019] 进一步的，试剂盒的组分及含量包括5ul2X LightCycler480High Resolution Melting Master Mix、1.2ul25mM MgC12 溶液、lul2 μ M Primer Mix、lul5ng/μ 1 左右 DNA、 1.8ul H20、具有SEQ ID N02和SEQ ID N03所示的核苷酸序列的特异性引物。
[0020] 进一步的，所述试剂盒在检测2型糖尿病易感性方面的应用。
[0021] 与现有技术相比较，本发明具有以下优点：采用HRM分析技术对扩增后的脂联素 基因中包含rs2241766位点的区域进行基因型分析，该方法操作简单、快速，使用成本低， 结果准确，可以实现批量检测。 【【专利附图】
【附图说明】】
[0022] 图1是脂联素基因 rs2241766位点基因型的HRM检测结果；
[0023] 图2是测序结果截图，显示了 rs2241766的一种SNP基因型的探针分型结果。 【【具体实施方式】】
[0024] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验 方法，通常按照常规条件如Sambrook等人、分子克隆、实验室手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照厂商所建议的条件。
[0025] 本发明提供了一种检测2型糖尿病易感位点的方法及试剂盒，所述方法包括步 骤：⑴提取样品的基因组DNA，扩增样品的脂联素基因中包含rs2241766位点的区域，得到 扩增产物；（2)使用HRM分析技术检测扩增产物中SNP位点rs2241766的基因型。该2型 糖尿病易感位点的检测方法及试剂盒亦可用于检测2型糖尿病的易感性。
[0026] 在本发明中，脱氧核糖核酸（DNA)序列编号：rs2241766位置基于SEQ ID N0 :1所 示的核苷酸序列；引物1基于SEQ ID N0 :2所示的核苷酸序列；引物2基于SEQ ID N0 :3 所示的核苷酸序列；扩增产物3基于SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列。
[0027] 经过多年研究证明了脂联素基因单核苷酸多态性位rs2241766与2型糖尿病密切 相关，而且发现了它的新功能：脂联素基因中基因型的改变将导致2型糖尿病的发病风险 升高，其中关联研究结果显示，在脂联素基rs2241766T - G在病例和对照组中的分布存在 显著性差异，该SNP多态性可改变转录因子结合位点。
[0028] 检测可以针对基因组DNA，也可针对脂联素基因的扩增片段。脂联素基因的 rs2241766的基因型也可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交 检测突变。
[0029] 实施例1 :突光PCR检测
[0030] 一、实验材料
[0031] 荧光定量PCR，聚合酶链反应液
[0032] 二、引物及探针设计与合成：
[0033] 以脂联素基因的部分序列为模板，使用Primer Premierf软件分析引物，并由上海 生工生物工程有限公司定制合成。
[0034] 检测用引物：
[0035] 脂联素基因 rs2241766上游引物序列：5'-
[0036] CTGTTGCTGGGAGCTGTTCTA-3， （SEQ ID N02)
[0037] 脂联素基因 rs2241766下游引物序列：5'-
[0038] GGCCCTTGAGTCGTGGTTT-3; (SEQ ID N03)
[0039] 三、样本检测：
[0040] 实验共检测50例2型糖尿病病例和50例正常对照人群，每例收集血样标本约 2ml，用酚/氯仿抽屉基因组DNA，抽提结果用微量紫外/可见光分光光度计（INFINIGEN公 司）检测。
[0041] 按如下体系进行突光PCR扩增，最后用roche lc480softwarel. 5扫描并聚类分析
[0042]
【权利要求】
1. 一种2型糖尿病易感位点的检测方法，其特征在于：包括步骤： (1) 提取样品的基因组DNA，扩增样品的脂联素基因中包含rs2241766位点的区域，得 到扩增产物；和 (2) 使用高分辨烙解曲线（high-resolution melt，HRM)分析技术检测扩增产物中单 核苷酸多态性（SNP)位点rs2241766的基因型。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于：脂联素基因的rs2241766位点的基因型带 有G时，该脂联素基因所属样品的测试者对于2型糖尿病的易感性高于基因型没有G的测 试者。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于：使用特异性引物扩增样品的脂联素基因中 包含rs2241766位点的区域，该特异性引物是指针对脂联素基因上rs2241766号SNP位点 而设计，能特异性扩增出包含上述SNP位点的DNA片段的引物对。
4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述特异性引物具有SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列。
5. 如权利要求3所述的方法，其特征在于：使用HRM分析技术直接检测扩增后包含上 述SNP位点的DNA片段的引物对的基因型。
6. 如权利要求3所述的方法，其特征在于：将扩增后包含上述SNP位点的DNA片段的 引物对转移至分析装置，然后使用HRM分析技术对该引物对的基因型进行分析。
7. -种用于检测2型糖尿病易感位点的试剂盒，其特征在于：对脂联素基因中包含 rs2241766位点的区域进行扩增及HRM技术分析。
8. 如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括特异性扩增脂联素基因 中包含rs2241766位点的区域的特异性引物。
9. 如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述特异性引物具有SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列。
10. 如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于：试剂盒的组分及含量包括5ul2X LightCycler480High Resolution Melting Master Mix、1.2ul25mM MgC12 溶液、lul2 μ Μ Primer Mix、lul5ng/yl 左右 DNA、1.8ul H20、具有 SEQ ID N02 和 SEQ ID N03 所示的核苷 酸序列的特异性引物。
【文档编号】C12Q1/68GK104059991SQ201410331667
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年7月10日 优先权日:2014年7月10日
【发明者】黄迅威, 张天竹, 沈玲宇, 邵敏华 申请人:光瀚健康咨询管理(上海)有限公司