2型糖尿病易感基因位点及检测方法和试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及2型糖尿病易感基因位点及检测方法和试剂盒。具体地，本发明公开了基于全基因组关联分析研究而发现的2型糖尿病易感基因位点。本发明还提供了一种检测2型糖尿病易感性的方法，它包括检测个体的GRK5基因和RASGRP1基因、转录本和/或蛋白与正常相比是否存在变异，存在变异就表明该个体患2型糖尿病的可能性大于正常人群。本发明还公开了相应的检测试剂盒。
【专利说明】2型糖尿病易感基因位点及检测方法和试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学和医学领域。更具体地涉及GRK5基因和RASGRP1基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)及其与2型糖尿病的相关性。本发明还涉及检测这些SNP的方法和试剂盒。
【背景技术】
[0002]糖尿病是一组以 糖代谢异常为特征的由不同病理生理改变组成的综合征，不同患者之间具有较大的异质性，而其主要的两种病理生理改变为胰岛素分泌不足和胰岛素抵抗。
[0003]现在约有九千两百万成年人患有2型糖尿病。虽然营养状况和生活方式的改变、 肥胖发病率的增加等是导致2型糖尿病发病率增加的重要因素，遗传因素同样有着不可或缺的作用。在过去几十年里，中国的2型糖尿病发病率显著升高。研究表明，包括中国汉族人群在内的东亚人群，其2型糖尿病的遗传易感性高于西方人群。
[0004]虽然已开展了一些2型糖尿病相关基因及多态性的研究，过去几年对2型糖尿病的相关风险位点已经有很多重要的研究发现，但是对于不同种族人群的2型糖尿病发病的遗传背景了解尚浅。
[0005]近年来，单核苷酸多态性(SNP)和单倍型(haplotype)在多基因疾病研究中的广泛运用，为在分子水平上研究2型糖尿病的发生和发展的机制开辟了全新的思路。同时，高通量、低成本的SNP检测手段的不断出现也为SNP大规模快速分型提供了可能。
[0006]SNP的存在与否以及等位基因频率存在人种及地域的差异，这就提示多基因疾病遗传异质性的存在，即同一疾病或性状在不同的人群中可能是不同的遗传因素造成的。
[0007]在欧美人群和部分亚洲人群中开展的2型糖尿病全基因组关联分析研究(GWAS) 已经发现50多个2型糖尿病易感基因位点。然而这些易感基因的危险等位基因的效应值均很小，其总体效应值仅仅解释2型糖尿病遗传力的10~15%。
[0008]虽然已有许多关于各种基因多态性与2型糖尿病的研究，但没有证实GRK5基因或 RASGRPI基因与2型糖尿病相关性的报道，更没有证实本发明所述的GRK5基因或RASGRP1 基因SNP与2型糖尿病相关性的报道。
[0009]综上所述，鉴于糖尿病严重影响人们身体健康的疾病，为了尽早诊断和治疗2型糖尿病，本领域迫切需要寻找2型糖尿病易感基因(尤其是与中国汉族人群相关的2型糖尿病易感基因位点)，并开发检测2型糖尿病的方法、试剂盒，或相关的治疗药物。
【发明内容】
[0010]本发明的目的就是提供一种辅助诊断(尤其是早期辅助诊断)2型糖尿病的方法及检测试剂盒。
[0011]本发明的另一目的是提供一种新的治疗2型糖尿病的方法。
[0012]在本发明的第一方面，提供了一种体外非诊断性检测样品是否存在GRK5基因或RASGRPI基因的单核苷酸多态性的方法，包括步骤:
[0013](a)用特异性引物扩增样品的GRK5基因或RASGRP1基因，得到扩增产物；和
[0014](b)检测扩增产物中是否存在选自下组的单核苷酸多态性:
[0015]GRK5 基因的 rsl0886471:即 SEQ ID N0.:1 中第 134 位 C — T;
[0016]RASGRP1 基因的 rs7403531:即 SEQ ID N0.: 2 中第 164 位 C — T。
[0017]在另一优选例中，所述的GRK5基因的rsl0886471对应于人第10号染色体的第 121，139，393 位(NCBI36/hgl8)。
[0018]在另一优选例中，所述的RASGRP1基因的rs7403531对应于人第15号染色体的 36，610，197 位(NCBI36/hgl8)。
[0019]在另一优选例中，所述的基因特异性引物具有SEQ ID N0:3和4所示序列、或SEQ ID N0:5和6所示序列。
[0020]在另一优选例中，所述的扩增产物的长度为100_2000bp且含有SEQ ID NO:1中第 134 位或 SEQ ID NO: 2 中第 164 位。
[0021]在本发明的第二方面，提供了一种检测2型糖尿病的试剂盒，它包括特异性扩增 GRK5基因或RASGRPI基因或转录本的引物，所述的引物扩增出长度为100_2000bp且含有 SEQ ID NO:1中第134位或SEQ ID NO: 2中第164位的扩增产物。
[0022]在另一优选例中，所述试剂盒还含有选自下组的试剂:
[0023](a)与SEQ ID NO:1中第134位或SEQ ID NO: 2中第164位的突变结合的探针；
[0024](b)识别SEQ ID NO:1中第134位或SEQ ID NO:2中第164位的突变限制性内切
酶。`
[0025]在另一优选例中，所述的突变是选自下组的单核苷酸多态性:
[0026]GRK5 基因的 rsl0886471:即 SEQ ID N0.:1 中第 134 位 C —T;
[0027]RASGRP1 基因的 rs7403531:BP SEQ ID N0.:2 中第 164 位 C —T。
[0028]在另一优选例中，所述的引物具有SEQ ID N0:3和4所示序列、或SEQ ID N0:5和 6所示序列。
[0029]在本发明的第三方面，提供了一种GRK5基因或RASGRP1基因的用途，用于制备对 2型糖尿病易感性进行诊断的试剂或试剂盒。
[0030]在另一优选例中，所述的试剂或试剂盒用于检测选自下组的单核苷酸多态性:
[0031]GRK5 基因的 rsl0886471:即 SEQ ID N0.:1 中第 134 位 C — T;
[0032]RASGRP1 基因的 rs7403531:即 SEQ ID N0.:2 中第 164 位 C —T。
[0033]在另一优选例中，所述的试剂包括特异性扩增GRK5基因或RASGRP1基因或转录本的引物、含有所述SNP位点的扩增产物、与所述SNP位点特异性结合的探针、特异性检测所述SNP位点的核酸芯片。
[0034]在另一优选例中，所述的试剂盒包括使用说明书以及一种或多种以下试剂:
[0035]容器(a)以及位于所述容器内的特异性扩增GRK5基因或RASGRP1基因或转录本的引物；
[0036]容器(b)以及位于所述容器内的与所述SNP位点特异性结合的探针；
[0037]容器(c)以及位于所述容器内的特异性检测所述SNP位点的核酸芯片。
[0038]在另一优选例中，所述的核酸芯片还包括用于检测额外的糖尿病(尤其是2型糖尿病)易感性位点的检测点。
[0039]在另一优选例中，所述的额外的糖尿病(尤其是2型糖尿病)易感性位点选自下组:
[0040]rs2206734 位点:位于第 6 号染色体第 20，802，863 位 CDKALl 中 A — G ;
[0041]rsl0814916位点:位于第9号染色体第4，283，150位GLIS3基因中C — A ;
[0042]rs2383208位点:位于第9号染色体第22，122，076位CDKN2B基因中A — G ;
[0043]rsl 1257655位点:位于第10号染色体第12，347，900位CDC123基因中T — C ;
[0044]rs2299620位点:位于第11号染色体第2，814，871位KCNQl基因中G — A ;
[0045]rs4430796位点:位于第17号染色体第33，172，153位HNFlB基因中G — A ;
[0046]rsl2010175 位点:位于 X 染色体第 152，515，832 位 FAM58A 基因中 G — A ;
[0047]rs5945326 位点:位于 X 染色体第 152，553，116 位 DUSP9 基因中 A — G。
[0048]在本发明的第四方面，提供了一种多核苷酸分子的用途，所述的分子包括特异性扩增含单核苷酸多态性(SNP)位点的扩增产物的引物和/或与所述SNP位点特异性结合的探针，其特征在于，所述的核苷酸分子用于制备对2型糖尿病易感性进行诊断的试剂盒，并且所述的SNP位点自下组:
[0049]GRK5 基因的 rsl0886471:即 SEQ ID N0.:1 中第 134 位 C — T;
[0050]RASGRPI 基因的 rs7403531:即 SEQ ID N0.:2 中第 164 位 C — T。
[0051]在另一优选例中，所述的SNP位点是GRK5基因的rsl0886471，并且所述的试剂盒
用于检测高空腹胰岛素易感性。
[0052]在另一优选例中，所述的SNP位点是RASGRP1基因的rs7403531，并且所述的试剂盒用于检测高ffiAlc易感性以及低HOMA-B易感性。
[0053]在另一优选例中，所述试剂盒用于检测东亚人群(尤其是中国人群)的2型糖尿病易感性。
[0054]在本发明的第五方面，提供了一种对个体的2型糖尿病易感性进行诊断的方法， 其特征在于，它包括步骤:
[0055]检测该个体的GRK5基因或RASGRP1基因、转录本和/或蛋白，并与正常的GRK5基因或RASGRP1基因、转录本和/或蛋白相比较，
[0056]其中，存在差异就表明该个体患2型糖尿病的可能性高于正常人群。
[0057]在另一优选例中，检测的是GRK5基因或RASGRP1基因或转录本，并与正常核苷酸序列比较差异。
[0058]在另一优选例中，所述的差异是选自下组的单核苷酸多态性:
[0059]GRK5 基因的 rsl0886471:即 SEQ ID N0.:1 中第 134 位 C —T;
[0060]RASGRP1 基因的 rs7403531:即 SEQ ID N0.:2 中第 164 位 C —T。
[0061]应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再累述。
【专利附图】
【附图说明】
[0062]图1显示了研究设计总结。[0063]图2显示了曼哈顿图。表示的是第一阶段的495686个实验基因分型得到的SNP 位点的全基因组关联分析。-1oglO P值是通过合并南北人群分析得出来的，矫正了年龄、性别和前两个主成分。每个等位基因位点上的红点为P值小于10-6的SNP。
[0064]图3显示了新发现的2个2型糖尿病位点的区域作图。(A, B) Imputed SNP位点是通过MACH软件分析获得，采用2010年8月发布的千人基因组计划信息中的194个亚洲人的连锁不平衡(LD)信息作为参考。P值是通过合并南北人群分析得出来的，并且是控制了第一阶段样本中的年龄、性别和前两个主成分。采用LocusZoom软件绘制位于标识SNP500kb 范围内的区域图，并标记出基因组(NCBIBuild 37)位置上相应SNP位点的-1oglOP值。基因位置的注释来自UCSC基因组浏览器的GRCh37。标识SNP为紫色，而其它SNP的颜色是根据千人基因组计划亚洲人群这些SNP与标识SNP的LD(r2)来定的。重组率是用亮蓝色细线表示以反应局部LD的结构。
[0065]图4显示了 GRK5基因连锁不平衡图。蓝色框标识的部分用于比较不同人群LD结构。
[0066]图5显示了 RASGRP1基因连锁不平衡图。蓝色框标识的部分用于比较不同人群LD 结构。(A) RASGRPI基因连锁不平衡图；(B) 4个SNP的r2值:2个2型糖尿病位点(rs7403531 和 rsl2593201)和 2 个 I 型糖尿病位点(rs7171171 和 rsl7574546)。
[0067]图6显示了 GRK5基因的表达分析。其中，人血液中GRK5基因的相对表达水平分别在30个2型糖尿病人(TT/n=3; TC/n=8; CC/n=19)和34个非糖尿病的对照样本(TT/n=2; TC/ n=ll;CC/n=20，l个基因型缺失)中检测分析。显示的数据是均值和误差(土SEM)表示的。 数据分析前对基因GRK5表达水平的值进行自然对数转换。
【具体实施方式】
[0068]本发明人经过深入而广泛的研究，对大量候选基因的SNP进行了测定和分析。首次发现和证明了 GRK5基因或RASGRP1基因组序列与2型糖尿病密切相关，其中关联研究结果显示，在SEQ ID N0:1中第134位(134位C — T)的SNP(记为rsl0886471)和SEQ ID NO: 2中第164位的SNP (记为rs7403531)在对照组和病例组中的分布存在显著性差异 (P〈0.05)，因此可作为辅助性检测2型糖尿病(或其易感性)的特异性SNP。在此基础上完成了本发明。
[0069]具体地，本发明人在8，569名2型糖尿病人和8，923名对照中国汉族人群中开展了全基因组关联和验证研究，并挑选了 10个单核苷酸多态性位点，分别两个人群中验证:在3，410名2型糖尿病人和3，412名对照人群中使用de novo方法验证以及在 6，952名2型糖尿病人和11，865名对照人群中使用in silico方法验证。结果表明，除了成功验证之前确定的7个2型糖尿病位点(CDKAL1, CDKN2A/B, KCNQl, CDC123, GLIS3， HNFlB和DUSP9)并达到全基因水平的显著外，本发明人还新发现了两个2型糖尿病位点，分别为 GRK5 (rs 10886471:P=7.1X 1(T9)，和 RASGRPI (rs7403531:P=3.9X 1(T9)，其中与GRK5的相关性只在东亚人群中显著。在对照人群中，增加2型糖尿病发病风险的位点 RASGRPl-rs7403531 与高 HbAlc 和低 HOMA-B 相关(P 值分别为 0.03 和 0.0209)，而 GRK5-rs 10886471与高空腹胰岛素相关(P = 0.0169)但不与空腹血糖相关。本发明的发现不仅为2型糖尿病的发病机制提供了新的视角，也提示2型糖尿病的易感性可能存在种族差异。
[0070]GRK5 基因
[0071 ] GRK5基因的序列是已知，其详细序列和一些相关彳目息可参见网址http: //www.ncb1.nlm.nih.gov/Genebank/ ；http://www.ncb1.nlm.nih.gov/SNP。为了方便起见，在 SEQ ID NO:1给出GRK5基因中与本发明SNP相关的核苷酸序列。
[0072]GRK5基因位于染色体区域10q26.11，编码G蛋白偶联受体激酶(GPCR kinase)家族成员5，该蛋白在磷酸化G蛋白偶联受体和非G蛋白偶联受体中起重要作用。
[0073]RASGRPI 基因
[0074]RASGRPI基因的序列是已知，其详细序列和一些相关信息可参见网址http:// www.ncb1.nlm.nih.gov/Genebank/ ;http://www.ncb1.nlm.nih.gov/SNP。为了方便起见， 在SEQ ID NO: 2给出RASGRP1基因中与本发明SNP相关的核苷酸序列。
[0075]RASGRPI 基因位于染色体区域 15ql4,编码 RAS guanyl releasing proteinl (RasGRPl)，该蛋白是Ras/MAPK信号通路中的鸟嘌呤核苷酸交换因子。RASGRPI主要在淋巴细胞中表达，在其他细胞包括胰岛P细胞中也有表达。[0076]2型糖尿病易感性相关的SNP
[0077]本发明人通过全基因组关联和验证研究，挑选了 10个单核苷酸多态性位点，分别两个人群中验证。研究表明SEQ ID NO:1中第134位或SEQ ID NO: 2中第164位的SNP是与2型糖尿病易感性关联性非常高的SNP。
[0078]具体而言，本发明揭示了 GRK5基因或RASGRP1基因的单核苷酸多态性(SNP)以及该多态性与2型糖尿病的相关性。
[0079]如本文所用，术语“本发明的单核苷酸多态性SNP”或“本发明SNP”包括:
[0080]GRK5基因的rsl0886471:即SEQ ID N0.:1中第134位C/T多态，等位基因型C 在2型糖尿病病人群中的频率，要显著高于在正常对照人群中的频率；
[0081]RASGRP1基因的rs7403531，即SEQ ID N0.: 2中第164位T/C多态，等位基因型T 在2型糖尿病病人群中的频率，要高于在正常对照人群中的频率。
[0082]基于本发明的新发现，GRK5基因或RASGRP1基因或相应的核酸分子有多方面的新用途。这些用途包括(但不限于):用于辅助性诊断2型糖尿病、或制备用于辅助性诊断2 型糖尿病的试剂或试剂盒。
[0083]检测方法、检测试剂及试剂盒
[0084]与GRK5基因或RASGRP1基因相关的多聚核苷酸可用于2型糖尿病(或与易感性) 的辅助诊断，尤其是早期辅助性诊断。另一方面，本发明的检测方法可用于评估个体患糖尿病疾病(尤其是2型糖尿病)的易感性。
[0085]本领域的技术人员知道，有大量的分析技术可用于检测基因中所述位点是否存在单核苷酸多态性。这些技术包括(但并不限于):DNA测序、杂交测序；酶促错配切割、异源双链分析、点杂交、寡核苷酸阵列(DNA芯片)、Mini_sequencing、Taqman技术、分子信标等， 变性高效液相色谱法(DHPLC)。
[0086]用于本发明的测试样品没有特别限制，对于检测SNP而言，可以是从血液、组织等样品中抽提出的DNA或mRNA。
[0087]本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”或“核酸芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用GRK5基因或RASGRP1基因特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测相应的转录产物。
[0088]检测可以针对cDNA，也可针对基因组DNA。GRK5基因或RASGRPI基因的突变的形式包括与正常野生型DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。
[0089]最方便的检测本发明SNP的方法，是通过用GRK5基因或RASGRP1基因特异性引物扩增样品的GRK5基因或RASGRP1基因，得到扩增产物；然后检测扩增产物中是否存本发明的单核苷酸多态性。
[0090]应理解，在本发明首次揭示了 GRK5基因或RASGRP1基因的SNP与2型糖尿病的相关性之后，本领域技术人员可以方便地设计出可特异性扩增出含该SNP位置的扩增产物，然后通过测序等方法确定是否存在本发明的多核苷酸多态性。通常，引物的长度为 15-50bp，较佳地为20-30bp。虽然引物与模板序列完全互补是优选的，但是本领域技术人员知道，在引物与模板存在一定的不互补(尤其是引物的5’端)的情况下，也能够特异性地扩增(即仅扩增出所需的片段)。含有这些引物的试剂盒和使用这些引物的方法都在本发明范围之内，只要该引物扩增出的扩增产物含有本发明SNP的对应位置。一种优选的引物对具有SEQ ID NO:1中第134位或SEQ ID NO: 2中第164位的序列。
[0091]虽然扩增产物的长度没有特别限制，但是通常扩增产物的长度为100_2000bp，较佳地为150-1500bp，更佳地为200-1000bp。这些扩增产物都应含有SEQ ID NO:1中第134 位或SEQ ID NO:2中第164位。
[0092]本发明的主要优点包括:
[0093]首次用实验证实了 2种新SNP与2型糖尿病的密切相关性，进而提供了辅助性诊断2型糖尿病(或易感性)的方法和试剂盒。本发明可以为临床诊断(尤其是早期诊断)2 型糖尿病提供极为有价值的辅助性参考指标，从而有利于实现2型糖尿病的早诊断、早预防。
[0094]由于本发明的SNP与2型糖尿病具有非常高的关联性，因此不仅可用于早期辅助性诊断2型糖尿病，而且可以未雨绸缪地使一些携带者在未发病前就采取合理的预防措施，从而提高携带者的生存期和生存质量，因此具有极其重大的应用价值和社会效益。当然，最终诊断还应当用常规检测方法进行确诊。
[0095]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook 等人,分子克隆:实验室手册(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
[0096]在本发明中，关于各基因的序列、SNP及其他一些有用信息，可在如下电子数据库信息中找到:
[0097]PLINK, http://pngu.mgh.harvard, edu/ ~purcell/plink/; (version 1.07) SNPTEST,
[0098]https: //mathgen.stats, ox.ac.uk/genetics_software/snptest/snptest.html; (version 2.2.0)
[0099]IMPUTE, http: / /mathgen.stats, ox.ac.uk / impute / impute, html; (version2.1.2)
[0100]MACH, http://www.sph.umich.edu/csg/abecasis/MACH/;(version 1.0)
[0101]LocusZoom, http://csg.sph.umich.edu/locuszoom/;(version 1.1)
[0102]Hap1view, http://www.broad, mit.edu/mpg/haploview/; (version 4.2)
[0103]Genevar, http://www.sanger.ac.uk/resources /software / genevar/; (version 3.1.1)
[0104]实施例1
[0105]2型糖尿病相关的SNP的鉴定
[0106]1.1研究人群
[0107]本发明人在数个独立的人群样本中开展了 2型糖尿病的全基因组关联分析研究 (GffAS)，该研究包含3个研究阶段的。用于第一阶段全基因组芯片分析的人群样本共有 1，999例糖尿病患者和1，976例非糖尿病对照。该样本来自以下几个人群调查研究:《中国中老年人营养与健康状况调查研究(NHAPC)》(312病例和815对照)、《肠道菌群与肥胖研究(GMOS) ))(82病例和163对照)、《复旦华山研究(FDHS) ))(807病例和339对照)以及《北京糖尿病调查(BDS)》(798病例和659对照)。用于第二阶段验证96个2型糖尿病位点的样本共有13，517个费亲缘关系的中国汉族人(6，570例糖尿病患者和6，947例非糖尿病对照)。该样本来自《贵州毕节2型糖尿病调查研究(GBTDS)》、《北京2型糖尿病研究(BTDS))) 和《湖北2型糖尿病研究(HTDS)》。用于第三阶段验证10个2型糖尿病位点的人群包括: 来自上海(SDIID和SDS)的3，410例糖尿病患者和3，412例非糖尿病对照人群用denovo 基因分型验证，来自亚洲糖尿病合作联盟(AGEN-T2D)的6，952例糖尿病患者和11，865例非糖尿病对照人群用in silico验证。各个阶段的人群样本无重复。分析2型糖尿病相关数量性状的人群为基于人群的调查研究，来自《中国中老年人营养与健康状况调查研究》和 《肠道菌群与肥胖研究》(共3，614人)。所有研究均经过当地伦理委员会的审查，且受试者签署了知情同意书(表2)。
[0108]1.2基因分型和`质控
[0109]第一阶段的DNA样本在基因芯片Illumina Human660ff-Quad BeadChip (Illumina, Inc., San Diego, CA, USA)上进行基因分型。本发明人对基因分型的结果分别在个体样本和单核苷酸多态性位点(SNP)水平加以质控。针对个体样本，本发明人剔除的样本符合如下标准之一:1)基因分型的成功率〈97%(20人)，2)高杂合度3)性别错误(69人)，4)重复(19人)或者亲缘关系(149人)。通过主成分析(PCA)，本发明人还去除了偏出人群基因背景的样本(6人)。在SNP水平，本发明人去除了 CNV相关的SNP、Y染色体和线粒体染色体上的SNP。同时还去除了以下几种情况的SNP:1)基因分型的成功率 <95%(I, 351个SNP)，2)次等位基因频率<0.5%(63, 263个SNP)，3)对照组中，哈迪温伯格平衡P〈10-6(l，047个SNP)。所有通过质控的样本被用于归责分析(imputation)获取分型的 SNP，其参考数据库为 HapMap CHB+JPT (release n0.22)，采用的软件为 MPUTE (version
2.1.2)。本发明人剔除imputed SNP的条件有:估计的成功率〈99%，或者等位基因频率〈1%， 或者哈迪温伯格平衡〈10'或者info measure ( 0.5.[0110]本发明人挑选了第一阶段中最显著的96个SNP位点在第二阶段的3个不同人群中进行基因分型和验证。在Fludigm EPl平台上采用TaqMan SNPGenotyping Assays分型试剂对来自GBTDS，BTDS,和HTDS研究共6，570病例和6，947对照人群进行基因分型。 本发明人剔除了分型成功率〈93%的样本，以及分型成功率〈95%、对照组中哈迪温伯格平衡P〈5.2X 10_4的SNP位。GBTDS，BTDS和HTDS研究人群样本的总体分型成功率分别是 99.7%, 99.4%,和99.4%。本发明人还对每个研究人群样本的5%进行重复分型，发现分型结果的一致率分别为99.9%, 99.5%和99.5%。此外本发明人对135个第一阶段用基因芯片分型的样本在Fludigm EPl上用TaqMan SNP Genotyping Assays对96个位点进行重复验证， 两平台间的SNP基因分型结果重复率为99.9%。
[0111]最后，根据第一阶段和第二阶段荟萃分析结果，本发明人挑选了 10个P值最小的 SNP位点用于第三阶段验证。第三阶段验证包括两方面:一是在来自上海的6，822例样本(2 型糖尿病3，410例和正常对照3，412例)中进行的de novo基因型分析；二是在来自有8 个独立人群研究组成的AGEN合作联盟的GWAS数据(2型糖尿病6，952例，正常对照11，865 例)中进行in silico验证。米取Sequenom MassARRAY平台进行de novo基因分型,质控后分型成功率>90%的样本用于关联研究分析。232个重复样本的SNP重复率为99%。in silico验证的结果直接从AGEN的荟萃分析数据库中获得。
[0112]1.3统计分析
[0113]在第一阶段，分别采用PLINK (version 1.07)和 SNPTEST (version 2.2.0)软件分析基因分型得到的SNP和imputed SNP与2型糖尿病的关联关系。采用逻辑回归分析方法分析SNP与2型糖尿病的关联关系，并计算比值比和95%置信区间。关联分析模型I采取了叠加遗传模型并校正了年龄、性别和前2个主成分。关联分析模型2进一步矫正了体质指数(BMI)。男性X染色体上的SNP视为纯合子并定义为2，即效应位点。为了检验关联分析是否会因人群地区差异带来偏差，本发明人首先在整个人群中进行分析(南北并为一体)， 然后分别在北京和上海分别分析并做荟萃分析。P值矫正了 genomic control inflation factor (A GC)。为了寻找更多的SNP2型糖尿病与相关的一致性的证据，本发明人经人群分别以性别分开，在男女人群中分别计算了 SNP与2型糖尿病的关联关系。
[0114]用于第二阶段验证的SNP主要是根据第一阶段关联关系P的值大小进行挑选的， 且每个基因组区域挑选了 1-2个P值最小的SNP。第二阶段的验证分析主要是采取叠加遗传模型，分别在每个人群中用逻辑回归分析方法检验SNP与2型糖尿病的关联关系，并校正年龄和性别。米用 fixed-effect inverse varianceweighted 和 sample size weighted Z-score荟萃分析方法整合所有研究结果。用Cochran’ s Q statistics 分析关联分析的异质性。
[0115]本发明人还分析了 2型糖尿病相关SNP位点对2型糖尿病相关数量性状的影响。该研究人群为基于人群的调查研究的人群，《中国中老年人营养与健康状况调查研究 (NHAPC)》和《肠道菌群与肥胖研究(GMOS)》。NHAPC研究人群的SNP分型是采用基因芯片 Illumina Human660ff-Quad BeadChip (Illumina, Inc., San Diego, CA, USA)分型，而GMOS研究人群的SNP分型是采用TaqMan SNP Genotyping Assays分析试剂分型.最终共有3，614 个样本(2，229来自上海1，385来自上海)通过质控。关联研究采用叠加效应遗传模型，分别在北京和上海人群中进行分析，并矫正年龄、性别和研究项目。HOMA-B和HOMA-S值分别取自然对数加以转换。关联结果最终采用fixed-effect inverse variance weighted荟萃分析方法整合结果.HOMA-S和HOMA-B用Levy’ s HOMA计算模型计算.[0116]1.4顺式表达数量座位(cis-eQTL)和外周血mRNA表达分析
[0117]对顺式表达数量座位分析，本发明人在Genevar eQTL数据库中查阅了 rsl0814916，rsl0886471 和 rs7403531 以及它们的代理 SNP (r2>0.5)的相关数据。Genevar eQTL数据库中包括了来自于MuTHER协会的部分健康女性双胞胎的166个脂肪组织、156 个淋巴细胞系和160个皮肤组织样本eQTL信息。SNP与mRNA表达量之间的关联关系由斯皮尔曼相关系数(Spearman’ s rank correlation)表示，并通过10000次置换试验 (permutation)计算获得P值。
[0118]本发明人对北京协和医院于2011年12月招募的64名无关中国汉族研究对象进行了外周血的GRK5 mRNA表达量测定。所有研究参与者都提供了书面的同意书，研究方案也已通过了伦理审核。本发明人使用QIAGEN试剂盒与RNA Pure Blood试剂盒(CWBIO)分别提取了样本外周血DNA及RNA。GRK5-rs 10886471位点的基因型由测序方法确定，所使用的引物如下:
[0119]5’ -TCCTACACTGGAACAAGCC-3’ (SEQ ID N0.:3)；
[0120]5’ -ACGGACTAATACAGACGGG-3’ (SEQ ID N0.:4)。
[0121]用于检测RASGRP1基因的rs7403531的引物如下:
[0122]5’ -CATATTCCTGAACACTCTGG-3’ (SEQ ID N0.:5)；
[0123]5，-CCCATAGAACAAGTCTAAACC-3’ (SEQ ID N0.:6)
[0124]本发明人使用GoldStar TaqMan Mixture 试剂盒(CWBIO)在 Bio-Rad IQ5 平台上使用qRT-PCR方法对GRK5-rs 10886471进行检测。同时，标准化GRK5 mRNA表达量到相对于GAPDH的相对表达量。本发明人使用线性回归计算GRK5-rs 1088647与GRK5表达量的关系，使用T检验比较两组样本间的GRK5表达量的不同。本发明人使用GRK5-rs 1088647的显性遗传模型计算线性回 归，并矫正2型糖尿病的疾病状态。本发明人使用单侧P值表示统计检验的显著程度。
[0125]1.5区域连锁不平衡形式的比较
[0126]本发明人根据GRK5与RASGRP1上位点区域的连锁不平衡作图选取了相应的基因组区域(见图4与图5)。本发明人使用varLD算法来分别比较、计算45个HapMap2中国汉族人(CHB)与60个HapMap2欧洲人(CEU)及45个HapMap2日本人(JPT)在这两个区域的连锁不平衡形式的不同。其结果由varLD算法计算获得的蒙特卡罗P值表示。
[0127]1.6 结果
[0128]在第一阶段研究中，本发明人对总共2，234，194个符合指控标准的SNP位点在 3712例来自于北京或上海的中国汉族样本中进行了全基因组关联分析。3712例研究样本包括了 1839例2型糖尿病病例和1873例非糖尿病正常对照。分析结果显示，第一阶段研究样本并不存在明显的样本分层情况，其基因组控制因子(Genomic control factor)值为
1.03。关联分析分位数图(Quantile-Quantileplot)显示在低P值区域处的SNP位点,其关联显著程度明显高于期望值。目前已报道的2型糖尿病位点有55个在中国汉族人群中是呈多态性的。其中4个位点与2型糖尿病的关联程度，在第一阶段研究中已达到了全基因组显著水平，即P值小于5X 10。它们分别处于基因CDKALl, CDKN2A/B, KCNQl与DUSP9区域(图2)。在余下的51个报道位点中，发现有48个位点在第一阶段研究中与2型糖尿病发病的关联作用方向与报道的方向一致(二项分布检验P值=9.8X 10_12)。而且，其中的19 个位点与2型糖尿病关联程度达到单位点显著水平，即P值小于0.05)。在以上这些报道位点中，本发明人仅发现CDKALl-rs7754840对2型糖尿病发病的作用是存在人群差异性的。 其在中国汉族人群中作用功效大小明显大于在欧洲人群中(遗传异质性P值=3.33x10-4)。 这个结果与本发明人先前的报道一致。
[0129]为了进一步验证本发明的研究结果，本发明人将SNP位点根据其在第一阶段中与 2型糖尿病关联分析的P值从小到大排列。在排列过程中，本发明人去除了所有位于CDKALl 与KCNQl上的东亚人群2型糖尿病报道区域，且P值已达到全基因组显著水平的SNP位点。根据P值从小到大的顺序，本发明人在每个独立的LD区域内选取I至2个SNP，总共 96个SNP，84个独立的LD区域进行第二阶段验证。本发明人在6570例2型糖尿病病例与6947例正常对照的第二阶段样本中检测了此96个SNP位点的分型情况(表3)。结果显示，96个SNP位点中仅SLC30A8-rsl3266634因Hardy-Weinberg不平衡而被去除。本发明人对剩余的95个SNP位点进行了 2型糖尿病的关联分析。其中位于基因RASGRP1，GLI S3, CDKN2B, CDC123, HHEX, HNF1B, FAM58A与DUSP9区域的8个位点与2型糖尿病的关联关系在Bonferroni多重检验矫正后仍然显著，即P值小于0.05除以95 (5.26x 10-4) ?结合第一与第二阶段结果的荟萃分析显示，位于基因RASGRP1，⑶KN2B，⑶C123，HHEX, HNF1B, FAM 58A与DUSP9区域的SNP位点与2型糖尿病的关联关系已达到全基因组显著水平。其中， ⑶KN2B，HHEX,⑶C123，HNFlB与DUSP9区域的SNP位点在先前的研究中已被报道。另外， GLIS3-rsl0814916(P=5.29X 1(T7)与 GRK5-rs 10886471 (P=5.92x10-7)也已接近全基因组显著水平。在之前的候选基因关联研究中，已有报道发现GLIS3-rs7034200与2型糖尿病存在关联关系，但并没有被进一步证实。另一个位点FAM58A-rsl2010175与其临近的2型糖尿病报道位点rs5945326-DUSP9在中国汉族人群中仅呈中等水平的连锁关系(r2=0.35)。 但进一步的条件分析显示这两个位点与2型糖尿病的关联关系并不是独立的(rsl2010175 矫正 rs5945326 后的 P 值=0.02)。
[0130]为了进一步验证新位点与2型糖尿病的关联关系，本发明人从以上研究结果中挑选了 10个独立的，且新发现的2型糖尿病SNP位点进行第三阶段的验证。这些位点的一二阶段荟萃分析P值都小于5x 10_4，且与2型糖尿病的关联关系不存在性别差异。在此阶段的研究中，本发明人首先将这些位点在3410例中国汉族人群2型糖尿病病例与3412例正常对照进行了分型验证。同时，利用已发表的东亚人群2型糖尿病全基因组关联研究的荟萃分析结果，本发明人进一步检验了这10个SNP位点与2型糖尿病的关联关系。这项东亚人群的荟萃分析使用了来自于AGEN-T2D协会的6952例2型糖尿病病例与11865例正常对照的全基因组SNP数据，其中有4026例病例与4654例对照来至于中国汉族人群，其余的 2926例病例与7211例对照分别来自于韩国、日本、马来西亚和菲律宾人群。结合三个阶段的关联分析结果后本发明人发现，位于基因GLIS3，GRK5和RASGRP1区域的3个SNP位点的P值也已达到了全基因组显著水平(表1)。另外，本发明人发现这三个位点与2型糖尿病关联的关系不存在人群差异性(遗传异质性P值> 0.26)。且比较位点在中国汉族与东亚其他人群中的作用功效大小，同样不存在显著的差异性(遗传异质性P值> 0.14)(表 4)。当本发明人在进行第三阶段数据分析时，AGEN-T2D协会首先报道了位于GLIS3的一个位点为新的2型糖尿病位点。比较发现这个报道位点GLIS3-rs7041847与本发明人发现的 GLIS3-rsl0814916之间呈很强的连锁关系(r2=0.93)。由此，本发明人仅将剩余的两个位于GRK5与RASGRP1区域的位点认为是新发现的2型糖尿病位点。
[0131]本发明人对以上发现比较了来自于欧洲DIAGRAM协会的2型糖尿病全基因组关联研究荟萃分析结果。此荟萃分析数据集分析了来自于欧洲人群的8130例2型糖尿病病例与38987例正常对照的全基因组SNP数据。结果证实了 RASGRPl-rs7403531与2型糖尿病的关联关系(P=0.023，OR=L 06)，其位点作用功效在亚洲人群与欧洲人群中不存在显著差异性(遗传异质性P=0.22)。且DIAGRAM的数据显示，在rs7403531附近，存在两个与 rs7403531 连锁的 SNP 位点(rs8043085 与 rsl2593201,和 rs7403531 的 r2 ≥ 0.8)与 2 型糖尿病的关联程度更加显著(P ≤3.82x10-3，OR=L 07)(表4)。然而，GRK5_rs 10886471与 2型糖尿病的关联关系并没有在DIAGRAM的数据中得到验证(P=0.352，OR=0.98，遗传异质性 P 值=4.42X10—6)(表 4)。
[0132]为了检验肥胖是否会影响这两个新发现位点和2型糖尿病的关联关系，本发明人在关联分析的模型中进一步矫正了体重指数(BMI)。结果显示，矫正了 BMI后的位点作用功效与之前没有明显变化(矫正BMIP值=1.73 X 10-8-2.87 X 1(T9，OR=L 10-1.12)。因此，可以判断此关联关系并不受肥胖影响。本发明人随后在两个人群研究(NHAPC和GM0S)样本中，包括3614个中国汉族人群样本(2142例空腹血糖正常个体、1211空腹血糖受损个体与 261例2型糖尿病个体)，进一步研究这两个新发现位点与2型糖尿病相关的一些数量性状的关联关系。结果发现，GRK5-rs 10886471的2型糖尿病风险等位基因会显著升高空腹血浆胰岛素水平(P=0.0204)，但其与空腹血糖无关。而RASGRPl-rs7403531的2型糖尿病风险等位基因会显著升高空腹血糖(P=0.0213)，并与HOMA-B的降低有关(P=0.0027)(表5)。 在空腹血糖正常个体中的相关分析研究，本发明人同样得到了类似的结果(表5)。
[0133] 本发明人通过查阅Genevar eQTL数据库对这两个新发现位点及其附近连锁的位点进行了顺式表达数量座位(cis-eQTL)分析。分析结果显示，rsl0886471的一个位于 GRK5内含子上的连锁SNP位点(rs4752300，与rs 10886471的r2=0.79)的2型糖尿病风险等位基因与GRK5的mRNA表达水平在脂肪组织中呈正相关(P=6X 10_4，r=0.361)。对于rs7403531及其连锁位点，本发明人并没有发现其位于RASGRP1或附近基因的cis-eQTL 上。为了进一步验证rsl0886471可能影响GRK5的mRNA表达水平这一发现，本发明人使用 qRT-PCR检测了 64个无关中国汉族样本，包括30例2型糖尿病病例与34例正常对照的外周血GRK5的mRNA表达水平。关联分析的结果证实了 rsl0886471的2型糖尿病风险等位基因与GRK5的高表达量有关(P[dom]=0.02)，且此关系同时存在于2型糖尿病病例与正常对照组中。而且，表较两组间的外周血GRK5表达量发现，2型糖尿病病例组比正常对照组的 GRK5表达量高40%(P=0.0048)(图6和表6)。这些结果可以说明，rsl0886471的2型糖尿病风险等位基因可能通过升高GRK5的表达量来增加2型糖尿病的风险。但由于外周血并不是2型糖尿病发病的直接相关组织，所以这个结论有待进一步证实。
[0134]本发明人分别中国汉族人群与欧洲人群及日本人群在这两个新发现位点附近区域的连锁不平衡结构(图4与图5A)。本发明人发现中国汉族人群与欧洲人群在 GRK5-rs 10886471与RASGRPl_rs7403531区域存在显著不同的连锁不平衡形式(GRK5区域P=0.043，RASGRPI区域P=0.0043)，但并没有发现中国汉族人群与日本人群之间的连锁不平衡形式的不同(P≥0.101)(表7)。同时，本发明人发现GRK5-rsl0886471与 RASGRPl-rs7403531在东亚人群中的2型糖尿病风险等位基因的频率比在欧洲人群的高。 GRK5-rs 10886471的2型糖尿病风险等位基因频率在HapMap中国汉族人群(CHB)中为
0.79，日本人群(JPT)中为 0.74，欧洲人群(CEU)中为 0.48。RASGRPl-rs74035311 的 2 型糖尿病风险等位基因频率在HapMapCHB中的为0.33，JPT中为0.45，CEU中为0.28。
[0135]讨论
[0136]本研究中本发明人不仅验证了超过20个已报道的2型糖尿病易感位点，而且还发现了 2个新的2型糖尿病易感位点:GRK5 (rsl0886471)和RASGRP1 (rs7403531)。单核苷酸多态性位点(SNP)rsl0886471位于GRK5基因(G蛋白偶联受体激酶5，G-protein-coupled Receptor Kinase 5)第3个内含子内，且其所在的连锁不平衡区域(LD block)只包含 GRK5基因(图4).进一步的区域作图发现，rsl0886471是GRK5上关联关系最显著的位点 (图3A).GRK5属于G蛋白偶联受体激酶(GPCR kinase)家族，在磷酸化G蛋白偶联受体和非G蛋白偶联受体中起重要作用，如:胰高血糖素受体(glucagon receptor), 0 2_肾上腺素受体(P 2-adrenergic receptor),热休克蛋白70相互作用蛋白(Hsp70 interacting protein),及在调节血糖稳态和炎症反应的关键蛋白-NF k Bl/pl05等。体内外的实验研究发现，GRK5的缺失降低炎性细胞因子和趋化因子分泌、导致NFkB活性的降低。SNP rsl0886471的危险等位基因位点与GRK5mRNA的高表达水平、高空腹胰岛素水平显著相关， 与空腹血糖不相关。这些证据表明，在中国汉族人群或东亚人群中，该位点可能通过提高炎性反应水平、降低胰岛素敏感性的机制增加2型糖尿病发病风险。值得注意的是，GRK5是汉族或东亚人群特异性的2型糖尿病易感基因位点，在欧洲人群中GRK5-rs 10886471与2型糖尿病风险并不相关，且GRK5-rs 10886471危险等位基因位点频率在汉族人群中显著高于欧美人群(分别为0.79和0.48)。在中国汉族人群中，其人群归因危险度为8.66%。此外， GRK5的连锁不平衡结构在中国汉族与欧美人群中也存在显著差异(P=0.0432)。
[0137]第二个新发现的2型糖尿病易感基因位点(rs7403531)位于染色体区域 chrl5ql4, RASGRPI基因的第二个内含子内(图5A)。这个位点与2型糖尿病的关联关系在欧美人群中(DIAGRAM consortium)也得到了证实表S3，且其效应值在这两个人群中无显著差异性。rs7403531危险等位基因位点的频率在中国汉族人群中略高于欧洲人群(分别为0.33和0.28).区域作图发现，这个区域内的最显著性位点为SNP rsl2593201 (与 rs7403531的r2=0.81)(图3B和S5)，在欧美人群中(DIAGRAM consortium)也发现相似的结果(P = 2.4X IO-3)。在第一阶段的人群中进行条件分析发现，这两个SNP位点均不是导致这种关联关系的根本原因(P≥0.11).值得注意的是，rs7403531与之前发现的I型糖尿病位点rs7171171在欧洲人群中存在中等程度的连锁不平衡(r2=0.46)，但是在中国汉族人群中却不存在连锁不平衡(r2=0.03)(图5B)，提示RASGRP1与2型糖尿病的关联关系并不是由 I 型糖尿病相关位点导致的。RASGROI 编码 RAS guanyl releasing protein I (RasGRPl), 该蛋白是Ras/MAPK信号通路中的鸟嘌呤核苷酸交换因子，且主要参与T淋巴细胞和B淋巴细胞的功能和发育。RasGRPl缺失的小鼠模型主要表现为淋巴细胞增殖，炎性细胞因子分泌，和细胞凋亡受损。RASGRP1主要在淋巴细胞中表达，在其他细胞包括胰岛P细胞中也有表达。P细胞中RASGRP1的异常可导致胰岛炎症反应和P细胞功能受损，这可能是导致2型糖尿病的发病主要病理机制。同时RASGRPl-rs74035312型糖尿病危险等位基因位点与高水平空腹血糖、低P细胞功能指数(HOMA-B)相关，表明rs7403531可能是同过损伤 ^细胞功能导致2型糖尿病的发生.然而需要更多的功能研究对此推掉加以验证。
[0138]为了检验本研究中是否存在I型糖尿病的错误分类，本发明人同样分析了所有已知I型糖尿病易感基因位点与2型糖尿病的关联关系。与已报道的2型糖尿病易感基因位点相反，仅少数I型糖尿病相关位点与2型糖尿病风险趋势性相关(P = 0.01-0.05，二项分布检验P=0.24)。该结果表明，第一阶段的研究样本中I型糖尿病的错误分类比例很低。 此外，本发明人还在不同医院来源的5，678例糖尿病患者和8，438例非糖尿病人(谷氨酸脱羧酶和胰岛素自身抗体阴性，大于30岁，无I型糖尿病病史)中分析RASGRPl-rs7403531 与2型糖尿病的关联关系，发现SNP rs7403531的关联比值比与本研究最终的比值比相似。 这些分析结果表明，本研究发现的RASGRP1和GRK5与2型糖尿病的关联关系不是由I型糖尿病相位点或者I型糖尿病错误分类等因素导致产生的。
[0139]综上所述，本研究是至今在中国汉族人群中开展的最大的2型糖尿病全基因组关联分析。本发明人发现了 2个新的在全基因组关联分析显著水平的2型糖尿病易感基因位点(GRK5和RASGRP1)。特别值得注意的是，结果提示GRK5可能是东亚人群特有的2型糖尿病易感基因位点。本发明人还验证了其他已报道的2型糖尿病易感基因位点:KCNQ1， CDKAL1，CDKN2B，CDC123，HNF1B, GLIS3,和DUSP9，这些位点在本研究中均达到全基因组关联分析显著水平。本发明的研究发现不仅为研究2型糖尿病的发病机理提供了新的见解， 还为研究2型糖尿病发病的人群异质性提供了新的线索。
[0140]各阶段的数据汇总于表1。其中，SNP(R/A)中，R表示高风险等位基因(Risk)，A 表示其他等位基因。
[0141]表1的结果综合表明:GRK5基因的rsl0886471的SNP(高风险型为C)和RASGRP1 基因的rs7403531的SNP(高风险型为T)与2型糖尿病的发生存在着显著相关性。
[0142]实施例2
[0143]2型糖尿病易感性检测试剂盒
[0144]如实施例1所述，存在GRK5基因的rsl0886471:即SEQ ID N0.:1中第134位C —T 的突变与2型糖尿病疾病密切相关。因此，可基于这个突变设计GRK5基因特异性引物在以病人的DNA为模板进行扩增进行检测。
[0145]制备一试剂盒(100人次)，它含有:
[0146]
【权利要求】
1.一种体外非诊断性检测样品是否存在GRK5基因或RASGRP1基因的单核苷酸多态性的方法，其特征在于，包括步骤:(a)用特异性引物扩增样品的GRK5基因或RASGRP1基因，得到扩增产物；和(b)检测扩增产物中是否存在选自下组的单核苷酸多态性:GRK5 基因的 rsl0886471:即 SEQ ID N0.:1 中第 134 位 C —T; RASGRPI 基因的 rs7403531:即 SEQ ID N0.:2 中第 164 位 C — T。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的基因特异性引物具有SEQIDNO:3和 4所示序列、或SEQ ID N0:5和6所示序列。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的扩增产物的长度为100-2000bp且含有 SEQ ID NO:1 中第 134 位或 SEQ ID NO: 2 中第 164 位。
4.一种检测2型糖尿病的试剂盒，其特征在于，它包括特异性扩增GRK5基因或 RASGRP1基因或转录本的引物，所述的引物扩增出长度为100-2000bp且含有SEQ ID NO:1 中第134位或SEQ ID NO:2中第164位的扩增产物。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，它还含有选自下组的试剂:(a)与SEQID NO:1中第134位或SEQ ID NO: 2中第164位的突变结合的探针；(b)识别SEQID NO:1中第134位或SEQ ID NO:2中第164位的突变限制性内切酶。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的突变是选自下组的单核苷酸多态GRK5 基因的 rsl0886471:即 SEQ ID N0.:1 中第 134 位 C — T;RASGRPI 基因的 rs7403531:即 SEQ ID N0.:2 中第 164 位 C — T。
7.一种GRK5基因或RASGRP1基因的用途，其特征在于，用于制备对2型糖尿病易感性进行诊断的试剂或试剂盒。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的试剂或试剂盒用于检测选自下组的单核苷酸多态性:GRK5 基因的 rsl0886471:即 SEQ ID N0.:1 中第 134 位 C —T;RASGRPI 基因的 rs7403531:即 SEQ ID N0.:2 中第 164 位 C — T。
9.一种多核苷酸分子的用途，所述的分子包括特异性扩增含单核苷酸多态性(SNP)位点的扩增产物的引物和/或与所述SNP位点特异性结合的探针，其特征在于，所述的核苷酸分子用于制备对2型糖尿病易感性进行诊断的试剂盒，并且所述的SNP位点自下组:GRK5 基因的 rsl0886471:即 SEQ ID N0.:1 中第 134 位 C —T;RASGRPI 基因的 rs7403531:即 SEQ ID N0.:2 中第 164 位 C — T。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的SNP位点是GRK5基因的 rsl0886471，并且所述的试剂盒用于检测高空腹胰岛素易感性；和/或所述的SNP位点是RASGRP1基因的rs7403531，并且所述的试剂盒用于检测高HbAlc易感性以及低HOMA-B易感性。
【文档编号】C12Q1/68GK103525899SQ201210226735
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2012年7月2日 优先权日:2012年7月2日
【发明者】林旭, 黎怀星, 甘蔚, 王一钦, 鲁玲 申请人:中国科学院上海生命科学研究院