一种pepck基因的检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种PEPCK基因的检测方法，包括：(1)提取细胞RNA作为样品，将样品与芯片杂交，杂交完成后洗涤芯片，对芯片进行扫描，得到PEPCK基因的表达情况；(2)将上述样品溶于去核酸酶的蒸馏水中，取部分逆转录为cDNA，进行PEPCK特异性实时荧光定量PCR反应，得到Ct值并对步骤(1)中芯片反映的结果进一步验证，即可。本发明检测方法提高了灵敏度，检测了PEPCK mRNA的表达水平作为判断糖异生水平的指标，为二甲双胍的进一步应用提供了依据。
【专利说明】
一种PEPCK基因的检测方法
技术领域
[0001] 本发明属于二甲双胍应用领域，特别涉及一种PEPCK基因的检测方法。
【背景技术】
[0002] 2型糖尿病的患病率日益提高，据瑞金医院内分泌代谢病科联合中国疾控中心的 流行病学研究表明，中国成人糖尿病的患病率达11.6%，糖尿病前期人群的患病率甚至高 达50.1%。糖尿病及其并发症已经成为致死致残的主要原因之一，给社会及个人带来严重 的经济负担。肝脏通过一对拮抗激素胰岛素和胰高血糖素将血糖维持在一定范围内，是人 体内参与代谢调节及维持葡萄糖稳态的重要器官。饱腹时血液胰岛素水平升高，抑制肝脏 糖异生过程;空腹时升高的胰岛血糖素促进肝糖异生从而稳定血糖水平。2型糖尿病患者高 血糖的原因之一是肝脏糖异生增强。肝糖异生是指肝脏利用非糖化合物前体如乳酸、丙酮 酸、甘油等合成葡萄糖的过程。糖异生总体上来说是糖酵解的逆反应过程，但是有四个限速 酶，即丙酮酸羧化酶(PC)、PEPCK、葡萄糖-6磷酸酶(G6pase)、果糖1,6-二磷酸酶(Fbpase)。
[0003] PEPCK受多种激素的调节，如胰岛素、胰高血糖素、糖皮质激素等。目前尚未有二甲 双胍对PEPCK基因的研究报道。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是提供一种PEPCK基因的检测方法，该方法提高了灵 敏度，检测了PEPCK mRNA的表达水平作为判断糖异生水平的指标，为二甲双胍的进一步应 用提供了依据。
[0005] 本发明的一种PEPCK基因的检测方法，包括：
[0006] (1)提取细胞RNA作为样品，将样品与芯片杂交，杂交完成后洗涤芯片，对芯片进行 扫描，得到PEPCK基因的表达情况；
[0007] (2)将上述样品溶于去核酸酶的蒸馏水中，取部分逆转录为CDNA，进行PEPCK特异 性实时荧光定量PCR反应，得到Ct值并对步骤（1)中芯片反映的结果进一步验证，即可；其 中，PEPCK引物为：
[0008] F:5 'GTGCTGGAGTGGATGTTCGG3 '；R:5 ' CTGGCTGATTCTCTGTTTCAGG3 '。
[0009] 所述步骤(1)中的杂交具体为:在滚动杂交炉中55°C、20rpm滚动杂交20h。
[0010] 所述步骤(1)中的洗涤采用基因洗涤剂洗涤。
[0011] 所述步骤(2)中逆转录采用的逆转录混合液的组成为:MgCl2溶液4μ1; 10 X逆转录 缓冲液2μ1;反应原料dNTP 2μ1;引物ΙμL ;RNase抑制剂Rnasin 0.5μ1 ;AMV逆转录酶0.6μ1。 [0012] 所述步骤⑵中逆转录条件为:42°C反应lh，95°C反应5min，随后降至-20°C。
[0013]所述步骤(2)中实时荧光定量PCR的反应体系为:cDNA模板2μ 1，上下游引物各0.4μ 1，2XSYBR 10yl，R0X 0·4μ1，灭菌去离子水6·8μ1 或者2XSYBR 5yl，cDNA模板2μ1，上下游 引物各〇. 25μ1，灭菌去离子水2.5μ1。
[0014] 所述步骤(2)中实时荧光定量PCR的反应条件为:95°C预变性10min;95°C5s，60°C 延伸 30s 或 95°(：158,60°(：1111丨11;40个循环。
[0015] 有益效果
[0016]本发明检测方法提高了灵敏度，检测了PEPCK mRNA的表达水平作为判断糖异生水 平的指标，为二甲双胍的进一步应用提供了依据。
【附图说明】
[0017] 图1为不同处理条件下小鼠肝细胞PEPCK的mRNA表达水平；
[0018] 图2为RNA变性琼脂糖凝胶电泳结果;其中，1、5、9表示对照组，2、6、10表示cAMP组， 3、7、11代表二甲双胍组；
[0019] 图3为芯片杂交图像;其中，（a)为对照组，（b)为cAMP组，（c)为二甲双胍组。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
[0021] 实施例1
[0022] (一)Trizol 法抽提细胞 RNA
[0023] 1.六孔板细胞吸去培液后，用冰PBS洗两遍，每孔加入lml Trizol室温静置片刻， 收集细胞至1.5ml RNA酶free的离心管;每管加入0.2ml氯仿，盖上盖子后，剧烈振摇15s，室 温静置5min;
[0024] 2. 4°C12000Xg离心 18min，取上层无色水相400μ1，移至一新的 1.5ml RNA酶free 的离心管，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀后室温静置lOmin;
[0025] 3. 4°C 12000 X g离心15min，弃上清，加入lml冰的75%乙醇的DEPC水洗涤RNA;4°C 7500Xg离心5min，弃上清，加入lml冰的75%乙醇的DEPC水再次洗涤RNA;4°C7500Xg离心 5min，弃上清，4°C7500 X g离心lmin，将管壁酒精甩至管底，使用10μ1移液枪吸干管内液体， 将离心管置于空气中晾干约5~20min，待管底RNA由白色沉淀物转变为透明，根据白色沉淀 大小加20~100μΙ RNase Free蒸馏水(Promega公司）溶解；
[0026] 4.取ΙμL总RNA和5μ1上样缓冲液，离心充分混匀后进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果 应当为:28s rRNA、18s rRNA条带清晰，两者亮度比彡2.0;符合条件的RNA进行逆转录或-80 °C保存。
[0027](二)RNA浓度测量及逆转录反应
[0028] 1.使用Nano drop系统(Thermo公司，美国）测量其浓度。用分光光度计分析RNA浓 度，在260nm 10D约等于40μg/ml RNA。每次上样取ΙμL RNA溶液，并使用RNase Free蒸馈水 blank校正。需要在260nm和280nm处测定吸光度来确定样品浓度和纯度，所有核酸样本的 0DA26Q/0DA 28()均接近2 · 0，说明样本较少收到蛋白质污染;0DA26Q/0DA23()均大于1 · 8，说明样本 较少收到有机物污染，记录RNA浓度和260/280吸光度比值。
[0029] 2.按2yg总量计算所需RNA溶液体积，剩余体积以RNase Free蒸馏水(Promega公 司）补齐至?〇μ1。
[0030] 3. 72 °C 1 Omiη预变性以解除RNA莖环等二级结构。按照Promega公司提供的说明书 每个样本按以下体系配制逆转录mix混合酶溶液：
[0032] 4.每个样本加10μ1 mix混合溶液，快速离心将液体沉淀至管底，42°C反应lh，95°C 5min灭活逆转录酶;产物加180μ1 ddH20稀释至200μ1负20°C存放备用。
[0033](三）引物设计
[0034] 基因组序列网站(NCBI)查找基因序列，扩增序列的选择采用跨内含子的策略以排 除DNA污染的干扰，引物均采用Primer 3.0软件在线设计(http://frodo. wi .mit. edu/)。设 计要求产物扩增长度100~25(^?，(^衍11^11'11160~65°(：，？411^^6(：%40~60% 〇
[0035] β-actin:上游引物5'GGCTGTATTCCCCTCCATCG3'；下游引物5' CCAGTTGGTAACAATGCCATGT3,；
[0036] PEPCK:上游引物5'GTGCTGGAGTGGATGTTCGG3'；下游引物5' CTGGCTGATTCTCTGTTTCAGG3'
[0037](四）反应体系
[0038] 96孔板qRT-PCR反应体系：
[0042] (五)反应条件：
[0043] Stage l：95〇C10s
[0044] Stage SJSrSsJOT^lsCSgsriSsJOriminMOCycles
[0045] Stage 3 dissociation
[0046] (六)实验结果分析：
[0047] 1、荧光本底信号:3~15个循环的荧光值。
[0048] 2、阈值:设定为3~15个循环荧光信号标准差的10倍。
[0049] 3、CT值:每个反应体系内荧光信号到达设定标准时的循环数。
[0050] 4、以β-actin为内参，校正每个样本的CT值，得到ACT。
[0051 ] 5、实验组与对照组的表达变化以表示。
[0052] (七）Arraystar IncRNA芯片
[0053] 1、RNA样本准备
[0054] 每孔细胞样本完全吸去培养液后加 lml RNA抽提试剂Trizol，裂解后抽提RNA。 [0055] 2、RNA质量检测
[0056] 使用Nanodrop测定RNA在分光光度计260nm、280nm和230nm处的吸收值，以计算浓 度并评估纯度。琼脂糖凝胶电泳法检测RNA纯度及完整性。
[0057] 3、cDNA样品合成和标记
[0058] 使用cDNA合成试剂盒和单色标记试剂盒对RNA进行逆转录合成cDNA及对cDNA进行 记 D
[0059] 4、标记效率质量检测
[0060]使用Nanodrop检测荧光标记效率，以保证后续芯片实验结果的可靠性。
[0061 ] 5、芯片杂交
[0062]在标准条件下将标记好的探针和高密度芯片进行杂交。
[0063] 6、杂交后芯片进行清洗
[0064] 7、图像采集和数据分析
[0065]使用芯片扫描仪扫描芯片的荧光强度，并将实验结果转换成数字型数据保存，使 用相关软件对原始数据进行分析运算。
[0066](八)结果
[0067] 一、PEPCK在不同条件下的表达水平
[0068] 如图1所示，RT-qPCR实验结果表明，与仅存在糖异生底物的对照组相比，cAMP组显 著上调PEPCK的mRNA表达水平(P〈0.01)，2.0mmol/L的二甲双胍明显降低升高的PEPCK mRNA 水平(P〈0.01)。
[0069]二、Microarray 芯片结果 [0070] (1)样本RNA纯度和浓度
[0071] Nanodrop可利用紫外分光光度法测定核糖核酸的浓度和纯度。核糖核酸在260nm 处有较高的吸收峰，蛋白质在280nm处有较高的吸收峰。基于以上原理，测定核糖核酸样本 在260nm和280nm处的吸光度值，可以推算出样本核糖核酸的浓度及纯度。所有核酸样本的 0DA 26Q/0DA28()均接近2 · 0，说明样本较少收到蛋白质污染;0DA26Q/0DA23()均大于1 · 8，说明样本 较少收到有机物污染。以上结果表明此次样本RNA的质量可靠，可进行深入研究。
[0072] (2)样本RNA的完整性
[0073]如图2所示，琼脂糖凝胶电泳实验结果表明，每个样本都有两条清晰的带，即28S rRNA和18S rRNA，28S rRNA的宽度是18S rRNA的2倍，表明样本RNA较少被降解，较少受到 DNA污染。
[0074] (3)芯片杂交图像
[0075]如图3所示，杂交后的芯片经扫描后生成荧光图像。每个样本荧光清晰可见，说明 芯片结果良好。
【主权项】
1. 一种PEPCK基因的检测方法，包括： (1) 提取细胞RNA作为样品，将样品与芯片杂交，杂交完成后洗涤芯片，对芯片进行扫 描，得到PEPCK基因的表达情况； (2) 将上述样品溶于去核酸酶的蒸馏水中，取部分逆转录为cDNA，进行PEPCK特异性实 时荧光定量PCR反应，得到Ct值并对步骤（1)中芯片反映的结果进一步验证，即可；其中， PEPCK引物为： F:5 ' GTGCTGGAGTGGATGTTCGG3 '；R:5 ' CTGGCTGATTCTCTGTTTCAGG3 '。2. 根据权利要求1所述的一种PEPCK基因的检测方法，其特征在于:所述步骤（1)中的杂 交具体为:在滚动杂交炉中55°C、20rpm滚动杂交20h。3. 根据权利要求1所述的一种PEPCK基因的检测方法，其特征在于:所述步骤（1)中的洗 涤采用基因洗涤剂洗涤。4. 根据权利要求1所述的一种PEPCK基因的检测方法，其特征在于:所述步骤(2)中逆转 录采用的逆转录混合液的组成为:MgCl 2溶液4μ1; 10 X逆转录缓冲液2μ1;反应原料dNTP2y 1;引物ΙμL; RNase抑制剂Rnasin 0.5μ1; AMV逆转录酶0.6μ1。5. 根据权利要求1所述的一种PEPCK基因的检测方法，其特征在于:所述步骤(2)中逆转 录条件为:42°C反应lh，95°C反应5min，随后降至-20°C。6. 根据权利要求1所述的一种PEPCK基因的检测方法，其特征在于:所述步骤(2)中实时 荧光定量PCR的反应体系为:cDNA模板2μ1，上下游引物各0.4μ1，2 X SYBR 10μ1，ROX 0.4μ1， 灭菌去离子水6.8μ1或者2 X SYBR 5μ1，cDNA模板2μ1，上下游引物各0.25μ1，灭菌去离子水 2.5μ1〇7. 根据权利要求1所述的一种PEPCK基因的检测方法，其特征在于:所述步骤(2)中实时 荧光定量 PCR 的反应条件为:95°C 预变性 1〇11^11;951€58,60°(：延伸3〇8或95°(：158,60°(：11^11 ; 40个循环。
【文档编号】C12Q1/68GK105950770SQ201610527681
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年7月6日
【发明人】周丽斌, 王晓, 唐红菊, 王瑶, 张玉青
【申请人】上海市内分泌代谢病研究所, 上海交通大学医学院附属瑞金医院