一种检测基因家族中基因种类的方法及专用试剂盒的制作方法

专利名称：一种检测基因家族中基因种类的方法及专用试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测基因家族中基因种类的方法及专用试剂盒。
技术背景 小麦是世界上最重要的三大粮食作物(小麦、水稻和玉米)之一，世界上每年总产 量达到6亿吨以上(http://faostat· fao. org/) 0小麦在我国得到了广泛的种植，我国的 小麦种植面积、总产量和消费量皆居世界首位，目前是我国的第三大粮食作物，仅次于水稻 和玉米。小麦之所以能够在世界各地得到很好的发展，最关键的是小麦具有独特的特性，其 面粉可以被加工成各种各样的面食，如面包、蛋糕、饼干、面条和馒头等。这种独特特性的 形成主要依赖于小麦籽粒储藏蛋白——面筋蛋白的结构和相互作用，即小麦面粉加工品质 的好坏主要取决于面筋蛋白的数量和质量。这些面筋蛋白之间可以通过很强的共价键和非 共价键相互作用，赋予面团粘弹特性。面筋蛋白主要包括醇溶蛋白(Gliadin)和麦谷蛋白 (Glutenin)，其中麦谷蛋白可以通过分子间二硫键形成大聚体，影响面团的弹性和强度。麦 谷蛋白按其分子量大小又分为高分子量麦谷蛋白亚基(high molecular weight glutenin subunits，简称 HMW-GS)和低分子量麦谷蛋白亚基(low molecular weight glutenin subunits,简称LMW-GS)，二者是面筋蛋白的主要成份，与小麦的加工品质密切相关，赋予面 团弹性，共同决定小麦面粉加工品质。高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)基因拷贝数较少，分子量较大，易于通过 SDS-PAGE进行鉴定，其等位基因变异与小麦品质的关系已经得到了广泛深入的研究。 LMW-GS基因大多数被定位到第一同源群1A、1B和ID染色体的短臂末端，命名为Glu_A3、 Glu-B3和Glu-D3位点，其基因的拷贝数目前尚不清楚。通过Southern印迹分析，在六倍体 普通小麦中LMW-GS基因的拷贝数可能为10-15个，也有研究认为可能为35-40个。LMW-GS 基因没有内含子，是一个单一的开放阅读框，其编码序列一般含有900-1200个碱基，其编 码的成熟蛋白亚基的分子量大小约30-45kDa。一般而言，LMW-GS可以分成信号肽(20个氨 基酸残基)、N-末端区(13个氨基酸残基)、重复区域和C-末端区四个部分，而且C-末端 区域可进一步细分为3个区，分别是C-I区、C-II区和C-III区(图1)。由于低分子量麦谷蛋白亚基对小麦面粉加工品质的形成具有重要作用，对其编码 基因的数目和组成的探索一直是小麦品质改良课题的研究热点。对LMW-GS基因的分离和 克隆，早期是通过探针杂交筛选文库的方法获得的。随着PCR技术的发展，同源基因克隆作 为一种快速可靠的方法，在小麦及其近缘物种的LMW-GS基因研究中得到广泛应用。Zhao 等分析了多个小麦品种Glu-D3位点的基因组成，发现在一个品种中存在6个编码基因； Wang等对Glu-B3位点基因的分析，发现了 4个编码基因，共有17种单体型；而Zhang等 对Glu-A3位点编码i类蛋白的基因做了分析，但是对基因和单体型的数目并未形成具体 的结论。随着基因文库技术的发展，对LMW-GS基因的组成有了更深入的研究。Ikeda等利 用cDNA文库的筛选和常规PCR的方法从Norin61中分离得到了 12类LMW-GS基因，并利 用中国春缺四体将这些基因分别定位到了 Glu-A3(3类)、Glu-B3(2类)和Glu_D3 (7类)位点上。Huang等利用BAC文库筛选的方法，从Glenlea中分离得到了 19个LMW-GS基因， 其中12个基因具有完整的开放读码框，染色体定位分析表明，1个基因位于Glu-A3位点 (EU189087)，2 个基因位于 Glu_B3 位点(EU189088and EU189089)，而 Glu_D3 位点有 9 个基 因(EU189090-EU189098)。以上研究极大地丰富了人们对低分子量麦谷蛋白亚基基因组成 的认识。但是，由于LMW-GS基因数目较多，常规同源克隆的方法具有很大的盲目性，而且 操作繁琐；而文库构建和筛选的方法则工作量太大，效率低。目前为止，尚没有简便有效的 方法分离鉴定LMW-GS基因，无法明确LMW-GS基因的数目和组成，这极大地阻碍了对不同 LMW-GS与面粉品质形成之间关系的研究。

发明内容
本发明的一个目的是提供一种一种辅助检测目的基因家族的基因种类的方法。本发明所提供的辅助检测目的基因家族的基因种类的方法，包括如下步骤1)根据待测目的基因家族的已知基因序列设计引物对；所述待测目的基因家族 的基因均具有保守序列区I和保守序列区II，且所述保守序列区I和所述保守序列区II之 间的序列在所述目的基因家族的不同基因间具有多态性；所述引物对中的一条引物序列位 于所述保守序列区I中，所述引物对中的另一条引物序列位于所述保守序列区II中；2)用步骤1)得到的引物对对待测材料进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；3)检测所述PCR扩增产物的多态性，根据所述PCR扩增产物的多态性确定所述待 测材料中待测目的基因家族的基因种类。上述方法中，所述目的基因家族为麦谷蛋白基因家族。
上述方法中，所述多态性为长度多态性。上述方法中，所述麦谷蛋白基因家族为低分子量麦谷蛋白亚基基因家族；上述方法中，所述保守序列区I和保守序列区II之间的序列具有重复序列。上述方法中，所述待测材料为小麦。上述方法中，所述待测材料为小麦品种。上述方法中，所述引物对为如下1)或2)或3)所示1)SEQ ID 1, SEQ ID 2 ；2) SEQ ID 1, SEQ ID 3 ；3)由如下a、b和c所示引物对组成a.SEQ ID 4, SEQ ID 5 ；b、SEQ ID :6，SEQ ID :7 ；c、SEQ ID :8，SEQ ID :9。上述方法中，所述根据PCR扩增产物的多态性确定所述待测材料中待测目的基因 家族的基因种类的方法为将所述PCR扩增产物的长度种类数目作为所述待测目的基因家 族中的基因种类数目；(即一种长度的PCR扩增产物对应一种基因)。所述检测所述PCR扩增产物的长度多态性的方法为如下I或II所示I、用DNA分析仪对所述PCR扩增产物长度进行检测，检测到的信号峰的数目即为 所述PCR扩增产物长度种类数目；所述引物对用荧光基团标记；II、对所述PCR扩增产物进行测序。
本发明的另一个目的是提供一种辅助检测目的基因家族中基因种类的试剂盒。本发明所提供的辅助检测目的基因家族中基因种类的试剂盒，为如下1)或2)或 3)所示的引物对1)SEQ ID 1, SEQ ID 2 ；2) SEQ ID 1, SEQ ID 3 ；3)由如下a、b和c所示引物对组成a.SEQ ID 4, SEQ ID 5 ；b、SEQ ID :6，SEQ ID :7 ；c、SEQ ID :8，SEQ ID :9。上述试剂盒中，所述目的基因家族为麦谷蛋白基因家族。上述试剂盒中，所述麦谷蛋白基因家族为低分子量麦谷蛋白基因家族。本发明的目的是为解决普通小麦低分子量麦谷蛋白亚基基因的分离鉴定的技术 问题，提供一种检测方法，有助于快速有效地分离鉴定小麦LMW-GS基因。该方法是基于普 通小麦品种中LMW-GS基因的特点序列间部分区域的保守性及长度多态性(即中间重复区 两端的序列具有很高的保守性，重复区的序列又具有很高的长度多态性)，在保守的区域设 计基因间保守的PCR引物，通过PCR的方法扩增得到这些LMW-GS基因的DNA片段，然后通 过一定的检测方法(3730DNA分析仪)来展示这些DNA片段之间的多态性，进而可以达到鉴 定一个小麦品种中所有LMW-GS基因的目的。应用该策略可以建立基因分子标记检测体系， 对LMW-GS基因进行快速有效的分离鉴定，也可以对其他麦类作物的LMW-GS基因进行分离 鉴定；这种分子标记体系构建策略也可以进一步推广到对具有类似的序列保守性和长度多 态性的复杂多基因家族的成员分离鉴定。本发明方法中，根据实验室前期研究的结果以及Genbank中的LMW-GS基因序列所 设计的引物，用保守引物进行LMW-GS基因分离鉴定的验证试验证明了该引物的保守性和 有效性，也表明了该分子标记体系的准确性和可靠性。本发明方法，无需昂贵的仪器和试剂，通过常规的PCR仪和3730DNA分析仪就可以 完成，易于操作。本发明方法基于3730DNA分析仪极高的灵敏度和分辨率，可以有效分离并 准确鉴定不同的LMW-GS基因。在本发明方法中，通过一次PCR反应可以检测一个小麦品种 中几乎所有的LMW-GS基因，而且PCR仪和3730DNA分析仪都是高自动化和高通量的仪器， 一人一天可以分析近三百个小麦品种。本发明方法克服了传统的同源克隆测序方法的繁复 性和无目的性，也无需耗费大量的人力物力构建和筛选基因文库，极大地提高了 LMW-GS基 因鉴定的效率和准确性。本发明的基于序列保守性和长度多态性的分子标记构建策略，不仅适用于低分子 量麦谷蛋白亚基基因分子标记检测体系的构建，同样适用于具有序列保守性和长度多态性 的多基因家族分子标记检测体系的构建。该发明将直接促进LMW-GS基因家族成员数目、组 成以及LMW-GS对小麦面粉加工品质形成的贡献等研究的深入开展。


图1典型的小麦低分子量麦谷蛋白亚基一级结构示意图。Sig，信号肽，N_ter，N末端区；R印，重复区；C-ter I，II和III，C末端I区，II区和III区。图2普通小麦小偃54低分子量麦谷蛋白亚基序列比对分析。Sig，信号肽，N_ter，N末端区；R印，重复区；C-ter I，II和III，C末端I区，II区 和III区。框中所列出的数字展示了不同低分子量麦谷蛋白亚基之间在重复区域的长度多 态性。图3低分子量麦谷蛋白亚基基因保守的PCR引物在基因中的具体位置。图中框表示保守引物所在的区域。三套引物分别是LMWGS1(LMW_GS1，2F与 LMW-GS1R)，LMWGS2(LMWGS1，2F 与 LMWGS2R)和 LMWGS3(LMWGS3aF 与 LMWGS3aR，LMWGS3bF 与 LMWGS3bR, LMWGS3cF 与 LMWGS3cR)。图4利用保守引物对小偃54低分子量麦谷蛋白亚基基因进行分析，利用琼脂糖凝 胶电泳检测PCR产物。图5利用保守引物对小偃54低分子量麦谷蛋白亚基基因进行分析，利用3730DNA 分析仪检测PCR产物。横轴表示DNA片段大小，纵轴表示信号强度，即PCR产物的量的多少； 图中的空心峰表示分子量标准(1200 LIZ Standard内标)，实心峰表示PCR产物中的特异 DNA片段，对应着一个特异的低分子量麦谷蛋白亚基基因。图6利用保守引物对中国春低分子量麦谷蛋白亚基基因进行分析，利用3730DNA 分析仪检测PCR产物。横轴表示DNA片段大小，纵轴表示信号强度，即PCR产物的量的多 少；图中的空心峰表示分子量标准(1200LIZ Standard内标)，实心峰表示PCR产物中的特 异DNA片段，对应着一个特异的低分子量麦谷蛋白亚基基因。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、检测小麦品种小偃54低分子量麦谷蛋白基因家族中基因种类数目一、引物设计首先利用ClustalW2软件将普通小麦小偃54的低分子量麦谷蛋白进行多序列比 对，发现这些蛋白序列存在两个特点序列保守性和长度多态性(图2)。由图2可以发现， 第一、信号肽区(Sig)、N-末端区(N-ter)和C-末端I区(C_ter I)在不同蛋白序列之间 存在很高的保守性；第二、LMW-GS序列间在重复区域(Rep)存在很高的长度多态性，图2中 的一组数字(134，137，140，150，182，184，197，199，200，230，238)可以很好地展现这种多 态性。基于这两个特点，提出了一种LMW-GS基因检测策略根据保守的区域的编码序列设 计基因间保守的PCR引物，通过PCR的方法扩增得到这些LMW-GS基因的DNA片段，然后检 测(利用3730DNA分析仪)展示这些DNA片段之间的多态性，进而实现对一个小麦品种中 所有LMW-GS基因的分离鉴定。将小偃54中的LMW-GS基因进行了多序列比对，根据其保守的区域(信号肽区、 N-末端区和C-末端I区的编码序列)的编码序列设计PCR引物。为了提高实验的重复性
7和准确度，设计了 3套PCR引物，分别是LMWGS 1、LMWGS2和LMWGS3。LMWGSl和LMWGS2均有一对引物组成，理论上他们均可以扩增一个小麦品种中所有的LMW-GS基因，而LMWGS3由三 对独立的引物组成(LMWGS3a，LMWGS3b和LMWGS3c)(图3)，分别可以扩增不同的LMW-GS基 因，这些基因共同组成小麦中的LMW-GS基因家族。这三套保守引物的所得到的检测结果可 以相互验证。为了进一步提高所设计PCR保守引物的代表性，利用关键词“(low glutenin) 0R(lmw glutenin) OR(LMW GS) AND Triticum AND Complete”，从Genbank 中下载了 384条完 整的LMW-GS基因序列，并将它们进行了多序列比对。然后将所设计的PCR引物与Genbank 中的序列进行比较，并根据所发现的差异将设计的PCR保守引物进行修正，提高所设计引 物的保守性，使所设计的保守PCR引物能够代表目前已知的所有LMW-GS基因(表1)。表1、低分子量麦谷蛋白亚基基因的兼并保守PCR引物 *表示的是该引物5’端被6FAM标记。二、PCR 扩增小偃54种子购自河南舞阳县种子公司。利用CTAB法从小偃54的幼苗中提取基 因组DNA。由于LMW-GS基因序列中G/C含量较高，所以在PCR反应中使用LATaq酶(Takara 公司产品)。首先在Takara公司合成荧光基团6FAM标记的引物，利用表1的引物以小偃 54基因组DNA为模板进行PCR，反应体系如下LA Taq (5U/ μ L) (Takara 公司) 0. 2 μ LIOXbuffer II(Mg2+)2μ L
dNTP (2mM)4 u L上游引物(6iiM)luL下游引物(6iiM)luLddH2010. 8u L模板DNA (lOOng/ u L)1 u L_反应体系为20iiL利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR的扩增效果(图4)，由于琼脂糖电泳的分辨率比较 低，只能检测到2条清晰的条带，无法充分展示PCR产物的长度多态性。为了进一步检测 PCR产物的组成，采用3730DNA分析仪，该仪器具有很高的分辨率，可达lbp，已被广泛应用 于DNA片段分析研究中，例如微卫星标记、扩增片段长度多态性和DNA足迹分析。三、PCR扩增产物种类检测用ddH20将PCR产物稀释为原浓度的1/30，取稀释产物1 y L到一个新的96孔板 (ABI公司产品)中，每孔再加入7 iiL甲酰胺(含有0. liiL LIZ-1200size standard) (ABI 公司产品)，将混合物在95°C条件下变性5分钟，然后在冰上静置10分钟。利用3730DNA分析仪对变性的PCR产物进行检测，检测结果如图5。利用 GeneMapper软件分析检测到的信号峰所对应的DNA片段大小(表2)。可以发现保守引物 LMWGS1和LMWGS2的PCR产物均分别可检测到有15个和16个信号峰，综合引物LMWGS3中 三对引物的检测结果，也可以发现16个信号峰(A，7个信号峰；B，6个信号峰；1，3个信号 峰)。比较三套PCR引物的检测结果(图5)，可以发现不同引物的PCR产物的信号峰是彼 此对应的，即三套保守引物的PCR产物检测图谱之间存在很高的一致性。利用本发明的方 法可以从小偃54中检测到17个信号峰，即17个DNA片段，相当于可以检测到17个LMW-GS 基因，这与从小偃54中分离得到13个LMW-GS基因(FJ7553302至FJ7553307，和FJ7553309 至FJ7553315)的结果比较吻合。表2、利用分子标记体系从小偃54中实际检测到的DNA片段的验证分析 相似性是指检测到的基因与数据库中的基因的相似性，FJ755302至FJ755307和 FJ755309至FJ755315是已报道的小偃54中的LMW-GS基因；一表示无该片段；N表示应当有该DNA片段，但没有检测到；LGS2-477, LGS2-590, LGS2-655，LGS2-690 为检测到的 4 个新的 LMW-GS 基因。四、利用测序的方法验证低分子量麦谷蛋白基因分子标记体系的有效性已知小偃54中分离得到14个LMW-GS基因，其中13个基因具有完整的DNA序列， 另外的1个基因由于转座子的插入而使基因分成两个部分。为了验证保守引物PCR得到的 17个DNA片段是否都是LMW-GS基因的序列，将3730DNA分析仪检测到的DNA片段大小与理 论的DNA片段大小进行了比较(表2)。DNA片段的实际检测大小与理论分析大小存在一定 的偏差，这种偏差是由于3730DNA分析仪的系统误差造成的，剔除这种系统误差，可以发现 实际检测值和理论值之间可以很好地匹配。分析发现13个已知LMW-GS基因均可以从PCR 产物中找到其对应的DNA片段，即从片段长度上来讲，检测的DNA片段均可以与已知的基因 很好地匹配。更进一步，为了验证检测到的这17个DNA片段是否是LMW-GS基因，将PCR产物 进行了 pGEM-T载体连接和转化，然后再用荧光标记的PCR保守引物进行菌落PCR，利用 3730DNA分析仪对菌落PCR产物进行检测，分离含有目标大小DNA片段的克隆，通过测序得 到DNA片段的序列。将得到的序列与小偃54中已知的基因进行多序列比对，发现其中的13 个DNA片段的序列与已知基因的序列完全一致，相似性达到了 100%。除了可以检测到已知 的13个基因，通过该分子标记体系还鉴定得到了 4个新的DNA片段(477，590，655和690 ； 以引物LMWGS2扩增得到的DNA片段大小来表示)，序列分析表明，它们都属于LMW-GS基因。 通过在线Blast分析发现，这4个序列与Genbank中的LMW-GS基因具有很高的相似性，达 到97%以上。进而根据DNA片段的大小，将这4个新基因分别命名为LGS-477，LGS-590，
10LGS-655和LGS-690。DNA片段大小比较和序列比对的分析结果表明，三套保守引物所扩增 的DNA片段都属于LMW-GS基因。这些结果都表明了所建立的LMW-GS分子标记体系的准确 性和有效性，也证实了该分子标记体系构建策略的可行性。实施例2、检测小麦品种中国春低分子量麦谷蛋白基因家族中基因种类数目一、引物设计采用实施例1中所 设计的各对低分子量麦谷蛋白基因保守引物(表1)。二、PCR 扩增中国春购自河南舞阳县种子公司。利用表1的引物以中国春幼苗的基因组DNA为模板进行PCR，反应体系如下LA Taq (5U/ μ L) (Takara 公司) 0. 2 μ LIOXbuffer II(Mg2+)2μ LdNTP (2mM)4 μ L上游引物(6μ Μ)1 μ L下游引物(6μ Μ)1 μ LddH2010. 8 μ L模板DNA (1 OOng/ μ L)1 μ L_反应体系为20 μ L三、PCR扩增产物种类检测用ddH20将PCR产物稀释为原浓度的1/30，取稀释产物1 μ L到一个新的96孔板 (ABI公司产品)中，每孔再加入7μ L甲酰胺(含有0. IyL LIZ-1200 size standard) (ABI 公司产品)，将混合物在95°C条件下变性5分钟，然后在冰上静置10分钟。利用3730DNA分析仪对变性的PCR产物进行检测，检测结果如图6。利用 GeneMapper分析检测到的信号峰所对应的DNA片段大小(表3)。可以发现保守引物LMWGSl 和LMWGS2的PCR产物均分别可检测到有15个和14个信号峰，综合引物LMWGS3中三对引 物的检测结果，可以发现16个信号峰(A，7个信号峰；B，7个信号峰；I，2个信号峰)。比较 三套PCR引物的检测结果(图6)，可以发现不同引物的PCR产物的信号峰是彼此对应的，即 三套保守引物的PCR产物检测图谱之间存在很高的一致性。利用本发明的方法，通过PCR 反应和3730DNA分析仪，从中国春中检测到了 16个信号峰，即16个DNA片段，对应着16个 LMW-GS 基因。四、利用利用测序的方法验证低分子量麦谷蛋白基因分子标记体系的有效性为了验证检测到的DNA片段是否都是LMW-GS基因，将这些DNA片段进行了测序。 对于中国春的LMW-GS基因已经有初步的研究，在Genbank中也存在一些序列，进一步将DNA 片段的序列与数据库中发表的中国春中的LMW-GS基因序列进行比较，发现DNA片段序列可 以与以报道的序列只存在个别的SNP的差异，相似性均在99%以上(表3)。这样，除了已经 报道的8个LMW-GS基因之外，利用本发明的方法在中国春中还检测得到了 8个新LMW-GS基 因的DNA片段。在中国春中的检测结果也进一步证明了本发明检测方法准确性和可靠性。表3、利用分子标记体系从中国春中实际检测到的DNA片段的验证分析 序列号(Genbank)中所列出的是数据库中已发表的中国春中的LMW-GS基因序列。一表示无该片段；N表示应当有该DNA片段，但没有检测到。实施例3、检测其他小麦品种低分子量麦谷蛋白基因家族中基因种类数目利用本发明方法已经有效分析了小麦育种中的骨干亲本(200多份)的低分子量 麦谷蛋白基因的组成，用于指导分子育种实践，随机选取其中的12个品种进行展示。一、引物设计采用实施例1中所设计的各对低分子量麦谷蛋白基因保守引物(表1)。二、PCR 扩增所用的小麦品种，小偃6，陕253，PH-82-2，郑农16，农大340，PH85-16，农大135，PH3259，白春5号，小偃81，农大195，农大1193，均购自河南舞阳县种子公司，利用常规的 CTAB法提取基因组DNA。利用表1的引物以基因组DNA为模板进行PCR，反应体系如下LA Taq (5U/ u L) (Takara 公司)0. 2 ii L10XbufferII (Mg2+) 2 u LdNTP (2mM)4 u L上游引物(6iiM)luL下游引物(6iiM)luLddH2010. 8u L模板DNA(100ng/ u L) 1 u L_反应体系为20iiL三、PCR扩增产物种类检测用ddH20将PCR产物稀释为原浓度的1/30，取稀释产物1 ii L到一个新的96孔板 (ABI公司产品)中，每孔再加入7 iiL甲酰胺(含有0. liiL LIZ-1200size standard) (ABI 公司产品)，将混合物在95°C条件下变性5分钟，然后在冰上静置10分钟。利用3730DNA分析仪对变性的PCR产物进行检测，检测结果用GeneMapper 3. 5进 行分析，检测到的信号峰所对应的DNA片段大小整理在表4中。再将PCR产物进行测序，根 据测序结果判定的基因长度多态性数目与用3730DNA分析仪判定的基因长度多态性数目 一致，即用测序方法检测出的基因种类数目结果与用3730DNA分析仪方法检测出的基因种 类数目是一致的。为了便于理解和容易比较，在表4中只呈现了保守引物LMWGS2为代表的DNA片 段。利用该保守引物，在每个小麦品种中均可以检测到十几个信号峰，即十几个DNA片段， 对应着十几个LMW-GS基因。比较这12个小麦品种的检测结果，可以发现DNA片段492、 499、501、637、655、682和684在这些小麦品种中是普遍存在的，序列分析也表明，具有相同 大小的DNA片段在序列组成上具有很高的相似性(彡98% )，只存在个别的SNP。另外，其 他基因的不同等位变异之间存在长度的差异，如477与485(Glu-A3)，但是序列比对发现， 这两种等位变异之间也存在很高的序列相似性(》95% )，仅在重复区域存在相应的序列 缺失。这些比较结果表明，在不同的小麦品种中，LMW-GS基因的不同等位变异是很保守的， 某个DNA片段与LMW-GS基因的特定等位变异是一一对应的，可以利用本发明的方法，通过 检测PCR产物DNA片段的组成来判定某个小麦品种中的LMW-GS基因家族成员的组成。表4.利用分子标记体系对小麦育种中的骨干亲本(随机选取其中的12个品种) 的LMW-GS基因组成进行分析。
权利要求
一种辅助检测目的基因家族的基因种类的方法，包括如下步骤1)根据待测目的基因家族的已知基因序列设计引物对；所述待测目的基因家族的基因均具有保守序列区I和保守序列区II，且所述保守序列区I和所述保守序列区II之间的序列在所述目的基因家族的不同基因间具有多态性；所述引物对中的一条引物序列位于所述保守序列区I中，所述引物对中的另一条引物序列位于所述保守序列区II中；2)用步骤1)得到的引物对对待测材料进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；3)检测所述PCR扩增产物的多态性，根据所述PCR扩增产物的多态性确定所述待测材料中待测目的基因家族的基因种类。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述目的基因家族为麦谷蛋白基因家族；所述多态性为长度多态性。
3.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于所述麦谷蛋白基因家族为低分子量 麦谷蛋白亚基基因家族；所述保守序列区I和保守序列区II之间的序列具有重复序列。
4.根据权利要求4-6中任一所述的方法，其特征在于所述待测材料为小麦。
5.根据权利要求4-7中任一所述的方法，其特征在于所述待测材料为小麦品种。
6.根据权利要求4-8中任一所述的方法，其特征在于所述引物对为如下1)或2)或 3)所示1)SEQID :1，SEQ ID 32)SEQID 1, SEQ ID 2 ；3)由如下a、b和c所示引物对组成a、SEQID 4, SEQ ID 5 ；b、SEQID 6, SEQ ID 7 ；c、SEQID :8, SEQ ID :9。
7.根据权利要求4-9中任一所述的方法，其特征在于所述根据PCR扩增产物的多态性确定所述待测材料中待测目的基因家族的基因种类 的方法为将所述PCR扩增产物的长度种类数目作为所述待测目的基因家族中的基因种类 数目；所述检测所述PCR扩增产物的长度多态性的方法为如下I或II所示I、用DNA分析仪对所述PCR扩增产物长度进行检测，检测到的信号峰的数目即为所述 PCR扩增产物长度种类数目；所述引物对用荧光基团标记；II、对所述PCR扩增产物进行测序。
8.一种辅助检测目的基因家族中基因种类的试剂盒，为如下1)或2)或3)所示的引物对1)SEQID :1，SEQ ID 32)SEQID 1, SEQ ID 2 ；3)由如下a、b和c所示引物对组成a、SEQID 4, SEQ ID 5 ；b、SEQID 6, SEQ ID 7 ；C、SEQ ID 8, SEQ ID :9。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于所述目的基因家族为麦谷蛋白基因家族。
10.根据权利要求8或9所述的试剂盒，其特征在于所述麦谷蛋白基因家族为低分子量麦谷蛋白基因家族。
全文摘要
本发明公开了一种检测基因家族中基因种类的方法及专用试剂盒。该试剂盒，为如下1)、2)或3)所示的引物对1)SEQ ID1，SEQ ID2；2)SEQ ID1，SEQ ID3；3)由如下a、b和c所示引物对组成a、SEQ ID4，SEQ ID5；b、SEQ ID6，SEQ ID7；c、SEQ ID8，SEQ ID9。利用该引物对进行PCR反应，结合毛细管电泳系统，可以简便而有效地分离普通小麦低分子量麦谷蛋白基因组成。本发明方法，无需昂贵的仪器和试剂，通过常规的PCR仪和DNA分析仪就可以完成，易于操作。通过一个PCR反应可以检测一个小麦品种中几乎所有的LMW-GS基因，简便而且具有很高的通量。
文档编号C12Q1/68GK101871012SQ20101021970
公开日2010年10月27日 申请日期2010年6月28日 优先权日2010年6月28日
发明者刘冬成, 孙家柱, 张爱民, 张相岐, 张肖飞, 王道文, 郭小丽, 阳文龙 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所