一种多重基因的检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种多重基因的检测方法，包括以下步骤：1)生产多重基因检测试剂盒；2)采集患者血液样品，并提取核酸；3)以样品核酸为模板进行反转录；4)以反转录产物为模板进行PCR反应；5)以毛细电泳的方法分离样品。本发明所采用的检测方法灵敏度高，重复性好，可将精确分离一个碱基数量差异的片段，能有效分辨出特异性产物，对病原体基因拷贝数的定量检测有着与荧光定量PCR同样的高精确性。
【专利说明】
一种多重基因的检测方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种基因检测方法，具体涉及一种丙型肝炎治疗用药指导的多重基因检测方法。
【背景技术】
[0002]丙型肝炎病毒感染者中有超过70%发展成慢性丙型肝炎，在10?20中有20%?50%进展成肝硬化，1%?2%发展成肝细胞肝癌，危害严重。丙型肝炎的抗病毒治疗是缓解和抑制肝硬化和肝癌的重要途径。
[0003]但抗HCV药物昂贵，对不同病情有不同用药标准需要检测多种信息以辅助用药治疗。目前，主流的检测方法缺点是:技术成本昂贵、复杂:每个样品需要一个芯片，成本高，不利于大规模推广;探针的合成与固定比较复杂。
[0004]不能精确定量，重复性差。灵敏度较低:芯片法需核酸量较大，一般须先做多重PCR扩增，由于引物较多，容易自身产生二聚体，或由于Tm值不同，而导致扩增目的片段效率不同，进而影响检测的灵敏度。
[0005]基于此，实验室研发人员研究开发了一种多重基因的检测方法。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种高通量、准确定量、灵活性强、成本低的一种多重基因检测方法。
[0007]本发明的通过下述技术方案实现:
[0008]—种多重基因的检测方法，包括如下步骤:
[0009]I)生产多重基因检测试剂盒；
[0010]2)采集患者血液样品，并提取核酸；
[0011 ] 3)以样品核酸为模板进行反转录；
[0012]4)以反转录产物为模板进行PCR反应；
[0013]5)以毛细电泳的方法分离样品。
[0014]进一步地，所述步骤3)包括按比例在样品板上加入试剂和样品、混匀后发分别在50 °C、40 °C、100 °C、2 V 的温度下孵育。
[0015]进一步地，所述步骤I)中的试剂盒包括:反转录引物管、PCR引物管、25mM氯化镁、DNA聚合酶、阳性对照。
[0016]进一步地，所述步骤4)中混匀后进行热循环。。
[0017]进一步地，所述步骤4)的子步骤中的热循环温度分别为50°(:、40°(:、95°(:、2°(:。
[0018]进一步地，所述步骤5)包括制备GeXP遗传分析仪样品、准备分离液、毛细电泳分离样品、结果分析的步骤。
[0019]本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果:
[0020](I)本发明所采用激光诱导荧光-PMT，具有超高灵敏度，重复性好。
[0021](2)本发明所采用的多重基因检测方法:可以在一个反应当中同时检测丙型肝炎病毒的RNA水平和人类的SNP位点并检测
[0022](3)本发明所述的检测方法可精确定量:对病原体基因拷贝数的定量检测有着与荧光定量PCR同样的高精确性。
[0023](4)本发明所述检测方法灵活性强，可随时根据需求增加或修改所需研究的SNP位点。
[0024](5)本发明所述的检测方法检测成本低，每个样品的检测成本少于Y50，包括了丙型肝炎病毒RNA定量检测、人类SNP位点的检测和感染病毒亚型多种信息，利于大规模推广。
【具体实施方式】
[0025]为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
[0026]实施例1:
[0027]实施例针对了一种同步检测丙型肝炎病毒RNA水平、人类相关SNP位点和感染丙型肝炎病毒亚型的多重基因检测方案。检测步骤(详见第四节:【具体实施方式】):采集患者样品(血样)，提取核酸，以之为模板进行反转录和PCR反应，最终用毛细电泳方法分离PCR产物。
[0028]1、主要步骤:
[0029]I)定量检测样品丙型肝炎病毒RNA水平。
[0030]2)检测与丙型肝炎治疗用药相关的SNP位点:rsl2979860和rs8099917。
[0031]3)检测丙型肝炎病毒亚型:1&、113、2、23、33、313、6共七种亚型。
[0032]2、建立对照。
[0033]I)人DNA和人RNA完整性的对照内参:确保在检验过程中对样品质量的判断，避免假阴性。
[0034]2)正常反应对照内参:监控PCR反应效率，避免假阴性。
[0035]3)多重基因检测的引物设计。
[0036]具体实施步骤如下:
[0037]1、配合贝克曼库尔特公司的试剂盒GeXP Start kit，生产多重基因检测试剂盒，试剂盒中包括:
[0038]I)反转录引物管(RT primer mix)
[0039]2)PCR引物管(PCR primer mix)
[0040]3)25mM 氯化镁(MgC12)
[0041 ] 4)DNA聚合酶(Taq DNA Polymerase)
[0042]5)阳性对照(Positive Control)
[0043]2、采集患者的血液样品，并提取核酸。
[0044]3、以患者核酸为模板进行反转录:
[0045]I)按以下比例在96孔样品板上加入试剂和样品:
[0046]RT反应试剂量/孔Dnase/Rnase Free水8yL RT缓冲液，5X 4yL RT引物2yL RIfilyUfSRNA(5-20ng/ul)5yL Total 20yL
[0047]注:阳性对照:lyL/反应
[0048]2)混匀后按以下温度孵育:
[0049]步骤温度时间I 50°C1分钟2 40°C60分钟3 100°C5分钟4 2°C持续:直至收取RT产物
[0050]4、以反转录产物为模板进行PCR反应
[0051]I)按以下比例在96孔样品板上加入试剂和样品(PCR板):
[0052]PCR反应试剂量/孔PCR缓冲液，1X 2yL 25mM MgC12 4yL PCR引物2yL CMOl 2yLDNA聚合酶0.3yL RT产物9.7yL Total 20yL
[0053]2)混匀后按以下温度进行热循环反应:
[0054]步骤温度时间I 94°C1分钟2 94°C30秒钟3 50°C30秒钟4 70°CI分钟5N/A重复2_4步骤34次(共35次)6 70°C1分钟7 2°C持续:直至收取PCR产物
[0055]5、GenomeLab GeXP遗传分析仪毛细电泳分离样品
[0056]I)制备 GeXP 样品:
[0057]GeXP样品量/孔SLS上样液38.5yL DNA大小标准400 0.5yL PCR产物IyL Total 40yL矿物油I滴
[0058]注:PCR产物量可为0.Ι-UiL，或用水按需要预稀释后上样。
[0059]2)准备分离液:将约220yL分离液加入96孔分离液板上适当数目的孔中。
[0060]3)毛细电泳分离样品。
[0061]6、结果分析。
[0062]显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化和变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
【主权项】
1.一种多重基因的检测方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)生产多重基因检测试剂盒； 2)采集患者血液样品，并提取核酸； 3)以样品核酸为模板进行反转录； 4)以反转录产物为模板进行PCR反应； 5)以毛细电泳的方法分离样品。2.根据权利要求1所述的一种多重基因的检测方法，其特征在于:所述步骤3)包括按比例在样品板上加入试剂和样品、混匀后发分别在50°C、4(TC、10(rC、2°C的温度下孵育。3.根据权利要求1或2所述的一种多重基因的检测方法，其特征在于:所述步骤I)中的试剂盒包括:反转录引物管、PCR引物管、25mM氯化镁、DNA聚合酶、阳性对照。4.根据权利要求2所述的一种多重基因的检测方法，其特征在于:所述步骤4)中混匀后进行热循环。5.根据权利要求4所述的一种多重基因的检测方法，其特征在于:所述步骤4)的子步骤中的热循环温度分别为50 °C、40 °C、95 °C、2 °C。
【文档编号】C12Q1/68GK105821151SQ201610380752
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年5月31日
【发明人】黄平, 欧阳小峰, 毛家丽, 涂大连
【申请人】四川金域医学检验中心有限公司