一种转基因epsps检测elisa试剂盒的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于转基因作物食品检测技术领域，尤其涉及一种转基因EPSPS检测ELISA试剂盒的方法。
【背景技术】
[0002]转基因技术关系到国家未来粮食生产技术的自主性和创新性，大力推进转基因技术的自主研发，占领转基因技术的制高点对于国家安全具有重大意义。但由于转基因食品的安全性仍存在争议，国家对于转基因食品安全性有一套严格的安全评价体系，对市面上非法转基因食品的监管也在日益加强。如何充分合理地评估转基因粮食可能带来的风险，并未雨绸缪提前做好防范和规避风险的准备，已成为生产者和决策者面临的头等大事。
[0003]草甘膦是一种非选择性除草剂，其作用机理主要是竞争性抑制莽草酸途径中5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的活性。该合成酶是真菌、细菌、藻类、高等植物体内芳香族氨基酸生物合成过程中一个关键酶。草甘膦基天然存在于多个物种中，它们的长度及位置都有所不同，但是都能共同编码抗草甘膦酶5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶。通过该酶的作用，可以阻断草甘膦对生物合成途径的干扰，从而使菌种或植物不被草甘膦杀灭。因此，农作物中转入(EPSPS)基因，可使施用于农田的草甘膦只作用于杂草，而不影响作物的正常生长，因此，对于提高作物产量及减轻劳动量、提高劳动效率大有裨益。已成功实现转入该基因的作物有油菜、玉米、棉花及烟草等。
[0004]目前常用的转基因检测方法，如胶体金免疫层析检测条、PCR—聚合酶链式反应技术、荧光PCR技术等。荧光定量PCR(qPCR)技术是目前主流的分子检测技术，相关产品占据全球分子诊断市场的一半。然而这种技术由于核酸检测过程复杂、实现核酸扩增信号检测设备价格高、对实验室硬件条件要求高等问题，只局限于高端市场，普及推广困难，基层医疗和检测机构需求得不到满足。
【发明内容】
[0005]本发明提供了一种检测准确性好、能够一次实现多个转基因EPSPS检测ELISA试剂盒的方法，以解决上述技术问题。
[0006]为了达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的:
[0007]一种转基因EPSPS检测ELISA试剂盒的方法，包括如下步骤:
[0008]步骤一、免疫多肽混合样品的选择:所述免疫多肽混合样品选择编号是Pc_19 -32、Pc_67 - 77、Pc_141 - 156 和 Pc_312 - 324 的多肽混合样品；
[0009]步骤一■、EPSPS多克隆抗体的制备:第一次多妝混合样品加入等体积的完全弗氏佐剂完全乳化后，背部皮下注射免疫，每只兔子免疫混合多肽0.5mg，且后三次直接用不完全弗氏佐剂完全乳化免疫，每次间隔14天，免疫剂量和部位与第一次相同，所述最后一次免疫10天后，心脏取血，4°C保存过夜，1000glOmin 4°C离心，收集上清即为抗血清(多克隆抗体)；
[0010]步骤三、EPSPS多克隆抗体的纯化:抗体样品(即抗血清)加入1/10体积的Imol/L Tris (pH8.0)将PH调含至8.0，所述将抗体溶液通过蛋白A微球柱，且微球柱每毫升的湿微球能结合大约10 — 20ml抗体(I个蛋白A或蛋白G微球分子结合2分子抗体)，同时，记录装柱微球的大约体积，且微球柱的体积决定使用清洗和洗脱缓冲液的量；
[0011]步骤四、标准品的稀释:所述在第一孔中分别加标准品ΙΟΟμΙ，然后在第一孔中样品稀释液100 μ 1，混匀；然后从第一孔中取100 μ I分别加到第二孔，再在第二孔加样品稀释液100 μ 1，混匀；以此类推，到第七孔，混匀后取100 μ I弃掉，第八孔直接加加样品稀释液100 μ I ;
[0012]步骤五、样品加样:所述在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液90 μ 1，然后再加待测样品10 μ 1，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；
[0013]步骤六、温育、配液及洗涤:先用封板膜封板后置37°C温育60分钟；再将10倍浓缩洗涤液用蒸馏水10倍稀释后备用；小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复2次，拍干；
[0014]步骤七、EPSPS抗体的加入:每孔加入酶标试剂50 μ I (EPSPS抗体用抗体稀释液稀释50倍)，温育60分钟，洗涤5遍；
[0015]步骤八、HRP抗体的加入:每孔加入酶标试剂50 μ I (EPSPS抗体用抗体稀释液稀释50倍)，温育30分钟，洗涤5遍。
[0016]步骤九、显色剂和终止液的加入:每孔先加入显色剂(A50 μ 1+Β50 μ I)，轻轻震荡混匀，37°C避光显色15分钟；每孔加终止液50 μ 1，终止反应(此时蓝色立转黄色)；
[0017]步骤十、测定结果分析:以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(0D值)。
[0018]优选的，所述EPSPS多克隆抗体的纯化还包括如下步骤:
[0019]首先，用10倍柱体积的lOOmmol/LTris (ρΗ8.0)洗涤微球；
[0020]然后，用10倍柱体积的10m mo I/LTr is (pH8.0)洗涤微球；
[0021]最后，用50mmol/L甘氨酸(pH3.0)洗脱微球柱，每次加入约1/2柱体积的缓冲液，分次加入；接着用含1/10柱体积的lm0l/LTriS(pH8.0)的试管收集洗脱液，将各管缓慢摇匀，使其pH值恢复至中性，将含抗体的收集管混合，-20 0C保存。
[0022]进一步的说，所述对应第一孔至第八孔的浓度依次分别为10mg/L、5mg/L、2.5mg/L、l.2mg/L、0.6mg/L、0.3mg/L、0.15mg/L、0mg/Lo
[0023]与现有技术相比，本发明的优点在于:本试剂盒的抗体制备选择的多肽，具有极高的亲水性、免疫性以及特异性，产生抗体的效价高，特异性好，且检测的结果可靠；采用该检测方法，通量高和灵敏度高，能同时快速检测多个样品；还可以定性检测样品是否含有epsps成分，更能根据标准品准确算出其具体含量，可以用肉眼观察，也可以用酶标仪读取(D450),与标准曲线比较，可以精确定量EPSPS的含量。
【附图说明】
[0024]图1为本发明CP4-EPSPS氨基酸序列Q9R4E4.2 (孟山都)的示意图；
[0025]图2为本发明生物信息学分析候选免疫多肽的示意图；
[0026]图3为本发明EPSPS多克隆抗体的制备示意图；
[0027]图4为本发明EPSPS多克隆抗体的纯化示意图；
[0028]图5为本发明ELISA试剂盒检测图；
[0029]图6为本发明的检测流程图；
【具体实施方式】
[0030]以下将结合附图对本发明的技术方案进行详细说明:
[0031]如图1所示:为CP4-EPSPS氨基酸序列Q9R4E4.2 (孟山都);CP4_EPSPS为市场上主流抗除草剂基因，Q9R4E4.2为其在NCBI上的基因号。
[0032]如图2所示:为生物信息学分析候选免疫多肽；通过分析(Marani et al.，InSilico Peptide Predict1n for Antibody Generat1n to Recognize5~Enolpyruvylshikimate-3-Phosphate Synthase(EPSPS)in Genetically Modified Organisms.PeptideScience, 2015，104(2):91-100)文章，获得CP4-EPSPS候选免疫多肽，本发明免疫多肽混合样品选择的多肽编号是 Pc_19 - 32、Pc_67 - 77、Pc_141 - 156 和 Pc_312 - 324。
[0033]如图3所不:EPSPS多克隆抗体的制备；第一次多妝混合样品加入等体积的完全弗氏佐剂(Complete Freund’s adjuvant)完全乳化后，背部皮下注射免疫，每只兔子免疫混合多肽0.5mg。后三次直接用不完全弗氏佐剂(incomplete Freund’s adjuvant)完全乳化免疫，每次间隔14天，免疫剂量和部位与第一次相同。最后一次免疫10天后，心脏取血，4°C保存过夜，10000g 1min 4°C离心，收集上清即为抗血清(多克隆抗体)。
[0034]如图4所示:EPSPS多克隆抗体的纯化。抗体样品(即抗血清)加入1/10体积的lmol/L Tris (pH8.0)将PH调含至8.0，所