PCR检测多房棘球蚴的方法及检测试剂盒与流程

本发明涉及生物检测技术领域，尤其是涉及一种PCR技术检测多房棘球蚴的方法。

背景技术：

棘球蚴病(Echinococcosis)俗称包虫病(hydatid disease),是由棘球绦虫的幼虫棘球蚴寄生于动物(包括人)的肝、肺等组织器官引起的一种人畜共患寄生虫病。该病流行于全球广大牧业区，是全球性公共卫生的重要问题之一。在中国，棘球蚴病广泛流行于北方和西南地区，是一种危害极其严重的人畜共患寄生虫病。棘球属绦虫被公认至少有9个种，分别是细粒棘球绦虫(E.granulosus)、多房棘球绦虫(E.mulitilocularis)、伏氏棘球绦虫(E.vogeli)、少节棘球绦虫(E.oligarthra)、石渠棘球绦虫(E.shiquicus)、加拿大棘球绦虫(E.canadensis)、奥氏棘球绦虫(E.ortleppi)和猫棘球绦虫(又名狮棘球绦虫，E.felidis)。其中多房棘球蚴感染人后为泡型棘球，又称泡球蚴病(alveolar echinococcosis,AE)或泡型包虫病，其每年新发病例约为18235例，其中91％的患者在中国。多房棘球蚴在早期寄生于中间宿主肝内，致局部肝组织病变、增生、肝纤维化、萎缩、变性和坏死，而临床症状不明显；晚期似肝癌样转移，能转移至肺、脑、乳腺等脏器，即使进行肝部分或半叶切除治疗，术后复发率也很高，故临床有“虫癌”之称。据统计未经治疗的AE患者10年病死率高达94％。早期感染泡型包虫病患者并没有任何症状，牧区患者往往在晚期才会发现，所以只能进行手术治疗。目前主要使用B超、CT、X射线和磁共振(MRI)等影像学检查以及酶联免疫吸附实验(ELISA)和蛋白质印迹(Western blotting)等免疫学试验进行诊断。影像学检查时，一些非典型和体积较小的病灶常与肝癌和肝脓肿等相混淆，而血清学诊断使用的粗抗原则因缺乏敏感性和特异性，与细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus，Eg)、猪囊尾蚴及其他寄生虫的抗原存在交叉反应。因此研制开发高度敏感、特异的早期诊断泡型包虫病的方法及试剂盒是早期控制和治疗泡型包虫病的一种切实有效的方法，并且在使用方面具有广阔的应用前景。

线粒体DNA是裸露的DNA双链分子，主要呈环状，可参与蛋白质的合成、转录与复制。线粒体DNA所有基因都位于一个单一的环状DNA分子上，遗传物质不为核膜所包被，且不被蛋白质压缩。线粒体DNA主要的特点是不包含很多的非编码区域，并且稳定性比DNA要高很多，所以设计针对多房棘球蚴线粒体DNA的引物，使检测多房棘球蚴的结果更稳定。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种PCR检测多房棘球蚴的方法，通过设计针对棘球蚴线粒体DNA的引物，采用PCR检测技术检测出多房棘球蚴DNA。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种用于检测多房棘球蚴的PCR引物对，所述PCR引物对包括外引物对和/或内引物对，

所述外引物对的序列如下：

上游引物AE-M1F：5’–CATCTGCGGTTAGTCTGT–3’(SEQ ID NO：1)；

下游引物AE-M1R：5’–GGTGGACCATCCTTTACT–3’(SEQ ID NO：2)；

所述内引物对的序列如下：

上游引物AE-M2F：5’–GACAGGGATTAGATACCCCATT–3’(SEQ ID NO：3)；

下游引物AE-M2R：5’–GTGGACCATTCCCTACTATGC–3’(SEQ ID NO：4)。

一种PCR检测多房棘球蚴的试剂盒，该试剂盒含有如权利要求1所述的PCR引物对。

优选地，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液中的一种或多种。

优选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。

一种PCR检测多房棘球蚴的方法，该方法利用上述的PCR引物对，或上述的试剂盒对多房棘球蚴进行PCR检测。

优选地，该方法包括以下步骤：

1)提取样品组织中的总DNA；

2)以步骤1)中的总DNA为模板，AE-M1F和AE-M1R为引物，或以AE-M2F和AE-M2R为引物，进行PCR扩增反应；

3)分析PCR产物。

优选地，对于以AE-M1F和AE-M1R为PCR引物对的PCR反应体系以20μL计为：

2×Taq PCR MasterMix，10μL；10μM引物AE-M1F，0.45μL；10μM引物AE-M1R，0.45μL；DNA模板，2μL；ddH₂O，7.1μL；总反应体系为20μL。

优选地，对于以AE-M1F和AE-M1R为PCR引物对的PCR反应条件为：95℃预变性30s，95℃变性30s，52℃退火15s，72℃延伸30s，共30个循环；最后72℃延伸10min，1个循环；扩增产物大小为250-260bp。

优选地，对于以AE-M2F和AE-M2R为PCR引物对的PCR反应体系以20μL计为：

2×Taq PCR MasterMix，10μL；10μM引物AE-M2F，0.45μL；10μM引物AE-M2R，0.45μL；DNA模板，2μL；ddH₂O，7.1μL；总反应体系为20μL。

优选地，对于以AE-M2F和AE-M2R为PCR引物对的PCR反应条件为：94℃预变性3min；95℃变性30s，63℃退火10s，72℃延伸30s，共10个循环；95℃变性30s，61℃退火10s，72℃延伸30s，共20个循环；最后72℃延伸5min，1个循环；扩增产物大小为130-140bp。

本发明的有益效果如下：

(1)准确度高，本发明根据多房棘球蚴线粒体DNA序列设计引物，并经过对PCR产物进行测序比对，可以准确的检测出多房棘球蚴DNA。

(2)敏感度高，本发明从样品中提取DNA作为模板，并用引物AE-M1F、AE-M1R及AE-M2F、AE-M2R进行PCR高效扩增，可以对样本中微量虫源线粒体DNA进行扩增并达到检出的水平。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为不含有和含有多房棘球蚴样品DNA；

图2为引物AE-M1F和AE-M1R的PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测图；

图3为引物AE-M1F和AE-M1R的扩增产物胶回收后测序结果；

图4为测序结果在NCBI上Blast比对结果；

图5为引物AE-M2F和AE-M2R的PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测图；

图6为多房棘球蚴检测试剂盒的巢式PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明的思路如下：基于多房棘球蚴线粒体DNA的稳定性，设计针对多房棘球蚴线粒体DNA的引物，筛选出可以区分多房棘球蚴DNA的特异性引物，再使用PCR技术进行扩增，对扩增产物进行测序比对，得知该扩增产物是否为多房棘球蚴DNA的扩增产物；使其能够达到准确判断多房棘球蚴DNA的水平。经优化后的引物与扩增条件进行PCR实验证明可以完全识别多房棘球蚴DNA。

材料

1.样本：含有多房棘球蚴的样品及不含有多房棘球蚴的样品；

2.DNA提取：使用QIAamp Circulating Nucleic Acid kit(50次)试剂盒提取；

3.DNA电泳缓冲液(50x TAE)：称取242g Tris、37.2g Na2EDTA·2H₂O和57.1mL冰乙酸，加水至1000mL，使用时稀释50倍；

4.2×Taq PCR MasterMix；

5.PCR仪：Eppendorf AG。

实例1：

DNA的提取

1.5mL离心管中加20μL Protease K，加200μL的样品液，加200μL的Buffer AL，涡旋15s；

56℃温育10min，直到裂解完全，快速离心；

加200μL乙醇(100％)，涡旋15s，快速离心；

转移混合液到Spin column(2mL收集管)，6000g或8000rpm，离1min，换新管，弃掉旧的收集管；

加500μL Buffer AW1，涡旋15s，6000g或8000rpm，离1min，弃旧管换新管；

加500μL Buffer AW2，涡旋15s，全速(20，000g或14，000rpm)离1min换新管，全速(20，000g或14，000rpm)空管离心3min；

新离心管，100μL Buffer AE温室温育5min，6000g或8000rpm，离1min，重复洗脱3次；

图1为含有多房棘球蚴的样品及不含有多房棘球蚴的样品的凝胶电泳图；

图1中，泳道1：DNA Marker D15000；

泳道2：DNA Marker D2000；

泳道3-7：含有多房棘球蚴的样品；

泳道8-12：不含有多房棘球蚴的样品。

实例2：

设计AE-M1F和AE-M1R引物扩增DNA

设计引物AE-M1F和AE-M1R；

AE-M1F：5’–CATCTGCGGTTAGTCTGT–3’(SEQ ID NO：1)；

AE-M1R：5’–GGTGGACCATCCTTTACT–3’(SEQ ID NO：2)；

引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；

利用引物AE-M1F和AE-M1R从DNA扩增基因的反应体系如下：

PCR反应条件为：

95℃预变性30sec，95℃变性30sec，52℃退火15sec，72℃延伸30sec，共30个循环；

最后72℃延伸10min；

扩增产物大小为256bp。

结果：AE-M1F和AE-M1R可以从含有多房棘球蚴的样品中扩增出序列，但是不含有多房棘球蚴的样品DNA中未扩增出来序列，结果如图2所示。

图2中泳道1：DNA Marker；

泳道2：多房棘球蚴原头节；

泳道3-12：含有多房棘球蚴样品；

泳道13-17：不含有多房棘球蚴的样品；

泳道18：阴性对照。

实例3：

扩增序列回收与比对分析

利用DNA片段凝胶回收纯化试剂盒(北京天根生物技术有限公司)回收纯化PCR扩增的基因，然后送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，将测序结果在数据库进行比对。

图3为引物AE-M1F和AE-M1R的扩增产物胶回收后的测序结果。

图4为测序结果在NCBI上Blast比对结果，比对结果显示该扩增片段来自多房棘球蚴线粒体DNA。

实例4

设计AE-M2F和AE-M2R引物扩增DNA

设计引物AE-M2F和AE-M2R；

AE-M2F：5’–GACAGGGATTAGATACCCCATT–3’(SEQ ID NO：3)；

AE-M2R：5’–GTGGACCATTCCCTACTATGC–3’(SEQ ID NO：4)；

引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；

利用引物AE-M2F和AE-M2R从样品中扩增基因的反应体系如下：

PCR反应条件为：

94℃预变性3min；95℃变性30sec，63℃退火10sec，72℃延伸30sec，共10个循环；95℃变性30sec，61℃退火10sec，72℃延伸30sec，共20个循环；

最后72℃延伸5min；

扩增产物大小为136bp。

结果：AE-M2F和AE-M2R可以从含有多房棘球蚴的样品中扩增出序列，但是不含有多房棘球蚴的样品DNA中未扩增出来序列，可以很好的区分含有多房棘球蚴的样品和不含有多房棘球蚴的样品，检出率为100％，如图5所示。

图5为引物AE-M2F和AE-M2R的PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测图；

图5中泳道1：DNA Marker；

泳道2-5：不含多房棘球蚴样本；

泳道6、7：试剂盒阳性质控；

泳道8：空；

泳道9-13：含有多房棘球蚴样本；

泳道14：阴性；泳道15：DNA Marker。

实施例5

多房棘球蚴巢式PCR检测试剂盒的评价

外引物：AE-M1F和AE-M1R；

AE-M1F：5’–CATCTGCGGTTAGTCTGT–3’(SEQ ID NO：1)；

AE-M1R：5’–GGTGGACCATCCTTTACT–3’(SEQ ID NO：2)；

内引物：AE-M2F和AE-M2R；

AE-M2F：5’–GACAGGGATTAGATACCCCATT–3’(SEQ ID NO：3)；

AE-M2R：5’–GTGGACCATTCCCTACTATGC–3’(SEQ ID NO：4)；

引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；

利用引物AE-M1F和AE-M1R从DNA扩增基因的反应体系如下：

PCR反应条件为：

95℃预变性30sec，95℃变性30sec，52℃退火15sec，72℃延伸30sec，共30个循环；

最后72℃延伸10min；收集外引物扩增产物。

以外引物扩增产物为模板，用内引物扩增反应体系如下：

多房棘球蚴检测试剂盒可以从含有多房棘球蚴的样品和阳性质控样本中扩增出序列，但是不含有多房棘球蚴的样品DNA中未扩增出来序列，可以很好的区分含有多房棘球蚴的样品和不含有多房棘球蚴的样品，检出率为100％，如图6所示。

图6为多房棘球蚴检测试剂盒的巢式PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测图；

图6中泳道1：DNA Marker；

泳道2-4：不含有多房棘球蚴的样品；

泳道5-6：试剂盒阳性质控

泳道7-12：含有多房棘球蚴的样品；

泳道13：阴性；

泳道14：DNA Marker。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 青海大学 青海知光精准医学科技有限公司

<120> PCR检测多房棘球蚴的方法及检测试剂盒

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

catctgcggt tagtctgt 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggtggaccat cctttact 18

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gacagggatt agatacccca tt 22

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gtggaccatt ccctactatg c 21