腹泻相关病毒多重基因检测体系及其试剂盒和应用的制作方法

本发明涉及一种多重基因检测产品以及该产品所用到的检测体系，属于生物技术领域。

背景技术：

感染性腹泻是由多种病原体引起的肠道传染病，是全世界范围内最高发的消化系统感染性疾病之一。全球每年患腹泻病达20亿人次左右，我国每年发病约8亿人次。感染性腹泻已经成为仅次于呼吸道感染、影响人类健康的第二大感染性疾病。

病原学诊断对感染性腹泻的防治具有重要意义。《世界胃肠病学组织全球指南—成人和儿童急性腹泻：全球观点(2012)》和《中国成人急性感染性腹泻诊疗专家共识(2013)》明确指出：“感染性腹泻的诊断包括临床诊断和病原学诊断，后者不仅为合理治疗提供依据，同时为流行病学调查以及预防和控制腹泻病的传播和流行提供重要线索”。由于引起腹泻的病原体种类繁多，肠道病毒是感染性腹泻最重要的病原体之一,在儿童感染性腹泻中尤为常见。而常规的检测方法局限性大，难以实现精准的病原学诊断，导致临床治疗盲目、耐药菌产生，使得感染性腹泻未能得到最及时和有效地控制。

但是,感染性腹泻病原体的常规检测方法、检测流程、临床治疗方案都具有局限性。

目前国内外检测腹泻相关病毒的常规方法包括：①免疫学方法：通过直接检测粪便中病原体的特异性抗原或者血液中的特异性抗体进行病原学诊断。该方法耗时短，但敏感性和特异性低，尤其是血液中特异性抗体的产生有一个窗口期(从感染到产生可以检测到的抗体成分)，导致该方法假阴性率高。同时该方法也无法同时检测和鉴别数十种感染性腹泻相关的抗原或抗体。②特异性核苷酸检测法：通过特异性检测感染性腹泻相关病原体的基因片段进行诊断。其优点是特异性和敏感性高，但缺点是无法同时检测和鉴定感染性腹泻相关的多种病原体，而且成本高。

不同的病原体引起的感染性腹泻的治疗和隔离的方法各不相同。细菌导致的感染性腹泻，必须及时应用敏感的抗菌药物；而病毒所致的腹泻往往是自限性感染，不需要应用抗菌药物，但必须维持水和电解质平衡。故治疗药物的应用必须根据患者的症状、体征和实验室检查结果，明确诊断后可应用。但是，目前的常规检测方法存在检出率低、耗时长、尤其无法同时对多种病原体进行准确鉴定等缺点，无法为临床提供及时、全面和准确的病原体诊断依据，导致临床普遍采用经验性治疗，造成疗效低下、不能及时控制腹泻和消化菌群紊乱等问题。

综上所述，目前腹泻病原体检测和诊断方法不能满足临床需求，迫切需要开发新技术。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种可以快速、全面、准确、低成本的腹泻相关病毒多重基因检测体系及其试剂盒，以及采用该检测体系在制备诊断产品方面的应用。

本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种腹泻相关病毒多重基因检测体系，包括分别针对人星状病毒、诺如病毒ii、人肠道腺病毒、轮状病毒a、轮状病毒b和轮状病毒c进行检测的正反向pcr扩增引物。

针对人星状病毒的正向引物的核苷酸序列如seqidno.27所示，对应人星状病毒的反向引物的核苷酸序列如seqidno.28所示；

针对诺如病毒ii的正向引物的核苷酸序列如seqidno.29所示，针对诺如病毒ii的反向引物的核苷酸序列如seqidno.30所示；

针对人肠道腺病毒的正向引物的核苷酸序列如seqidno.31所示，以及针对人肠道腺病毒的反向引物的核苷酸序列如seqidno.32所示；

针对轮状病毒a的正向引物的核苷酸序列如seqidno.33所示，以及针对轮状病毒a的反向引物的核苷酸序列如seqidno.34所示；

针对轮状病毒b的正向引物的核苷酸序列如seqidno.35所示，以及针对轮状病毒b的反向引物的核苷酸序列如seqidno.36所示；

针对轮状病毒c的正向引物的核苷酸序列如seqidno.37所示，以及针对轮状病毒c的反向引物的核苷酸序列如seqidno.38所示。

3.根据权利要求2所述的腹泻病原体多重基因检测体系，其特征在于：还包括针对人rna内参、人dna内参、系统质控内参进行检测的正反向pcr扩增引物；

所述人rna内参是b2m，人dna内参是rnasep，系统质控内参是含有卡那霉素抗性基因的质粒；

针对人rna内参的正向引物的核苷酸序列如seqidno.39所示，以及针对人rna内参的反向引物的核苷酸序列如seqidno.40所示；

针对人dna内参的正向引物的核苷酸序列如seqidno.41所示，以及针对人dna内参的反向引物的核苷酸序列如seqidno.42所示；

针对系统质控内参的正向引物的核苷酸序列如seqidno.43所示，以及针对系统质控内参的反向引物的核苷酸序列如seqidno.44所示。

上述针对轮状病毒b的正向引物在检测体系中的终浓度均为200nm；所述针对诺如病毒ii、轮状病毒c的正向引物在检测体系中的终浓度均为100nm，所述针对人星状病毒的正向引物在检测体系中的终浓度均为300nm，所述针对人肠道腺病毒的正向引物在检测体系中的终浓度均为450nm，所述针对轮状病毒a的正向引物在检测体系中的终浓度均为400nm；

所述针对人肠道腺病毒、轮状病毒b、轮状病毒c的反向引物在检测体系中的终浓度均为100nm，所述针对人星状病毒、诺如病毒ii的反向引物在检测体系中的终浓度均为400nm，所述针对轮状病毒a的反向引物在检测体系中的终浓度均为450nm；

针对人rna内参、人dna内参、和系统质控内参的正反向引物在检测体系中的终浓度均为1μm。

上述腹泻相关病毒多重基因检测体系还包括pcr缓冲液,mgcl2溶液,dntps,以及热启动dna聚合酶和逆转录酶混合液。

上述荧光标记为cy5或cy3或fam。

上述腹泻病原体多重基因检测体系还包括阳性对照液和阴性对照物；所述阳性对照物是包括所有目的基因靶点的质粒混合物；所述阴性对照液是无核酸酶超纯水。

反应时体系中的组分用量为5×的pcr缓冲液2体积，10μm的dntps共0.35体积，25mmol/l的mgcl2溶液0.25体积，引物混合物1体积，5u/μl的热启动dna聚合酶和5u/μl的逆转录酶混合液0.4体积，1u/μl的udg酶0.1体积dna模板2.5体积，纯水2.5体积；所述基因模板的使用量为5～50ng/体系。

本发明为解决上述技术问题提出的另一种技术方案是：一种采用上述的检测体系的腹泻相关病毒多重基因检测试剂盒。

本发明为解决上述技术问题提出的又一种技术方案是：一种采用上述的检测体系制备腹泻相关病毒的检测和诊断产品的应用。本发明具有积极的效果：

(1)本发明的腹泻相关病毒多重基因检测体系及试剂盒，将所有目的基因的质粒等拷贝数混合在一起，通过调整各病原体的引物浓度，使各靶点出现的峰高相当，达到等效扩增所有靶基因的目的。

(2)本发明的腹泻相关病毒多重基因检测体系及试剂盒优化了反应体系，加入了防污染的ung酶，在基因扩增前有效消除基因扩增片段污染，确保结果的准确性和可靠性。同时，加入了反转录酶，实现了反转录和基因扩增一步完成，简化检测流程和缩短检测时间，也有效降低繁琐的操作引起的污染。

(3)本发明的腹泻相关病毒多重基因检测体系及试剂盒结合毛细管电泳及荧光检测技术，不同于传统凝胶电泳分析模式，可将非特异性扩增产物、引物二聚体和特异性扩增产物分离，最大程度降低假阳性。该试剂盒的检测结果无杂峰，特异性高。可检测低至10个拷贝的病原体，灵敏度高。

(4)本发明的腹泻相关病毒多重基因检测体系及试剂盒不需要采用腹泻病原体常规检测等步骤，在同一反应体系直接对组织样本进行多重腹泻相关病毒的同步检测和分析，一次检测得出所有结果，弥补了常规检测方法通量低、步骤多、耗时长和检出率低等缺点，成本低、便捷性好，第一时间为临床提供全面、精准、低成本的病原学诊断。

(5)不同的病原体引起的感染性腹泻的治疗和隔离的方法各不相同。《国家卫计委2015年抗菌药物临床应用指导原则》明确指出：“抗菌药物的应用必须根据患者的症状、体征和实验室检查结果，明确诊断后可应用”。但是，目前的常规检测方法存在检出率低、耗时长、尤其无法同时对多种病原体进行准确鉴定等缺点，导致临床普遍采用光谱性抗菌药物进行经验性治疗，造成疗效低下、不能及时控制腹泻、耐药菌株高发和消化菌群紊乱等问题。本发明采用建立了一种高通量、快速、准确、低成本的腹泻相关病毒快速鉴定系统，可以同步检测6种感染性腹泻相关病毒，有效弥补常规检测方法检出率低、耗时长和不能同时进行多种病原体鉴定等缺点，可在第一时间内明确病原体种类，以便临床采取正确的治疗方案和隔离措施，有效防止感染扩散和减少耐药菌株的产生。

附图说明

图1是本发明实施例1的试剂盒对混合腹泻病原菌阳性对照进行pcr反应后进行毛细管电泳分析后的图谱；

图2是本发明实施例1的试剂盒对腹泻病原菌系列稀释并进行pcr反应后进行毛细管电泳分析后的图谱；

图3是本发明实施例1的试剂盒对样本1进行pcr反应后进行毛细管电泳分析后的图谱；

图4是本发明实施例1的试剂盒对样本2进行pcr反应后进行毛细管电泳分析后的图谱；

图5是本发明实施例1的试剂盒对样本3进行pcr反应后进行毛细管电泳分析后的图谱；

图6是本发明实施例1的试剂盒对样本4进行pcr反应后进行毛细管电泳分析后的图谱。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。下述实施例中，若非特意表明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道获得。文中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如j.萨姆布鲁克等编著的科学出版社2002年出版的《分子克隆实验指南》一书中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。

实施例1

一、试剂盒的组成

本实施例的腹泻病原体多重基因检测试剂盒检测试剂盒包括：引物混合物、pcr缓冲液(5×pcrbuffer)、mgcl2溶液、dntps、热启动dna聚合酶和逆转录酶混合液、udg酶、阳性对照物和阴性对照物。

pcr缓冲液、热启动dna聚合酶和逆转录酶混合液均来自qiagen公司(货号：210212)。

热启动dna聚合酶和逆转录酶混合在一起形成混合液，其中热启动dna聚合酶在反应体系中的浓度是0.1u/μl，逆转录酶在混合液中的浓度是0.1u/μl。

阳性对照液是包括所有目的基因靶点的质粒混合物。

阴性对照液是无核酸酶超纯水。

引物混合物中包括：针对空肠弯曲菌的正向引物的核苷酸序列和反向引物的核苷酸序列；针对志贺氏菌的正向引物的核苷酸序列和反向引物的核苷酸序列；针对艰难梭菌的正向引物的核苷酸序列和反向引物的核苷酸序列；针对肠炎沙门菌的正向引物的核苷酸序列和反向引物的核苷酸序列；针对鼠伤寒沙门菌的正向引物的核苷酸序列和反向引物的核苷酸序列；针对肠产毒性大肠埃希菌的正向引物的核苷酸序列和反向引物的核苷酸序列；针对肠出血性大肠埃希菌的正向引物的核苷酸序列和反向引物的核苷酸序列；针对肠致病性大肠埃希菌的正向引物的核苷酸序列和反向引物的核苷酸序列；针对肠黏附性大肠埃希菌的正向引物的核苷酸序列和反向引物的核苷酸序列；针对弧菌的正向引物的核苷酸序列和反向引物的核苷酸序列；针对肠侵袭性大肠埃希菌的正向引物的核苷酸序列和反向引物的核苷酸序列；针对小肠结肠炎耶尔森菌的正向引物的核苷酸序列和反向引物的核苷酸序列；针对大肠埃希菌o157的正向引物的核苷酸序列和反向引物的核苷酸序列；针对人星状病毒的正向引物的核苷酸序列和反向引物的核苷酸序列；针对诺如病毒ii的正向引物的核苷酸序列和反向引物的核苷酸序列；针对人肠道腺病毒的正向引物的核苷酸序列和反向引物的核苷酸序列；针对轮状病毒a的正向引物的核苷酸序列和反向引物的核苷酸序列；针对轮状病毒b的正向引物的核苷酸序列和反向引物的核苷酸序列；针对轮状病毒c的正向引物的核苷酸序列和反向引物的核苷酸序列；针对人rna内参的正向引物的核苷酸序列和反向引物的核苷酸序列；针对人dna内参的正向引物的核苷酸序列和反向引物的核苷酸序列；针对系统质控内参的正向引物的核苷酸序列和反向引物的核苷酸序列。

人rna内参是b2m，人dna内参是rnasep，系统质控内参是含有卡那霉素抗性基因的质粒。

各引物的特征如表1所示。引物均由上海桑尼生物科技有限公司合成。

表1腹泻病原体引物序列特征表

二、试剂盒的使用方法

本实施例的腹泻病原体检测试剂盒的具体检测步骤如下：

1.样本采集

将腹泻患者的粪便组织标本浸入生理盐水中，采用天跟抽提试剂盒提取样本总基因组，具体的操作参见抽提试剂盒产品说明书。

获得样本核酸基因后，经紫外分光光度计测定浓度和od260/od280的比值控制样本核酸质量。样本核酸的优选浓度为10ng/μl～100ng/μl。od260/od280的比值的优选范围为1.7～1.9。

2.pcr反应

采用本实施例的试剂盒中的试剂分别与基因模板(样本核酸、阳性对照液或阴性对照液)配制pcr反应体系，具体组分如表2所示。

表2pcr反应体系组分表

然后在pcr仪(abiveriti96well)上进行pcr反应程序，最优反应程序如表3所示。

表3pcr反应程序表

3.毛细管电泳片段分析

在96孔样品板的每个孔中加入9μl的甲酰胺(absciex公司，货号：608082)和0.25μl的内标(dnasizestandard500，absciex公司，货号：608098)，再将1μl的pcr产物加入其中。

根据ab3500dx毛细管电泳分析仪的操作手册，将样品板放入机器，运行fragment分离程序。执行默认的分析方法，最后保存数据。

针对各个基因的pcr产物片段大小不同,得到的毛细管电泳峰图，其中横坐标表示片段长度，纵坐标表示荧光强度。

4.结果分析

毛细管电泳分析仪自动进行数据分析。

三、试剂盒的检测结果判定

1.试剂盒有效性判定

同时满足下列条件，才可进行结果判定：

1)阴性对照：只检测到系统质控内参特异峰。

2)阳性对照：在各扩增片段长度处各检测到一个荧光信号，且荧光信号值高于300。

2.样本有效性判定：

2)若检测样本的荧光信号值至少有一个高于32000，则样本加入过量，建议对pcr产物进行适当稀释后再进行毛细管电泳检测。

3)若检测样本的荧光信号值均低于300，则样本加入量较低，可适当增加pcr产物加入量或增加pcr反应循环数；若仍然不符合要求，需重新制备样本。

3.结果判定标准

腹泻病原体感染鉴定

人dna内参、人rna内参、系统质控内参和腹泻病原体基因的目的片段区域出现了相应的峰且荧光信号值均高于300，可以判断感染了腹泻病原体。

4.结果判断实例

采用本实施例的试剂盒对单个阳性对照分别进行pcr反应后采用毛细管电泳分析。基因的目标片段区域空肠弯曲菌、志贺菌、艰难梭菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌、肠产毒性大肠埃希菌、肠出血性大肠埃希菌、肠致病性大肠埃希菌、肠黏附性大肠埃希菌、肠侵袭性大肠埃希菌、大肠埃希菌o157、弧菌、小肠结肠炎耶尔森菌、人星状病毒、诺如病毒ii、人肠道腺病毒、轮状病毒a、轮状病毒b和轮状病毒c的19种病原体均出现了相应的峰。该结果非常直观，基因均扩增良好。说明每对引物能有效扩增对应的目的基因，特异性好。

采用本实施例的试剂盒对所有阳性对照的混合进行pcr反应后采用毛细管电泳分析后图谱如图1所示。基因的目标片段区域空肠弯曲菌、志贺菌、艰难梭菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌、肠产毒性大肠埃希菌、肠出血性大肠埃希菌、肠致病性大肠埃希菌、肠黏附性大肠埃希菌、肠侵袭性大肠埃希菌、大肠埃希菌o157、弧菌、小肠结肠炎耶尔森菌、人星状病毒、诺如病毒ii、人肠道腺病毒、轮状病毒a、轮状病毒b和轮状病毒c19种病原体均出现了相应的峰。该结果非常直观，基因均扩增良好。说明各引物之间没有干扰，能同时有效扩增所有目的基因。

采用本实施例的试剂盒对阴性对照进行pcr反应后采用毛细管电泳分析，没有出现任何目的基因峰，只在小于100nt处有非特异性背景荧光信号。说明该检测体系特异性非常好。

采用本实施例的试剂盒对单个腹泻病原体阳性对照进行系列稀释后，进行pcr反应后采用毛细管电泳分析后的图谱如表4所示，检测最低灵敏度艰难梭菌、肠产毒性大肠埃希菌、肠黏附性大肠埃希菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌、弧菌、小肠结肠炎耶尔森菌和轮状病毒可达到1000个拷贝；空肠弯曲菌、肠出血性大肠埃希菌、肠致病性大肠埃希菌、肠侵袭性大肠埃希菌和人星状病毒可达到100个拷贝；志贺菌、诺如病毒ii型和人肠道腺病毒可达到10个拷贝。说明该检测系统对腹泻病原体单重感染检测的灵敏度很高。

表4腹泻病原体检测灵敏度

采用本实施例的试剂盒对所有的腹泻病原体阳性对照进行混合后并系列稀释后，进行pcr反应后采用毛细管电泳分析后的图谱如图2所示，在1000个拷贝/反应的稀释度时19种目标病原体都可以被检测出，且信号值均高于300，结果清晰易判读。说明该检测体系对腹泻病原体多重感染检测灵敏度也很高。

采用本实施例的试剂盒对样本1进行pcr反应后采用毛细管电泳分析后的图谱如图3所示。人rna内参、人dna内参和系统质控内参同时出现且信号值大于300，艰难梭菌(c.difficile)基因的目标片段区域均出现了相应的峰且信号值大于300。根据结果判定标准，说明该患者感染了艰难梭菌。检测结果非常直观。

采用本实施例的试剂盒对样本2进行pcr反应后采用毛细管电泳分析后的图谱如图4所示。人rna内参、人dna内参和系统质控内参同时出现且信号值大于300，鼠伤寒沙门(s.typhimurium)基因的目标片段区域均出现了相应的峰且信号值大于300。根据结果判定标准，说明该患者感染了鼠伤寒沙门。检测结果非常直观。

采用本实施例的试剂盒对样本3进行pcr反应后采用毛细管电泳分析后的图谱如图5所示。人rna内参、人dna内参和系统质控内参同时出现且信号值大于300，轮状病毒(rov)基因的目标片段区域均出现了相应的峰且信号值大于300。根据结果判定标准，说明该患者感染了轮状病毒。检测结果非常直观。

采用本实施例的试剂盒对样本4进行pcr反应后采用毛细管电泳分析后的图谱如图6所示。人rna内参、人dna内参和系统质控内参同时出现且信号值大于300，艰难梭菌、鼠伤寒沙门菌和人肠道腺病毒(s.typhimurium、c.difficile、hadv)基因的目标片段区域均出现了相应的峰且信号值大于300。根据结果判定标准，说明该患者同时感染了艰难梭菌、鼠伤寒沙门菌和人肠道腺病毒。检测结果非常直观。

实施例2

本实施例的腹泻病原菌多重基因检测试剂盒检测试剂盒其余部分与实施例1相同，不同之处在于:引物混合物中仅包括:分别针对人星状病毒、诺如病毒ii、人肠道腺病毒、轮状病毒a、轮状病毒b和轮状病毒c进行检测的正反向pcr扩增引物,以及针对人rna内参、人dna内参、系统质控内参进行检测的正反向pcr扩增引物。用于同步检测6种感染性腹泻相关病毒。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式一一列举。而这些属于本发明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

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<212>dna

<213>人工合成

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ctctcacatatggagtattagctga25

<210>36

<211>29

<212>dna

<213>人工合成

<400>36

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<210>37

<211>27

<212>dna

<213>人工合成

<400>37

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<210>38

<211>27

<212>dna

<213>人工合成

<400>38

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<210>39

<211>19

<212>dna

<213>人工合成

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<211>19

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<213>人工合成

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<213>人工合成

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<213>人工合成

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<213>人工合成

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<213>人工合成

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