同时表达猪α干扰素和猪γ干扰素的重组腺病毒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种重组病毒，所述重组病毒对口蹄疫病毒显示抑制效果。更具体地， 涉及一种重组腺病毒，所述重组腺病毒通过口蹄疫2Α基因的插入来同时表达猪α干扰素 和γ干扰素，以能够一次性处理猪α干扰素和猪γ干扰素，从而能够增强对口蹄疫病毒 的抑制效果。
【背景技术】
[0002] 口蹄疫（Foot-and-mouth disease ;FMD)为感染于偶蹄动物的病毒水疱性疾病， 其特征在于，复制快，传播快。这种疾病由于经济重要性，由国际兽疫局（OIE)被分类为A 类（ListA)疾病，在国家之间的畜产品的贸易中，为起到非常重要的作用的因素。病原体为 单链的正义RNA病毒，属于病毒科（Piconaviridae) 口蹄疫病毒（Aptho virus)属，分为七 个不同的血清型（A、0、C、Asial、SAT1、SAT2、SAT3)。
[0003] 将口蹄疫发作（outbreak)时作为防御对策而使用的紧急疫苗（E mergency vaccination)接种于猪时，平均过七天后，形成对口蹄疫病毒感染的防御能力（J.S. Salt et al，1998，Vaccine 16:746-754)。然而，猪依靠疫苗形成抗体慢，并且排出的病毒量比牛 明显多。并且，猪被感染后会在24小时内，将病毒从呼吸器官排出，因此，接种疫苗后到产 生防御能力之前，病毒传播的危险性会更高。
[0004] 因此，对其的对策为提出口蹄疫病毒抑制剂。其中，将重组腺病毒用作传递系统的 包含α干扰素的I类型干扰素使用于口蹄疫中而有效防御口蹄疫病毒的研宄结果被报道 之后（Chinsangaram，J.et al.，2001，Journal of Virology 75:5498-5503)，确认过将表 达γ干扰素的重组腺病毒与表达α干扰素的腺病毒混合而使用的情况下，能够得到提高 的抑制效果（Maraes MP et al.，2007，Journal of Virology 81:7124-7135)。α 干扰素 是最广为人知的直接的病毒抑制物质，γ干扰素是在辅助T细胞（T-helper cell)和天然 杀伤细胞（natural killer c ell)中起着诱导分泌细胞因子（cytokine)的作用，从而显 示对病毒的直接或间接的抑制效果。由此，虽然同时使用α干扰素和γ干扰素有利于多 种免疫诱导，但是γ干扰素的抗病毒效果相对于α低，因此单纯地混合使用时，存在抑制 效率降低的问题。
[0005] 一方面，口蹄疫病毒2Α序列是在口蹄疫病毒基因中发生自切割（self cleavage) 的部分，在插入于基因中时，基因转录后引起自切割，使其能够表达两个蛋白质。报道称2A 序列与具有相似作用的内部核糖体进入位点（Internal ribosomal entry site，IRES)序 列相比，不仅基因大小小，而且由于基因被切割，从而形成两个蛋白质的效率高9倍。（SH Ha et al,2010, Plant biotech,8:928-938)〇
【发明内容】
[0006] 要解决的技术问题
[0007] 对此，本发明人希望通过使用对现有动物最适合使用，并且对抑制效果的可能性 大的干扰素，以更低的费用和简便的方法开发出一种在动物中能够更有效地抑制病毒的抑 制剂并提出，如果通过插入口蹄疫2A序列能同时表达猪α干扰素和猪γ干扰素，则具有 能够一次性处理这些干扰素的效果，从而确认了能够更有效地提供抑制口蹄疫病毒的效 果，由此完成了本发明。
[0008] 因此，本发明的目的在于，提供一种能够同时表达猪α干扰素和γ干扰素的重组 病毒。
[0009] 技术方案
[0010] 为了达到上述目的，本发明提供一种重组腺病毒或质粒，所述重组腺病毒或质粒 包含按照猪α干扰素、口蹄疫病毒2Α及猪γ干扰素基因的顺序排列的SEQ ID NO :2的碱 基序列。
[0011] 有益效果
[0012] 本发明的重组腺病毒可以同时表达猪α干扰素和猪γ干扰素，从而能够可以一 次性地处理猪干扰素 α和猪γ干扰素，并且，比起将这些各个干扰素单独使用或混合使 用，能够更经济并且简便地使用，能够提供更高效率更高水准的抑制口蹄疫病毒的效果。
【附图说明】
[0013] 图1示出用于生产能够同时表达猪α干扰素和γ干扰素的重组腺病毒的设计策 略。
[0014] 图2是在重组腺病毒中，通过利用蛋白质印迹法（Western blot)来确认猪α干 扰素及γ干扰素的表达的照片。
[0015] 图3是对重组腺病毒各滴度（勻灭望）口蹄疫病毒的抑制程度进行比较的图表。
[0016] 图4是示出同时表达猪α干扰素和γ干扰素的重组腺病毒与分别单独表达的重 组腺病毒相比，在小鼠中抑制口蹄疫病毒的效果增强的图表。
[0017] 最佳实施方式
[0018] 本发明提供一种重组病毒，所述重组病毒将猪α干扰素和猪γ干扰素的基因插 入到一个基因中，并且将口蹄疫2Α序列插入到上述干扰素基因之间，从而使两种干扰素能 够同时表达。尤其，可以将腺病毒载体用作病毒载体。
[0019] 并且，本发明提供一种蛋白质表达载体，所述蛋白质表达载体将猪α干扰素和猪 γ干扰素的基因插入到一个基因中，并且将口蹄疫2Α序列插入到上述干扰素基因之间，从 而使两种干扰素能够同时表达。尤其，可以将质粒用作蛋白质表达载体。
[0020] 由于本发明的重组病毒或质粒可以同时表达猪α干扰素和猪γ干扰素，因此，与 单独使用或混合使用干扰素相比，可以更经济且简便地使用，并且可以更有效地抑制口蹄 疫病毒。
[0021] 并且，本发明提供一种包含上述重组病毒或质粒的口蹄疫病毒抑制剂。在适用相 同滴度时，本发明的重组病毒与利用分别表达α干扰素和γ干扰素的重组病毒相比，显示 出显著高的抑制口蹄疫病毒的效果，因此，本发明的重组病毒可以用一个病毒显示出两种 效果，并且能够用少的滴度提供相同的效果，从而可以用作效果增加的新的口蹄疫抑制剂。 并且，与利用分别表达α干扰素和γ干扰素的重组病毒相比，使用一半的重组病毒滴度， 从而能够节约两倍的经济费用，并能够获得简便性，同时还可以减少由于接种高滴度的病 毒而有可能出现的副作用。并且，从干扰素的广泛的抗病毒效果来看，预期能够适用于各种 病毒疾病。
【具体实施方式】
[0022] 以下，将通过下述实施例更加具体地说明本发明。这些实施例仅是为了加强对本 发明的理解而提出的，本发明的权利范围并不限定于这些实施例，可以实施本领域通常已 知的变形、取代及插入等，并且这些内容也包含在本发明的范围中。
[0023] [实施例1]重组腺病毒的制作
[0024] 在CMV启动子的后面插入猪α干扰素和猪α干扰素序列，并且在两个基因之间 插入口蹄疫病毒2Α基因，从而使它们同时表达，对此已在图1中示出。
[0025] 对其进行更具体的说明如下：猪α干扰素基因以猪干扰素 α?提取基因库 no. ΝΜ_214393的遗传信息，猪γ干扰素基因提取基因库no. ΑΥ293733的遗传信息，并将SEQ ID NO :1 示出的口蹄疫病毒 2A 序列（CAGCTGTTGAACTTTGACCTGCTCAAGTTGGCAGGAGACGTCGA GCCCAACCCTGGGCCC:SEQ ID N0:1)配置在两个猪干扰素基因之间，从而将SEQ ID N0:2所 示的基因通过（株）柏业（Bioneer)来进行合成。此时，在合成基因序列的5'末端中插入 NheI限制酶部位，在3'末端中插入XbaI限制酶部位，从而使其可以进行克隆，并且去除α 干扰素部分的终止密码子，并且在γ干扰素的3'末端配置终止密码子。并且，为了干扰素 基因部分在猪中的有效的蛋白质表达，对密码子选择（codon usage)进行了评价。
[0026] 〈用于同时表达猪α干扰素和γ干扰素的基因序列（两末端包含Nhel，XbaI限 制酶序列；SEQ ID NO :2)>
[00