猿腺病毒核酸和氨基酸序列，包含其的载体及其用图
【专利说明】猿腺病毒核酸和氨基酸序列，包含其的载体及其用途
[0001] 本申请是申请日为2010年2月2日、中国申请号为201080006197.X、发明名称为 "猿腺病毒核酸和氨基酸序列，包含其的载体及其用途"的发明申请的分案申请。
[0002] 本发明涉及具有改进的血清阳性率的新腺病毒毒株。在一个方面，本发明涉及腺 病毒衣壳蛋白例如六邻体、五邻体和纤维蛋白的分离的多肽及其片段和编码其的多核苷 酸。也提供了包含根据本发明的分离的多核苷酸的载体和包含根据本发明的分离的多核苷 酸或多肽的腺病毒和包含所述载体、腺病毒、多肽和/或多核苷酸的药物组合物。本发明还 涉及分离的多核苷酸、分离的多肽、载体、腺病毒和/或药物组合物用于疾病的治疗或预防 的用途。
【背景技术】
[0003] 腺病毒（Ad)包括在两栖动物、鸟类和哺乳动物中发现的具有无囊膜二十面 体衣壳结构的双链DNA病毒大家族（Straus，Adenovirusinfectionsinhumans;The Adenoviruses, 451-498, 1984;Hierholzer等人，J.Infect.Dis.，158:804-813, 1988 ; Schnurr和Dondero，Intervirology.，36:79-83,1993;Jong等人，J.Clin. Microbiol.，37:3940-3945:1999)。与逆转录病毒相比，腺病毒可以转导若干哺乳动物物种 的许多细胞类型，包括分裂和不分裂细胞，并且不整合至宿主细胞的基因组。
[0004] 一般而言，腺病毒DNA通常非常稳定和保持游离型（例如染色体外的），除非发生 转化或肿瘤发生。此外，腺病毒载体可在良好确定的生产系统中增殖至高产量，所述生产系 统易于临床级组合物的制药规模生产。这些特征和其表征良好的分子遗传学使重组腺病毒 载体成为用作疫苗载体的有力候选者。重组腺病毒载体的产生可依赖于使用能够补充已被 删除或被改造为无功能的腺病毒基因产物功能的包装细胞系。
[0005] 目前，广泛使用2种表征良好的人C亚群腺病毒血清型（即hAd2和hAd5)作为用 于基因治疗的大多数腺病毒载体的病毒骨架来源。还已检验了复制缺陷的人腺病毒载体作 为疫苗载体用于递送来源于多种感染原（infectiuosagent)的多种免疫原。在实验动物 (例如啮齿类、犬类和非人灵长类）中进行的研究表明携带编码免疫原和其他抗原的转基 因的重组复制缺陷的人腺病毒载体引起针对转基因产物的体液和细胞介导的免疫应答。一 般而言，研究者已报导了使用人腺病毒作为疫苗载体在非人实验系统中的成功，其通过使 用利用高剂量的预计可引起免疫应答的重组腺病毒载体的免疫方案，或通过使用利用相继 施用来源于不同血清型但携带相同的转基因产物的腺病毒载体用于加强免疫的免疫方案 (Mastrangeli等人，HumanGeneTherapy, 7:79-87(1996) 〇
[0006] 已开发了基于人5型腺病毒（Ad5)的病毒载体用于不同的基因治疗和疫苗应用。 尽管基于Ad5的载体在动物模型中极其有效，在临床试验中已证明了在人中存在的针对Ad5野生型病毒的先存（pre-existing)免疫力，以降低基因转导的效率。特别是在参与基 于Ad5载体的疫苗临床试验的受试者中证明了免疫效率的明确降低，这些受试者具有超过 200的中和抗体滴度。在Merck进行的HIV疫苗STEP试验（MooreJP等人Science. 2008 May9 ;320 (5877): 753-5)中得到以Ad5为载体的疫苗的最全面表征。所述疫苗研究基于 在具有HIV感染高风险的受试者中共注射3个表达不同HIV抗原的Ad5载体作为概念研究 的证据。令人惊讶地，数据显示在具有抗-Ad5先存免疫力的接种的受试者中HIV感染率提 高而不是具有保护作用。尽管此矛盾的观察的机制尚不清楚，所述结果对基于人源腺病毒 的疫苗在健康受试者中的疫苗应用的安全性和效率提出了另外的问题。综合考虑目前在不 同疫苗和基因治疗临床试验例如使用Ad5载体的试验中得到的全部结果提高了对以在人 中具有极低的或缺乏先存免疫力为特征的腺病毒的需要。
[0007] 发明概述
[0008] 在第一个方面，本发明提供了分离的多核苷酸，其编码腺病毒纤维蛋白或其功能 性衍生物，并且所述多核苷酸选自：
[0009] (a)多核苷酸，其编码具有根据SEQIDN0:14-19、50和53中任意氨基酸序列的多 肽，
[0010] (b)多核苷酸，其编码根据SEQIDN0:14-19、50和53中任意多肽的功能性衍生 物，其中所述功能性衍生物包含一个或多个氨基酸残基的缺失、插入和/或置换，和
[0011] (C)多核苷酸，其编码在全长上与SEQIDN0:14-19、50和53中任意氨基酸序列具 有至少85%相同的氨基酸序列的功能性衍生物。
[0012] 在另一个方面，本发明涉及分离的多核苷酸，其编码腺病毒六邻体蛋白或其功能 性衍生物，并且所述多核苷酸选自：
[0013] (a)多核苷酸，其编码具有根据SEQIDN0:20-25、51和54中任意氨基酸序列的多 肽，
[0014] (b)多核苷酸，其编码根据SEQIDN0:20-25、51和54中任意多肽的功能性衍生 物，其中所述功能性衍生物包含一个或多个氨基酸残基的缺失、插入和/或置换，和
[0015] (c)多核苷酸，其编码具有在全长上与SEQIDN0:20-25、51和54中任意氨基酸序 列至少95 %相同的氨基酸序列的功能性衍生物。
[0016] 也提供了分离的多核苷酸，其编码腺病毒五邻体蛋白或其功能性衍生物，并且所 述多核苷酸选自：
[0017] (a)多核苷酸，其编码具有根据SEQIDN0:26-31、52和55中任意氨基酸序列的多 肽，
[0018] (b)多核苷酸，其编码根据SEQIDN0:26-31、52和55中任意多肽的功能性衍生 物，其中所述功能性衍生物包含一个或多个氨基酸残基的缺失、插入和/或置换，和
[0019] (c)多核苷酸，其编码具有在全长上与SEQIDN0:26-31、52和55中任意氨基酸序 列至少85 %相同的氨基酸序列的功能性衍生物。
[0020] 本发明也涉及包含至少一种如上概述的根据本发明的分离的多核苷酸的多核苷 酸。本发明还提供了由根据本发明的分离的多核苷酸编码的分离的腺病毒衣壳多肽或其功 能性衍生物。
[0021] 在另一个方面，本发明提供了包含根据本发明的分离的多核苷酸的载体。
[0022] 也提供了重组腺病毒，优选不能复制的腺病毒，其包含根据本发明的分离的多核 苷酸和/或至少一种根据本发明的分离的腺病毒衣壳多肽。
[0023] 本发明的另一个方面是包含佐剂和以下（i)至（iv)中至少一种物质的组合物：
[0024] (i) -种或多种根据本发明的分离的腺病毒衣壳多肽；
[0025] (ii)根据本发明的分离的多核苷酸；
[0026] (iii)根据本发明的载体；
[0027] (iv)根据本发明的重组腺病毒；
[0028] 和任选地，药学上可接受的赋形剂。
[0029] 本发明还涉及包含以下至少一种的细胞：
[0030] (i)一种或多种根据本发明的分离的腺病毒衣壳多肽；
[0031] (ii)根据本发明的分离的多核苷酸；
[0032] (iii)根据本发明的载体；
[0033] (iv)根据本发明的重组腺病毒。
[0034] 本发明的另一个方面涉及根据本发明的分离的腺病毒衣壳多肽、根据本发明的分 离的多核苷酸、根据本发明的载体、根据本发明的重组腺病毒和/或根据本发明的组合物 用于疾病的治疗或预防的用途。
[0035] 具体地，本发明涉及以下项：
[0036] 1.-种分离的多核苷酸，其编码腺病毒纤维蛋白或其功能性衍生物，并且所述多 核苷酸选自：
[0037] (a)多核苷酸，其编码具有根据SEQIDN0:14_19、50和53中任意氨基酸序列的多 肽，
[0038] (b)多核苷酸，其编码根据SEQIDN0:14-19、50和53中任意多肽的功能性衍生 物，其中所述功能性衍生物包含一个或多个氨基酸残基的缺失、插入和/或置换，和
[0039] (c)多核苷酸，其编码在全长上与SEQIDN0:14-19、50和53中任意氨基酸序列具 有至少85%相同的氨基酸序列的功能性衍生物。
[0040] 2. -种分离的多核苷酸，其编码腺病毒六邻体蛋白或其功能性衍生物，并且所述 多核苷酸选自：
[0041] (a)多核苷酸，其编码具有根据SEQIDN0:20-25、51和54中任意氨基酸序列的多 肽，
[0042] (b)多核苷酸，其编码根据SEQIDN0:20-25、51和54中任意多肽的功能性衍生 物，其中所述功能性衍生物包含一个或多个氨基酸残基的缺失、插入和/或置换，和
[0043] (c)多核苷酸，其编码具有在全长上与SEQIDN0:20-25、51和54中任意氨基酸序 列至少95 %相同的氨基酸序列的功能性衍生物。
[0044] 3. -种分离的多核苷酸，其编码腺病毒五邻体蛋白或其功能性衍生物，并且所述 多核苷酸选自：
[0045] (a)多核苷酸，其编码具有根据SEQIDN0:26-31、52和55中任意氨基酸序列的多 肽，
[0046] (b)多核苷酸，其编码根据SEQIDN0:26-31、52和55中任意多肽的功能性衍生 物，其中所述功能性衍生物包含一个或多个氨基酸残基的缺失、插入和/或置换，和
[0047] (c)多核苷酸，其编码具有在全长上与SEQIDN0:26-31、52和55中任意氨基酸序 列至少85 %相同的氨基酸序列的功能性衍生物。
[0048] 4. -种多核苷酸，其包含至少一种根据项1、2和3中任一项的分离的多核苷酸。
[0049] 5.根据项1-4中任一项的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含以下至少一 项：
[0050] (a)腺病毒5' -端，优选腺病毒5'反向末端重复，
[0051] (b)腺病毒Ela区或其选自13S、12S和9S区的片段，
[0052] (c)腺病毒Elb区或其选自小T、大T和IX区的片段，
[0053] (d)腺病毒E2b区或其选自小pTP、聚合酶和IVa2区的片段，
[0054] (e)腺病毒L1区或其片段，所述片段编码选自28.lkD蛋白、聚合酶、agnoprotein、 52/55kDa蛋白和Ilia蛋白的腺病毒蛋白质；
[0055] (f)腺病毒L2区或其片段，所述片段编码选自根据项3的五邻体蛋白、VII、V和 Mu蛋白的腺病毒蛋白质，
[0056] (g)腺病毒L3区或其片段，所述片段编码选自VI蛋白、根据项2的六邻体蛋白和 内切蛋白酶的腺病毒蛋白质，
[0057] (h)腺病毒E2a区，
[0058] ⑴腺病毒L4区或其片段，所述片段编码选自100kD蛋白、33kD同源物和蛋白质 VIII的腺病毒蛋白质，
[0059] (j)腺病毒E3 区或其选自E3 0RF1、E3 0RF2、E3 0RF3、E3 0RF4、E3 0RF5、E3 0RF6、 E3 0RF7、E3 0RF8 和E3 0RF9 的片段，
[0060] (k)腺病毒L5区或其片段，所述片段编码根据项1的纤维蛋白，
[0061] (1)腺病毒E4 区或其选自E4 0RF7、E4 0RF6、E4 0RF5、E4 0RF4、E4 0RF3、E4 0RF2 和E4 0RF1的片段，和/或
[0062](m)腺病毒3'-端，优选腺病毒3'反向末端重复。
[0063] 6.根据项4的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸由下述多核苷酸组成或包含下 述多核苷酸：其在全长上与基本上由SEQIDN0:13、62、63或65中的任一个组成的序列或 由SEQIDN0:13、62、63或65中的任一个组成但缺乏SEQIDN0:13、62、63或65的基因组 区域E1A、E1B、E2A、E2B、E3和/或E4的序列至少90%同一。
[0064] 7. -种由根据项1-3中任一项的分离的多核苷酸编码的分离的腺病毒衣壳多肽， 或其功能性衍生物。
[0065]8.-种载体，其包含根据项1-6中任一项的分离的多核苷酸。
[0066] 9.根据项8的载体，其中所述载体不包含选自E1A、E1B、E2A、E2B、E3和E4的基因 组区域中的基因，和/或包含选自E1A、E1B、E2A、E2B、E3和E4的基因组区域的至少一个基 因，其中所述至少一个基因包含使所述至少一个基因无功能的缺失和/或突变。
[0067] 10. -种重组腺病毒，优选不能复制的腺病毒，其包含根据项1-6中任一项的分离 的多核苷酸和/或至少一种根据项7的分离的腺病毒衣壳多肽。
[0068] 11.项10的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒包含用于递送至靶细胞的分子。
[0069] 12.根据项10或11的重组腺病毒，其中所述腺病毒在人受试者中具有低于5%的 血清阳性率和优选在人受试者中无血清阳性率。
[0070] 13.根据项10-12中任一项的重组腺病毒，其中所述腺病毒能够感染哺乳动物细 胞。
[0071] 14.根据项11-13中任一项的重组腺病毒，其中所述用于递送至靶细胞的分子是 编码抗原蛋白或其片段的多核苷酸。
[0072] 15.项10-14中任一项的重组腺病毒，其中所述腺病毒是已被保藏的腺病毒并具 有选自 08110601 (ChAd83)、08110602(ChAd73)、08110603(ChAd55)、08110604(ChAdl47)和 08110605 (ChAdl46)的保藏号。
[0073] 16. -种组合物，其包含佐剂和以下⑴至（iv)中至少一项：
[0074] (i) -种或多种根据项7的分离的腺病毒衣壳多肽，
[0075] (ii)根据项1-6中任一项的分离的多核苷酸，
[0076] (iii)根据项8-9中任一项的载体，
[0077] (iv)根据项10-15中任一项的重组腺病毒，
[0078] 和任选地，药学上可接受的赋形剂。
[0079] 17.根据项16的组合物，其中所述佐剂是受体的激动剂，所述受体选自I型细胞 因子受体、II型细胞因子受体、TNF受体、担当转录因子的维生素D受体、以及Toll样受体 1 (TLR1)、TLR-2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR-6、TLR7 和TLR9。
[0080] 18.根据项17的组合物，其中所述佐剂是Toll样受体4或9激动剂。
[0081] 19. 一种细胞，其包含以下至少一项：
[0082] ⑴一种或多种根据项7的分离的腺病毒衣壳多肽，
[0083] (ii)根据项1-6中任一项的分离的多核苷酸，
[0084] (iii)根据项8-9中任一项的载体，
[0085](iv)根据项10-15中任一项的重组腺病毒。
[0086] 20.根据项18的细胞，其中所述细胞是表达至少一种选自Ela、Elb、E2a、E2b、E4、 Ll、L2、L3、L4和L5的腺病毒基因的宿主细胞。
[0087] 21.根据项7的分离的腺病毒衣壳多肽、根据项1-6中任一项的分离的多核苷酸、 根据项8-9中任一项的载体、根据项10-15中任一项的重组腺病毒和/或根据项18的组合 物用于疾病的治疗或预防的用途。
[0088] 22.根据项21的用途，其中所述治疗或预防是接种。
[0089] 23.根据项21的用途，其中所述治疗是基因治疗。
[0090] 发明详述
[0091] 在以下详细描述本发明以前，应当理解本发明不受限于本文描述的特定方法、方 案和试剂，因为这些可以变化。还应当理解本文使用的术语仅为了描述特定实施方案的目 的，无意限制本发明的范围，本发明仅受限于所附权利要求书。除非另外定义，本文使用的 所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。
[0092]优选地，本文使用的术语如〃Amultilingualglossaryofbiotechnological terms:(IUPACRecommendations) 〃，Leuenberger,H.G.W,Nagel,B.和Klbl，H.编 (1995)，HelveticaChimicaActa,CH-4010Basel,Switzerland)中所描述的以及Axel Kleemann和JurgenEngel的''PharmaceuticalSubstances:Syntheses,Patents,App lications",ThiemeMedicalPublishing, 1999;"MerckIndex:AnEncyclopediaof Chemicals,Drugs,andBiologicals"，SusanBudavari等人编，CRCPress, 1996，和United StatesPharmcopeialConvention,Inc.,RockvilleMd.,2001 出版的UnitedStates Pharmacopeia-25/NationalFormulary-20 中所描述的定义。
[0093] 在本说明书和后面的权利要求书通篇中，除非上下文另有需要，否则词语"包含 (comprise) "和变体例如"包含（comprises) "和"包含（comprising) "应当被理解为指包 含所述的特征、整体（integer)或步骤或多个特征、整体或步骤的组但不排除任意其他特 征、整体或步骤或多个整体或步骤的组。在后面的段落中更详细地定义了本发明的不同方 面。除非明确指出有相反的意思，这样定义的每个方面可与任意其他方面或多个方面组合。 特别地，指示为优选的或有利的任意特征可与指示为优选的或有利的任意其他特征或多个 特征组合。
[0094] 在本说明书正文通篇中引用了一些文件。本文引用的每个文件（包括所有专利、 专利申请、科学出版物、制造商的说明书、指示等），不管在上文或下文中，在此以其整体引 入作为参考。不应将本文的任何内容解释为承认本发明无权先于因先前发明所作的此类公 开。
[0095] 下面提供了在本说明书中经常使用的一些术语的定义。这些术语在其每次使用时 在说明书的其余部分具有分别定义的含义和优选的含义。
[0096] -般而言，腺病毒基因组是被良好地表征的。就具有类似位置的特定开放阅读框 而言，在腺病毒基因组的总体组织中具有一般的保守性，例如每个病毒的E1A、E1B、E2A、 E2B、E3、E4、LI、L2、L3、L4和L5基因的位置。腺病毒基因组的每个末端包含被称为反向末 端重复（ITR)的序列，其对病毒复制是必需的。病毒也包含病毒编码的蛋白酶，其对加工某 些产生感染性病毒粒子所需的结构蛋白是必需的。根据宿主细胞转导后表达的病毒基因的 顺序描述腺病毒基因组的结构。更具体地，根据转录是否在DNA复制开始前或后发生将病 毒基因称为早期（E)或晚期（L)基因。在转导的早期，腺病毒的￡认、￡18、￡24、￡28、￡3和 E4基因被表达以制备适于病毒复制的宿主细胞。在感染的晚期，激活晚期基因L1-L5的表 达，其编码病毒颗粒的结构成分。
[0097] 下表1提供了本文涉及的序列的概述：
[0098]表1
[0099]
[0100]
0
[0101] 如本文使用的，术语"分离的"指基本上不含与其天然有联系的其他分子的分子。 因此分离的分子不含其在自然界的活动物中，即实验设备之外可能相遇或接触的其他分 子。
[0102] 如本文使用的，术语"蛋白质"、"肽"和"多肽"可通篇互换使用。这些术语指天然 存在的肽（例如天然存在的蛋白质）和可能包括天然或非天然存在的氨基酸的合成的肽 二者。肽也可被化学修饰，通过修饰天然或非天然存在的氨基酸的侧链或游离氨基或羧基 端。此化学修饰包括加入其他的化学部分以及在氨基酸侧链中的功能基团的修饰，例如糖 基化。肽是优选具有至少 3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、 80、85、90、95或至少100个氨基酸，最优选至少8个或至少30个氨基酸的聚合物。由于本 文公开的多肽和蛋白质来源于腺病毒，优选地本文使用的分离的多肽或蛋白质的分子量不 超过 200kDa。
[0103] 如本文使用的术语"载体"包括技术人员已知的任意载体，包括质粒载体，黏粒载 体，噬菌体载体例如A噬菌体，病毒载体例如腺病毒（Ad)载体（例如现有技术（例如W0 2005/071093A2)已知的非复制型Ad5、Adll、Ad26、Ad35、Ad49、ChAd3、ChAd4、ChAd5、ChAd7、 ChAd8、ChAd9、ChAdlO、ChAdll、ChAdl6、ChAdl7、ChAdl9、ChAd20、ChAd22、ChAd24、ChAd26、 ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd63 和ChAd82 载体或可复制的Ad4 和Ad7 载 体），腺相关病毒（AAV)载体（例如AAV5型），甲病毒载体（例如委内瑞拉马脑脊髓炎病 毒（VEE)，辛德比斯病毒（SIN)，塞姆利基森林病毒（SFV)和VEE-SIN嵌合体），疱疹病毒载 体，麻疹病毒载体，痘病毒载体（例如牛痘病毒，修饰的牛痘病毒Ankara(MVA)，NYVAC(来源 于牛痘病毒的Copenhagen毒株），和禽痘病毒载体：金丝雀痘（ALVAC)和禽痘病毒（FPV)载 体），和水疱性口炎病毒载体，类病毒颗粒或细菌孢子。载体也包括表达载体，克隆载体和可 用于在宿主细胞中产生重组腺病毒的载体。
[0104] 术语"表达载体"指包含至少一种待表达的核酸序列以及其转录和翻译控制序列 的核酸分子。改变表达盒将导致包含其的载体引导不同序列或序列组合的表达。因为限制 性位点被优选地改造在5'和3'端，可容易地插入、去除表达盒，或将其替换为另一个表达 盒。优选地，表达盒包括用于有效表达给定基因的顺式调控元件，例如启动子、起始位点和 /或多聚腺苷酸化位点，如下进一步描述。
[0105] 术语"抗体"指单克隆和多克隆抗体二者，即任意免疫球蛋白或其能够结合抗原或 半抗原的部分。抗原结合部分可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶或化学切割产生。 在某些实施方案中，抗原结合部分包括Fab、Fab'、F(ab'）2、Fd、Fv、