一种猪瘟病毒基因重组腺病毒载体疫苗病毒含量测定方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于家畜病毒检测技术领域，具体涉及一种新型猪瘟病毒基因重组腺病毒 载体疫苗病毒含量测定方法。
【背景技术】
[0002] 猪瘟（CSF)是由猪瘟病毒（Classicalswinefevervirus，CSFV)引起的一种猪 的高度接触性传染病，死亡率极高，给世界养猪业造成了巨大的经济损失。猪瘟已被世界动 物卫生组织（OIE)列为家畜A类传染病，我国也将其列为一类动物疫病。临床以稽留高烧、 皮肤和黏I旲出现大M出血点为特征。多年的实践经验证明，疫苗接种是预防和控制动物疫 病的主要手段。20世纪60年代，我国研制出经人工诱变获得的猪瘟兔化弱毒株（又称C 株）疫苗在CSFV防控中起到了决定性作用，有效的控制了猪瘟在我国乃至世界范围内大规 模的流行。因此，疫苗的质量至关重要，疫苗效价是评价疫苗质量的关键指标。
[0003] 到目前为止，对于猪瘟活疫苗中病毒含量测定还没有一种稳定性、重复性好的定 量方法，还不能进行病毒含量测定。过去，一直采用兔体定型热反应法来检测疫苗效力。 但是该方法周期长，兔体个体的反应会影响结果的稳定性。近几年，一些学者采用实时荧 光定量PCR方法快速检测猪瘟活疫苗中病毒含量（HoffmannB，etal.Validationofa real-timeRT-PCRassayforsensitiveandspecificdetectionofclassicalswine fever.JVirolMethods，2005,130 (1-2) :36-44;高博，等.快速检测猪瘟兔化弱毒疫苗 株的TaqMan荧光定量RT-PCR方法的建立应用。西南民族大学学报：自然科学版，2009， 35(1) :92-97)和RT-PCR方法（罗廷荣，等.RT-PCR诊断CSFV的应用研宄.中国预防兽 医学报，2003, 25 (3) : 219-222)，这些方法虽然灵敏度很高，但都不能进行完全定量，并且不 能区分活疫苗中有复制能力的活病毒粒子和死亡的病毒粒子，因此，实时荧光定量PCR方 法和RT-PCR方法不能对疫苗中活病毒进行定量。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种用于猪瘟病毒基因重组腺病毒载体疫中病毒含量测定 方法，可以更灵敏、更特异的检测到该疫苗中的活病毒的含量，从而弥补现有技术的不足。
[0005] 本发明首先提供一种用于检测猪瘟病毒的荧光免疫检测试剂盒，包含有如下的组 分：
[0006] 1) -抗：用于检测CSFV的单因子血清抗体；
[0007] 2)二抗：FITC标记的山羊抗兔IgG;
[0008] 3)阳性对照样品：猪瘟兔化弱毒株（C株）；
[0009] 4)固定液：按丙酮与甲醇体积比1 :1配置固定液；
[0010] 5)PBS洗液：Nacl8. 0g/L;Kcl0? 2g/L;Na2HP043. 58g/L;KH2P040 . 24g/L。
[0011] 其中兔抗CSFV蛋白的单因子血清抗体，其制备方法如下：将CSFV基因重组腺病毒 载体疫苗强化免疫SPF兔后，用猪瘟兔化弱毒株进行攻毒，选择攻毒后无反应热的SPF兔采 集血清制备的。
[0012] 上述的试剂盒用于检测猪瘟病毒基因重组腺病毒载体疫苗中的病毒含量；其一种 具体操作步骤如下：通过将猪瘟病毒基因重组腺病毒载体疫苗进行连续10倍梯度稀释，在 培养板每孔逐滴取1〇〇U1稀释的疫苗液接种于在5%C02、37°C孵育2?3小时的HEK293 细胞上，继续培养48小时后，利用构建的检测CSFV的荧光免疫检测试剂盒进行间接免疫荧 光检测，通过计算显微镜下视野中阳性（出现绿色荧光）细胞的平均个数计算疫苗中的病 毒含量。
[0013] 其中计算病毒含量的方法如下：
[0014] 1)计算显微镜下视野中阳性细胞的平均个数。选择一个梯度，此梯度视野中有 5-50个阳性细胞，随机选择至少5个区域计数；
[0015] 2)计算24孔板中每孔视野数；
[0016] 对于多数显微镜，标准10X目镜与10X物镜所观察到的视野直径为1. 8_，因此： 每个视野的面积=3. 14X(D/2)2= 3. 14X0. 9 2= 2. 54mm2;对于一个标准24孔板，培养面 积为 2. 0cm2,因此：每孔视野数=2. 0cm2/2. 54mm2 = 2. 0cm2/2. 54XlCT2cm2= 79 ;
[0017] 3)按疫苗病毒滴度（IFU/ml)=(平均阳性细胞数/每孔视野数）X(稀释比例）/ (0.lml)进行计算疫苗中病毒含量。
[0018] 本发明通过构建CSFV的荧光免疫试剂盒，将猪瘟病毒基因重组腺病毒载体疫苗 接种HEK293细胞，采用间接免疫荧光检测技术（IFA)进行该疫苗病毒含量检测。本发明方 法能够具体检测到猪瘟活病毒粒子感染的单个细胞（出现特异性绿色荧光），通过计算活 病毒粒子感染单个细胞（出现特异性绿色荧光）的数目来评价新型猪瘟病毒基因重组腺病 毒载体疫苗中病毒的含量，具有灵敏度高、特异性强和重复性好的特点。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合实施例对本发明的方法进行详细的描述。
[0020] 实施例1 :用于检测CSFV的荧光免疫试剂盒的构建
[0021] 1. 1针对CSFV单因子血清抗体的制备方法
[0022] 用于检测CSFV的荧光免疫试剂盒主要成分为兔抗CSFV蛋白的单因子血清抗体， 是将云南农大构建、青岛易邦生物工程有限公司技术中心繁殖保存的重组猪瘟病毒基因腺 病毒载体疫苗颈部皮下注射免疫7只3??兔，每只11111(3.95\10 61'(：105(|/只）；14(1后用进 行第二次免疫，lml/只；再经14d后第三次免疫（方法同第二次），其中3只未免疫SPF兔 作为阴性对照组。第三次免疫后l〇d，用猪瘟兔化弱毒耳静脉注射lml进行攻毒，攻毒后72 小时之内未出现稽留热反应（而对照兔出现稽留热反应），将7只免疫兔心脏采血致死，析 出的血清-20°C保存。其制备出的抗体能够与CSFV发生特异性反应。以此单因子血清构 建的CSFV的荧光免疫检测试剂盒，可以检测猪瘟病毒基因重组腺病毒载体疫苗中的抗原， 判定该疫苗的病毒含量，也可以检测临床上CSFV感染猪病料组织中的抗原，判定是否感染 CSFV，其特异性强、灵敏度高、可重复性好且检测速度快，与以往的RT-PCR、实时荧光定量 PCR及动物回归试验检测方法相比，利用该试剂盒通过IFA检测更方便、更准确。
[0023] 1. 2间接免疫荧光（IFA)鉴定单因子血清
[0024] 1. 2. 1选取状态良好的HEK293细胞（商品化专门用来繁殖猪瘟病毒基因重组腺 病毒载体疫苗），使用完全培养基重悬细胞，制备成2. 5X105/ml的细胞悬液，24孔板中接 入lml，37°C5%C02培养2?3小时。
[0025] 1. 2. 2将该疫苗（3. 95X106TCID5Q/ml)按10_2接种比例加入HEK293细胞中， 37°C5%C02 感染 2 天。
[0026] 1. 2. 3轻轻去除培养液，沿24孔板侧壁缓缓加入-