一种特异性抑制平滑肌细胞增殖和迁移的腺病毒载体及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种特异性抑制平滑肌细胞增殖和迁移的腺病毒载体及其应用，该腺病毒载体的多克隆位点处插入有目的基因和miRNA的调控序列。动脉粥样硬化性疾病介入治疗术后，再狭窄的主要原理在于平滑肌细胞迁移至内膜并进行病态性增殖，应用本发明腺病毒本载体可以很好抑制平滑肌细胞增殖和迁移等运动，从而达到防止再狭窄的发生。本发明腺病毒载体基于miRNA调控，可实现特异性抑制血管平滑肌细胞增殖和迁移，而对血管内皮细胞影响甚微，因此，不会影响内皮的修复，从而减少血栓形成的风险，有望减少抗血小板药的使用和出血的发生；可提高介入治疗动脉粥样硬化性疾病的效果。
【专利说明】
一种特异性抑制平滑肌细胞増殖和迁移的腺病毒载体及其 应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种基于miRNA调控的特异性抑制平滑肌细胞增殖和迀移的重组腺病 毒载体及其用途。
【背景技术】
[0002] 下肢动脉硬化闭塞症（lower extremity arteriosclerosis obliterans， LEASO)，是由于下肢动脉粥样硬化，动脉管腔进行性狭窄甚至出现闭塞所导致的慢性下肢 缺血性疾病。LEAS0的发病率较高。大量的流行病学研究结果显示，大约有10-20%的老年人 (大于60岁）罹患LEAS0 m。在国内，一项基于北京社区的横断面研究结果提示，LEAS0在我 国老年人群中的患病率为12.9%m。随着人口的老龄化，LEAS0的发病率还有逐年升高的趋 势。
[0003] LEAS0典型的症状为间歇性跛行，而更加严重的临床表现（critical limb ischemia，严重下肢缺血)包括静息痛和足趾的溃疡坏疽。而一旦进展为严重下肢缺血，预 后极差。在Norg renm等的研究中，单纯保守治疗的严重LEAS0患者，1年死亡或者需要截 肢的比例达到了33%(截肢或死亡人数：总人数=86:266)。Jones 【4】等则对2730742名LEAS0 患者的预后进行了研究，纳入患者的病变程度包含了各个分期，总的截肢率高达5.79%。 LEAS0严重危害着人类的健康。
[0004] 以球囊扩张成形以及支架血管成形术为基础的腔内治疗（endovascular treatment)是近年来发展起来的针对动脉粥样硬化性疾病微创的治疗手段。该技术具有创 伤小、可重复性强、手术并发症少等优点，已成为当今动脉粥样硬化性疾病外科治疗的首 选。
[0005] 然而，目前基于球囊和支架的腔内治疗存在两个问题：①术后再狭窄 (restenosis)，其原因在于球囊扩张或者支架植入后对血管的急性损伤，刺激血管内膜平 滑肌细胞增殖并迀移到内膜，从而导致内膜病态增厚，最终导致术后再狭窄据。据报道，介 入治疗LEAS01年术后再狭窄的发生率为20%~40% [5]。②术后早期及晚期血栓形成:球囊及 支架在扩张血管过程中会损伤内皮。内皮损伤后，首先激活血小板的是与血小板接触的胶 原，继后凝血链锁反应被启动而产生了凝血酶，并且血小板继续地被活化又不断释出二磷 酸腺苷和血栓素 A2，随血流而来的是血小板在局部不断地被激活，最终导致血栓形成[6]。尽 管术后常规使用抗血小板治疗可以减少血栓的风险，但是血栓形成的事件仍有发生。并且， 由于抗血细胞板药物的使用，会增加出血的风险。
[0006] 药物洗脱球囊和支架指的是承载有药物并按照一定速率释放的球囊和支架，即在 其表面覆盖一层抗增殖药物，旨在支撑病变管腔的同时，通过承载的药物在局部发挥抗平 滑肌细胞增殖的作用。药物洗脱球囊和支架的应用，是腔内治疗心血管疾病的一次革新。药 物洗脱球囊和支架能够明显抑制平滑肌细胞的病态增生，提高远期通畅率，成为下肢动脉 腔内治疗中最具有前景的技术然而，药物洗脱球囊和支架在抑制平滑肌细胞增殖的 同时，也抑制了内皮细胞的增殖。另外，鉴于内皮损伤是术后再狭窄发生的始动环节，药物 洗脱球囊或者支架抑制损伤内皮的修复，可能一定程度上影响了其减少术后再狭窄的性 能。值得关注的是，有研究表明，药物洗脱球囊和支架在使用过程中，晚期血栓形成的发生 率升高，主要原因在于:药物洗脱球囊和支架非选择性地抑制了内皮细胞，从而影响了内皮 的修复 121。
[0007] 因此，寻找一种方法，使其特异性的抑制平滑肌细胞的增殖和迀移，而对内皮细胞 的影响甚微。成为未来支架发展的热点和难点。
[0008] 基因治疗是一种较新型的治疗手段，可治疗多种疾病，包括癌症、遗传病、感染性 疾病、心血管疾病和自身免疫性疾病。过去十几年里，全世界的基因治疗取得了巨大的进 步。截止2008年9月，临床试验总数已达1432项。腺病毒是目前基因治疗最常见的载体之一， 全球近1/4的基因治疗临床试验方案采用腺病毒作为载体。
[0009] 微小RNA(microRNA)是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单 链RNA分子，它主要是通过与蛋白编码基因的UTR-3'端的沉默子结合，抑制信使RNA蛋白的 翻译或促进信息RNA的降解，从而在转录后水平上发挥调控基因蛋白表达的作用。
[0010] TPM1基因，即ΤΡΜα基因，在哺乳类及鸟类都有表达。TPM1基因主要编码骨骼肌 α_原肌球蛋白和其他异构体，包括平滑肌α-ΤΜ;既往认为，ΤΡΜ1蛋白仅在肌肉组织的运动 中发挥作用，然而，近年来，越来越多的研究发现，ΤΡΜ作为抑癌基因，在神经胶质瘤、结肠 癌等的生物学行为方面同样发挥着重要的作用。
[0011] 药物洗脱球囊和支架已经成为动脉粥样硬化疾病腔内治疗中最具有前景的技术 之一。然而，药物洗脱球囊和支架在抑制平滑肌细胞增殖的同时，也抑制了内皮细胞的增 殖。其主要问题在于:抑制内皮的修复，增加血栓的风险并减弱自身的抗再狭窄性能。实现 特异性地抑制平滑肌细胞，而对内皮细胞的影响甚微是本发明的目的。
[0012] 参考文献： 1. Lloyd-Jones D， Adams RJ， Brown TM， et al. Heart disease and stroke statistics-2010 update : a report from the American Heart Association. Circulation. Feb 23 2010;121(7):e46-e215. 2. 王洁，李小鹰，何耀等，北京市万寿路地区老年人群周围动脉硬化闭塞病横断面调 查，中华流行病学杂志，2004年3月，第2 5卷第3期:221-4 3. Norgren L， Hiatt WR, Dormandy JA， et al. Inter-Society Consensus for the Management of Peripheral Arterial Disease (TASC II). European journal of vascular and endovascular surgery : the official journal of the European Society for Vascular Surgery. 2007;33 Suppl 1:Sl-75. 4. Jones WS, Patel MR, Dai D，et al. Temporal trends and geographic variation of lower-extremity amputation in patients with peripheral artery disease: results from U.S. Medicare 2000-2008. Journal of the American College of Cardiology. Nov 20 2012;60(21):2230-2236. 5. Curcio A， Torella D， Indolfi C. Mechanisms of smooth muscle cell proliferation and endothelial regeneration after vascular injury and stenting: approach to therapy. Circulation journal : official journal of the Japanese Circulation Society. 2011;75(6):1287-1296. 6·Pereira-da-Si1va T， Bernardes L， Cacela D， et al. Safety and effectiveness of the Genous endothelial progenitor cell-capture stent: follow-up to 5 years. The Journal of invasive cardiology. Dec 2013;25(12): 666-669. 7.Scheinert D， Katsanos K， Zeller T， et al. A prospective randomized multicenter comparison of balloon angioplasty and infrapopliteal stenting with the sirolimus-eluting stent in patients with ischemic peripheral arterial disease: 1-year results from the ACHILLES trial. Journal of the American College of Cardiology. Dec 4 2012;60(22):2290-2295. 8. Rastan A, Brechtel K， Krankenberg H， et al. Sirolimus-eluting stents for treatment of infrapopliteal arteries reduce clinical event rate compared to bare-metal stents: long-term results from a randomized trial. Journal of the American College of Cardiology. Aug 14 2012;60(7):587-591. 9. Dake MD，Ansel GM，Jaff MR, et al. Paditaxel-eluting stents show superiority to balloon angioplasty and bare metal stents in femoropopliteal disease : twelve-month Zi1ver PTX randomized study results . Circulation· Cardiovascular interventions. Oct 1 2011;4(5):495-504. 10. Cassese S，Byrne RA，Ott I，et al. Paclitaxel-coated versus uncoated balloon angioplasty reduces target lesion revascularization in patients with femoropopliteal arterial disease : a meta-analysis of randomized trials . Circulation. Cardiovascular interventions. Aug 1 2012; 5(4): 582-589· 11. Joner M， Finn AV, Farb A， et al. Pathology of drug-eluting stents in humans: delayed healing and late thrombotic risk. Journal of the American College of Cardiology. Jul 4 2006;48(1):193-202. 12. Awata M, Kotani J， Uematsu M， et al. Serial angioscopic evidence of incomplete neointimal coverage after sirolimus-eluting stent implantation: comparison with bare-metal stents. Circulation. Aug 21 2007;116(8):910_916〇
【发明内容】
[0013] 为了寻找一种能够特异性抑制平滑肌细胞增殖和迀移，而对内皮细胞影响甚微的 方法，从而达到治疗血管硬化的理想效果。本发明通过研究构建了一种腺病毒载体，该载体 通过球囊或者支架实现局部转染，最终实现特异性抑制平滑肌细胞而对内皮细胞影响甚微 的目的。
[0014] 本发明的目的在于提供一种特异性抑制平滑肌细胞增殖和迀移的腺病毒载体。
[0015] 本发明的另一目的在于提供上述腺病毒载体的应用 本发明所采取的技术方案是： 一种特异性抑制平滑肌细胞增殖和迀移的腺病毒载体，该腺病毒载体的多克隆位点处 插入有目的基因和miRNA的调控序列； 所述目的基因选自基因77W/、W份?、似设没户划網/?基因中的至少一 种； 所述miRNA的调控序列选自miR-126-3p的反向互补序列、miR-1298的反向互补序列、 miR-140_3p的反向互补序列、miR_125b的反向互补序列、miR-100的反向互补序列、miR-24 的反向互补序列中的至少一种。
[0016] 进一步的，所述腺病毒载体的骨架选自GV135、GV314、pXCl、pAdEasy-l、pADtreak-CMV、AdMax中的至少一种。
[0017] 优选的，所述miRNA的调控序列为至少2个串联的miR-126-3p反向补互序列、或至 少2个串联的miR-1298反向补互序列、或至少2个串联的miR-140-3p反向补互序列、或至少2 个串联的miR-125b反向补互序列、或至少2个串联的miR-100反向补互序列、或至少2个串联 的miR-24反向补互序列。
[0018] 上述任一所述腺病毒载体在制备治疗动脉粥样硬化性疾病药物中的应用。
[0019] 进一步的，所述的动脉粥样硬化性疾病为下肢动脉硬化闭塞症、颈动脉狭窄、冠心 病、脑血管的狭窄、肾动脉及内脏动脉的狭窄。
[0020] 上述任一所述腺病毒载体在制备防治血栓药物中的应用。
[0021] 进一步的，所述血栓为脉粥样硬化性疾病介入治疗后引发的血栓 含有上述任一所述腺病毒载体的腺病毒。 进一步的，所述腺病毒在制备治疗动脉粥样硬化性疾病药物中的应用。
[0022] 进一步的，所述腺病毒在制备防治血栓药物中的应用。
[0023]本发明的有益效果是： 1)动脉粥样硬化性疾病介入治疗术后，再狭窄的主要原理在于平滑肌细胞迀移至内膜 并进行病态性增殖，应用本发明腺病毒本载体可以很好抑制平滑肌细胞增殖和迀移等运 动，从而达到防止再狭窄的发生。
[0024] 2)本发明腺病毒载体可以通过基于球囊或者支架的介入技术，实现重组载体的局 部转染，适用于动脉粥样硬化性疾病;本发明腺病毒载体基于miRNA调控，可实现特异性抑 制血管平滑肌细胞增殖和迀移，而对血管内皮细胞影响甚微，因此，不会影响内皮的修复， 从而减少血栓形成的风险，有望减少抗血小板药的使用和出血的发生。
[0025] 3)本发明通过构建一种腺病毒载体，通过球囊或者支架实现局部转染，最终实现 特异性抑制平滑肌细胞而对内皮细胞影响甚微的目的。使用球囊或者支架转染本发明重组 载体，可以减少介入治疗后，防止术后再狭窄的发生。并且由于其对内皮细胞的影响甚微， 因此，不会影响内皮的修复，从而减少血栓形成的风险，有望减少抗血小板药的使用和出血 的发生。
【附图说明】
[0026] 图1为重组载体ad-TPMl-miR-126-3pTS的示意图，在腺病毒GV135的MCS区插入 TPM1及其3'端的miR-126-3p调控区； 图2为本发明重组腺病毒载体ad-TPMl-miR-126-3pTS对平滑肌细胞和内皮细胞增殖的 检测结果，n=3，*P〈0 · 05，***P〈0 · 001; 图3为本发明重组腺病毒载体ad-TPMl-miR-126-3pTS抑制平滑肌细胞的迀移，n=3，*P〈 0·05，***Ρ〈0·001; 图4为管腔形成检测本发明重组腺病毒载体ad-TPMl-miR-126-3pTS对血管内皮功能的 影响，n=3; 图5为猪髂动脉经不同球囊扩张后动脉再狭窄的情况检测;a.普通球囊介入组28天后 再狭窄情况;b.ad-TPMl-miR-126-3pTS涂覆球囊介入组28天后再狭窄情况。
【具体实施方式】
[0027] -种特异性抑制平滑肌细胞增殖和迀移的腺病毒载体，该腺病毒载体的多克隆位 点处插入有目的基因和miRNA的调控序列； 所述目的基因选自基因77W/、W份?、似设没户划網/?基因中的至少一 种； 所述miRNA的调控序列选自miR-126-3p的反向互补序列、miR-1298的反向互补序列、 miR-140_3p的反向互补序列、miR_125b的反向互补序列、miR-100的反向互补序列、miR-24 的反向互补序列中的至少一种。
[0028] 优选的，所述腺病毒载体的骨架选自GVnSJVSltpXCUpAdEasy-UpADtreak-CMVjdMax 中 的至少一种。
[0029] 优选的，所述miRNA的调控序列为至少2个串联的miR-126-3p反向补互序列、或至 少2个串联的miR-1298反向补互序列、或至少2个串联的miR-140-3p反向补互序列、或至少2 个串联的miR-125b反向补互序列、或至少2个串联的miR-100反向补互序列、或至少2个串联 的miR-24反向补互序列。
[0030] 优选的，所述基因的碱基序列如SEQ ID N0:1所示； 所述基因6^皿/32/3(复制抑制因子)的喊基序列如SEQ ID N0:2所不； 所述基因恐'所久热休克蛋白60)的碱基序列如SEQ ID N0:3所示； 所述基因胡勺碱基序列如SEQ ID N0:4所示； 所述基因 C7?/?的碱基序列为如SEQIDNO:5所示； 所述基因的碱基序列如SEQ ID NO:6所示； miR-126-3p反向补互序列为：5'-CGCATTATTACTCACGGTACGA-3'（SEQIDN0 :7); miR-1298反向补互序列为：5'-TACATCTGGACAGCCGAATGAA-3'（SEQ ID N0:8); miR-140-3p反向补互序列为：5'-CCGTGGTTCTACCCTGTGGTA-3'（SEQIDN0 :9); miR-125b反向补互序列为：5'-TCACAAGTTAGGGTCTCAGGGA-3'（SEQ ID N0:10); miR-100反向补互序列为：5'-CACAAGTTCGGATCTACGGGTT-3'（SEQ ID N0:11); miR-24反向补互序列为：5'-CTGTTCCTGCTGAACTGAGCCA-3'（SEQ ID N0:12)。
[0031] 上述任一所述腺病毒载体在制备治疗动脉粥样硬化性疾病药物中的应用。
[0032] 优选的，所述的动脉粥样硬化性疾病为下肢动脉硬化闭塞症、颈动脉狭窄、冠心 病、脑血管的狭窄、肾动脉及内脏动脉的狭窄。
[0033] 上述任一所述腺病毒载体在制备防治血栓药物中的应用。
[0034] 优选的，所述血栓为脉粥样硬化性疾病介入治疗后引发的血栓 含有上述任一所述腺病毒载体的腺病毒。 优选的，所述腺病毒在制备治疗动脉粥样硬化性疾病药物中的应用。
[0035] 优选的，所述腺病毒在制备防治血栓药物中的应用。
[0036] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0037] 实施例1特异性抑制平滑肌细胞增殖和迀移的腺病毒载体的制备方法 (1)穿梭质粒 pShuttle-TPMl-miR-126-3pTS 的构建 1)TPM1序列的扩增 用引物TPM1-F:5，-agatctGCCACCATGGACGCCATCAAGAAG-3，（SEQ ID NO: 13)和TPM1-R: 5 ' -gtcgacTTACTATGGAAGTCATATCGTTGAGAG-3 '（ SEQ ID NO: 14)从人的cDNA库中克隆TPM1 序 列，引物中的划线部分分别为取邏:、?酶切位点。
[0038] 2)TPMl-miR-126-3pTS 片段的构建 TPMl-miR-126-3pTS片段为在上述TPM1序列的3'端再连上miRNA的调控序列，所述 miRNA的调控序列为4个串联的miR-126-3p的反向互补序列(miR-126-3p的反向互补序列如 SEQ ID 从)：7所示）。
[0039] TPMl-miR-126-3pTS片段的具体操作方法为:先合成含4个串联的miR-126-3p反向 互补序列的序列：5'-tcgacAATCCGCATTATTACTCACGGTACGAAATCCGCATTATTACTCACGGT ACGAAATCCGCATTATTACTCACGGTACGAAATCCGCATTATTACTCACGGTACGAAATC-3'(SEQ ID NO： 15)，该序列两端设有粘性末端，与经I酶切后形成的粘性末端相同，4个miR-126-3p反 向互补序列间通过加入4个碱基连接在一起(连接多个基因序列常用的手段）。然后将步骤 1)中克隆的TPM1序列经酶切后，与合成的SEQ ID N0:15序列进行连接，得到TPMl-miR-126-3pTS片段。
[0040] 3)穿梭质粒 pShuttle-TPMl-miR-126-3pTS 的构建 以上步所得 TPMl-miR-126-3TS片段为模板，用引物TPMl-miR-126-3pTS-F 和 TPMl-miR-126-3pTS-R进行扩增，扩增所得片段与穿梭载体pShuttle-IRES-hrGFP-1分别用你遽?和 处〇 I:进行双酶切，将酶切后的片段进行连接，即得穿梭质粒pShuttle-TPMl-miR-126-3pTS〇
[0041 ]上述引物 TPM1 -miR-126-3pTS-F 和 TPM1 -miR-126-3pTS-R 的序列如下所示： TPMl-miR-126-3pTS-F:5，-agatctGCCACCATGGACGCCATCAAGAAG-3，（SEQ ID NO:16)，其 中划线部分为取想位点； TPMl-miR-126-3pTS-R:5'-ctcgagATTCGTACCGTGAGTAATAATGCG-3 '（SEQ ID NO: 17)，戈ij 线部分为处〇 酶切位点。
[0042] (2)重组腺病毒载体ad-TPMl-miR-126-3pTS的构建及富集 先将腺病毒载体GV135转化入大肠杆菌DH5ci，制备好感受态细菌。然后将经Pme I线性 化后的pShuttle-TPMl-miR-126-3pTS载体转化到感受态细菌中进行同源重组，获得重组腺 病毒载体ad-TPMl-miR-126-3pTS。接种于含有氨苄抗性的琼脂平皿，挑选阳性菌落，用小量 质粒提取试剂盒提取质粒。而后1.2%琼脂糖凝胶电泳，鉴定阳性克隆，并对阳性质粒进行测 序。所构建重组腺病毒载体ad-TPMl-miR-126-3pTS的示意图如图1所示。
[0043] (3)293A细胞内包装及扩增重组腺病毒 1)用Pac I线性化重组腺病毒载体ad- TPMl-miR-126-3pTS质粒，使其暴露两端的重组 序列。六孔板培养的HEK293细胞长至密度约50%~70%，用lipofectamine 2000转染经Pac I线性化的ad-TPMl-miR-126-3pTS质粒。转染约8~10天后，可观察到HEK293细胞呈现包装 成功的表型，即GFP聚集成彗星状，细胞也会出现典型的细胞病理反应（cytopathic effect，CPE)。待细胞出现完全CPE后，收集细胞，液氮/37 °C反复冻融三次，使病毒充分释 放后，4 °C，5000 rpm，离心10 min，收集上清得到首轮腺病毒。
[0044] 2)为提高病毒滴度，将首轮腺病毒作为种子进行腺病毒的扩增。以相同密度在培 养皿（100 mm)中接种293细胞，生长密度约为90%时按1:10加入病毒进行扩增，出现完全CPE 后，再次收集细胞作为感染种子。每个病毒至少扩增50块10cm培养皿。
[0045] 3)氯化铯梯度纯化腺病毒 腺病毒的纯化在超速离心机(Backman，Optima L-100xp)上进行。新鲜配制密度分别为 1.25 g/ml、1.35 g/ml、1.40 g/ml的CsCl溶液（用PBS配制hCsCl梯度离心分2步进行：1)把 2 ml 1.25 g/ml的CsCl放入Backman SW 41Ti转头的配套离心管中，然后在底层加入1 ml 1.4 g/ml的CsCl，最后加入9 ml含有腺病毒的细胞裂解液。36000 rpm，4°C离心60 min，病 毒浓集在两层CsCl之间，呈亮白色带状。2)用5 ml注射器转移病毒带至Backman VTi 90转 头相应的热封管中，用1.35 g/ml的CsCl将热封管注满。热封后，65000 rpm，4°C离心3 h。用 lml注射器侧穿刺收集管中央的病毒带。纯化后的腺病毒经透析去除CsCl，然后进行OD260测 量，并计算其病毒颗粒数(VP)，A 26Q=1.0时对应1.1 X 1012 VP/ml。我们获得的腺病毒滴度一 般>1012VP/ml。
[0046] 实施例2特异性抑制平滑肌细胞增殖和迀移的腺病毒载体的制备方法 本实施例制备腺病毒载体的方法同实施例1，除了其中用到的目的基因为复 制抑制因子，GMNN)，其碱基序列如SEQ ID N0:2所示，用到的miRNA调控序列为4个串联的 miR-1298反向补互序列(miR-1298反向补互序列如SEQ ID N0:8所示），其他操作均同实施 例1，所得腺病毒载体简称为ad-GMNN-miR-1298TS。
[0047] 实施例3特异性抑制平滑肌细胞增殖和迀移的腺病毒载体的制备方法 本实施例制备腺病毒载体的方法同实施例1，除了用到的miRNA调控序列为4个串联的 miR-140_3p反向补互序列(miR-140_3p反向补互序列如SEQ ID N0:9所示），其他操作均同 实施例1，所得腺病毒载体简称为ad- TPMl-miR-140-3pTS。
[0048] 实施例4特异性抑制平滑肌细胞增殖和迀移的腺病毒载体的制备方法 本实施例制备腺病毒载体的方法同实施例1，除了其中用到的目的基因为//57?^(热休 克蛋白60)，其碱基序列如SEQ ID N0:3所示，用到的miRNA调控序列为4个串联的miR-125b 反向补互序列(miR-125b反向补互序列如SEQ ID NO: 10所示），其他操作均同实施例1，所得 腺病毒载体简称为ad-HSP60-miR-125bTS。
[0049] 实施例5特异性抑制平滑肌细胞增殖和迀移的腺病毒载体的制备方法 本实施例制备腺病毒载体的方法同实施例1，除了其中用到的目的基因为似7^4,其碱 基序列如SEQ ID N0:4所示，用到的miRNA调控序列为4个串联的miR-100反向补互序列 (miR-100反向补互序列如SEQ ID ^):11所示），其他操作均同实施例1，所得腺病毒载体简 称为 ad-GATA-6-miR-100TS。
[0050] 实施例6特异性抑制平滑肌细胞增殖和迀移的腺病毒载体的制备方法 本实施例制备腺病毒载体的方法同实施例1，除了其中用到的目的基因为其碱基 序列如SEQ ID勵:5所示，用到的11^1?熟调控序列为4个串联的1^1?-24反向补互序列(1^1?-24 反向补互序列如SEQ ID N0:12所示），其他操作均同实施例1，所得腺病毒载体简称为ad-CRP2-miR-24TS〇
[0051]实施例7本发明腺病毒载体对血管平滑肌细胞和内皮细胞增殖的影响 为了研究本发明构建的腺病毒载体是否对平滑肌细胞具有特异的抑制作用，进行了以 下实验。
[0052]实验方法： 分别设置空白组、模拟阴性对照组(空载体)和实验组(ad-TPMl -miR-126-3pTS)，3组实 验分别经CCK-8实验验证其对于内皮细胞和平滑肌细胞的影响。
[0053] 1)取对数生长期的内皮/平滑肌细胞，消化、离心后以5X103个/孔接种于96孔板 中，设置4个复孔，每孔加培养基至100ul，融合度约60%时转染。将细胞培养板在培养箱中预 培养24h(37°C，5% C02的条件下）。
[0054] 2)用iMAX试剂进行转染(空白组转染水、模拟阴性对照组转染空载体、实验组转染 重组载体ad-TPMl-miR-126-3pTS)，8~12h即可，12h后直接弃去转染液，加新鲜培养基测24h 增殖情况。
[0055] 3)转染成功后换10%FBS EGM-2在培养箱孵育24h后。
[0056] 4)向每孔加入10ul CCK-8溶液(注意在孔中不要生成气泡，他们会影响A值的读 数)。
[0057] 5)将培养板在37°C、5%C02细胞培养箱内孵育4h(需根据自己细胞于1、2、3、4h分别 测1次，选A值在0.5~1.5的结果较好的1次的时间点作为孵育时间点）。
[0058] 6)用酶标仪测定在450nm处各孔的A值。
[0059] 7)如果暂时不测定A值，打算以后测定，可以向每孔中加入10ul Stop Solution， 并遮盖培养板避光保存在0~5 °C条件下，在7天内吸光度不会发生变化。
[0060] 实验结果： 检测结果如图2所示，从中可以看出，与空白组和阴性载体对照组相比，重组腺病毒载 体ad-TPMl-miR-126-3pTS能够特异性抑制平滑肌细胞的增殖，而对内皮细胞的影响并不 大。另外，对实施例2~6制备的重组腺病毒载体也进行上述类似的实验检测，结果发现也具 有同重组腺病毒载体ad-TPMl-miR-126-3pTS类似的效果。
[0061 ]实施例8本发明腺病毒载体对血管平滑肌细胞迀移的影响 为了研究本发明构建的腺病毒载体是否对平滑肌细胞的迀移性能具有抑制作用，进行 了以下实验。
[0062]实验方法： 分别设置空白组、模拟阴性对照组(空载体)和实验组(ad-TPMl -miR-126-3pTS)，3组实 验分别经Transwell实验验证其对于平滑肌细胞迀移能力的影响。
[0063] (l)Transwell 培养 1)选择生长状态良好的HUVECs接种6孔板，融合度约60%时转染，用iMAX试剂进行转染 (空白组转染水、模拟阴性对照组转染空载体、实验组转染重组载体ad-TPMl-miR-126-3pTS)〇
[0064] 2)转染成功后换无血清培养基饥饿培养24h。
[0065] 3)用0~1%FBS DMEM消化重悬，消化制备单细胞悬液，调整密度为5X 105个细胞/ ml 〇
[0066] 4)接种细胞:Transwell小室加入200ul细胞悬液。
[0067] 5)Transwell 培养板（24 孔）下室加入500ul 10%FBS 的 EGM-2。
[0068] 6)培养细胞:37°C、5% C02细胞培养箱培养12h。
[0069] (2)固定染色： 1)洗涤小室:小心取出Transwell小室后PBS洗1次，用湿棉签轻轻擦去聚碳酯膜上表面 的细胞(快速，以防膜干燥），后再用PBS洗1遍，并做好标记。
[0070] 2)固定:用冰预冷的甲醇固定30min IBS洗2遍。
[0071] 3)染色:PBS清洗后结晶紫(0.1%)染色，4°C过夜。自来水冲洗2遍后风干。
[0072] (3)封片、计数： 1)封片：用刀片小心将聚碳酯膜自Transwell小室基底切取下来，置载玻片上，用中性 树脂封片。
[0073] 2)计数:附着于聚碳酯膜下表面的细胞在高倍镜下（X 100)随机取6个视野，取平 均数。
[0074]实验结果： 检测结果如图3所示，从中可以看出，与空白组和阴性对照组相比，ad-TPMl-miR-126-3pTS明显抑制了平滑肌细胞的迀移能力。另外，对实施例2~6制备的重组腺病毒载体也进行 上述类似的实验检测，结果发现也具有同重组腺病毒载体ad-TPMl-miR-126-3pTS类似的效 果。
[0075]实施例9管腔形成实验检测本发明腺病毒载体对血管内皮细胞功能的影响 实验方法： 分别设置模拟阴性对照组（空载体)和实验组(ad-TPMl-miR-126-3pTS)，2组分别经管 腔形成实验验证其对于血管内皮细胞血管新生能力的影响。
[0076] (1)细胞和物品准备： 1)基质胶(Matrigel)在4°C冰箱中置于冰上融化过夜，24孔板、200ul和lml无菌枪头等 所需耗材也应在4 °C冰箱中预冷处理。
[0077] 2)取年轻和衰老HUVECs种于6孔板，2.5 X 105/well，次日换液后进行转染操作，用 iMAX试剂进行转染(模拟阴性对照组转染空载体、实验组转染重组载体ad-TPMl-miR-126-3pTS)〇
[0078] 3)转染12h后换液为无血清DMEM进行去血清化处理。
[0079] (2)Matrigel 铺胶准备： 1)将4°C预冷融化的Matrigel，96孔板和无菌枪头，冰盒等放入超净台中。
[0080] 2)将已融化的matirgel在超净台内冰上96孔板内铺胶，100μΙ/孔。
[00811 3)用200μ1的枪头引导使matirgel均匀分布后在冰面上静置lOmin(尽量把胶铺 平，不留气泡）。
[0082] 4)铺好的胶放入37°C细胞培养箱中凝固备用，一般60min即可。
[0083] (3)细胞种植： 1)取转染24h后的细胞，消化后用2% EGM-2重悬制成单细胞悬液，将细胞密度调整为1 Xl〇MVml〇
[0084] 2)将不同分组细胞加入预先铺好Matrigel的孔内，200ul/孔。
[0085] 3)37 °C细胞培养箱中培养，观察1次/h，一般4~6h成环，本实验取6h结果拍照，测量 管腔总长度和管腔节点数目。管腔总长度等于在高倍镜下（X 100)随机5个视野中，HUVECs 伸出分支样结构总长度的平均值。
[0086] 实验结果： 检测结果如图4所示，从中可以看出发明重组腺病毒载体ad-TPMl-miR-126-3pTS对于 血管内皮细胞的影响并不大，与对照组相比，并无差别。另外，对实施例2~6制备的重组腺病 毒载体也进行上述类似的实验检测，结果发现也具有同重组腺病毒载体ad-TPMl-miR-126-3pTS类似的效果。
[0087] 实施例10管腔形成实验检测本发明腺病毒载体对血管内皮细胞功能的影响 实验方法： 设置普通球囊介入组和ad-TPMl-miR-126-3pTS涂覆球囊介入组，利用球囊过度扩张小 猪髂股动脉制备下肢动脉硬化闭塞症介入治疗术后损伤模型。
[0088] 1)小猪由南方医科大学实验动物中心提供;所有的动物都使用标准的喂养方式及 伺料进彳丁喂养 2)术前3天始饲以口服用氯吡格雷150mg，口服用阿司匹林325mg以及lg先锋霉素 IV。 [0089] 3)使用戊巴比妥钠 10mg/Kg静脉注射进行诱导麻醉，使用氟烷进行维持麻醉。
[0090] 4)切开左侧颈总动脉，置入引导丝和鞘管，利用造影导管选择性地进行血管造影， 明确解剖情况后，交换导丝和就抢，使用普通球囊和ad-TPMl-miR-126-3pTS涂覆球囊扩张 制备介入治疗术后动脉损伤模型。球囊扩张的时间和压力在两组间保持一致。
[0091] 5)术后继续予以250mg的阿司匹林进行抗血小板治疗治疗。
[0092] 6)28天后，处死小猪并获取实验部位的组织； 7)浓度等级升高的乙醇中脱水，在甲基丙烯酸甲酯包埋剂进行包埋，聚合反应完成后， 使用薄片切片机将血管组织切成厚度为5_6μπι的薄片组织。随后进行HE染色。
[0093]实验结果： 检测结果如图5所示，从中可以看出，ad-TPMl-miR-126-3pTS涂覆球囊介入组（图5b)髂 动脉组的再狭窄程度要低于普通球囊组（图5a)，表现出了较为优越的抗再狭窄的性能。说 明本发明ad-TPMl-miR-126-3pTS有利于动脉粥样硬化性疾病的介入治疗，有利于减少动脉 粥样硬化介入治疗后引发的血栓形成的风险。
[0094] 上述结果说明，本发明重组载体ad-TPMl-miR-126-3pTS可以特异性抑制血管平滑 肌细胞的增殖和迀移，而对内皮细胞的增殖和管腔形成功能的影响几乎可以忽略。因此，应 用于人体，可以通过特异性抑制平滑肌细胞的增殖和迀移，从而减少介入术后再狭窄和血 栓形成的风险。
[0095]综上所述，本发明公开的基于miRNA调控的特异性抑制平滑肌细胞增殖和迀移的 重组腺病毒载体可通过球囊和支架等方式，在人体血管腔内局部转染该重组腺病毒载体， 可以实现"特异性抑制血管平滑肌细胞增殖和迀移而使得内皮细胞免受影响"的效果，从而 实现抑制平滑肌细胞增殖的同时，最大程度地保护内皮细胞，不会影响内皮的修复，从而减 少血栓形成的风险，有望减少抗血小板药的使用和出血的发生;可提高介入治疗动脉粥样 硬化性疾病的效果，有利于减少动脉粥样硬化介入治疗后引发的血栓形成的风险;所述的 动脉粥样硬化性疾病包括下肢动脉硬化闭塞症、颈动脉狭窄、冠心病、脑血管的狭窄、肾动 脉及内脏动脉的狭窄。
[0096]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种特异性抑制平滑肌细胞增殖和迀移的腺病毒载体，其特征在于，该腺病毒载体 的多克隆位点处插入有目的基因和miRNA的调控序列； 所述目的基因选自基因77W_/、份?、似没户划網/?基因中的至少一 种； 所述miRNA的调控序列选自miR-126-3p的反向互补序列、miR-1298的反向互补序列、 miR-140_3p的反向互补序列、miR_125b的反向互补序列、miR-100的反向互补序列、miR-24 的反向互补序列中的至少一种。2. 根据权利要求1所述的腺病毒载体，其特征在于，所述腺病毒载体的骨架选自GV135、 GV314、pXCl、pAdEasy_l、pADtreak_CMV、AdMax 中的至少一种。3. 根据权利要求1所述的腺病毒载体，其特征在于，所述miRNA的调控序列为至少2个串 联的miR-126-3p反向补互序列、或至少2个串联的miR-1298反向补互序列、或至少2^串联 的miR-140-3p反向补互序列、或至少2个串联的miR-125b反向补互序列、或至少2个串联的 miR-100反向补互序列、或至少2个串联的miR-24反向补互序列。4. 权利要求1~3任一所述腺病毒载体在制备治疗动脉粥样硬化性疾病药物中的应用。5. 根据权利要求4所述的动脉粥样硬化性疾病为下肢动脉硬化闭塞症、颈动脉狭窄、冠 心病、脑血管的狭窄、肾动脉及内脏动脉的狭窄。6. 权利要求1~3任一所述腺病毒载体在制备防治血栓药物中的应用。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于:所述的血栓为脉粥样硬化性疾病介入治疗 后引发的血检。8. 含有权利要求1~3任一所述腺病毒载体的腺病毒。9. 权利要求8所述腺病毒在制备治疗动脉粥样硬化性疾病药物中的应用。10. 权利要求8所述腺病毒在制备防治血栓药物中的应用。
【文档编号】A61P7/02GK105950660SQ201610498532
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年6月27日
【发明人】姚陈, 王劲松, 常光其, 王深明, 李勇辉
【申请人】姚陈, 王劲松, 常光其, 王深明, 李勇辉