一种可提高酿酒酵母乙醇产率的重组质粒pY16TEF1-△SPT15-125及其应用
【专利摘要】本发明涉及基因工程技术领域，尤其是涉及一种可提高酿酒酵母乙醇产率的重组质粒pY16TEF1?△SPT15?125及其应用。本发明一种重组质粒pY16TEF1?△SPT15?125，所述的重组质粒pY16TEF1?△SPT15?125中的△SPT15?125是SPT15基因经过突变后获得，△SPT15?125碱基序列为SEQ ID No.2，其所翻译的转录因子spt15p的氨基酸序列为SEQ ID No.3；所述的序列SEQ ID No.2中发生突变的碱基分别为39a>g，128 a>g，156a>g、163a>g、247a>g、653a>g；所述的序列SEQ ID No.3中发生突变的氨基酸分别为Glu43Gly，Lys55Glu,Lys83 Glu,Lys218Arg；所述的携带重组质粒pY16TEF1?△SPT15?125的酿酒酵母在提高乙醇产率中的应用。本发明可提高酿酒酵母乙醇产率。
【专利说明】
一种可提高酿酒酵母乙醇产率的重组质粒PY16TEF1-A SPT15-125及其应用 一、
技术领域：
[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，尤其是涉及一种可提高酿酒酵母乙醇产率的重组 质粒 PY16TEF1-ASPT15-125 及其应用。 二、
【背景技术】：
[0002] 葡萄酒的发酵过程不仅与葡萄原料息息相关，和发酵所用的酿酒酵母也有很大关 系。对于含糖量较低的葡萄浆果，发酵时需要通过人工加糖的方式，才能够发酵得到目标酒 度的产品。因此，筛选培育出一种高产乙醇酿酒酵母是降低葡萄酒生产成本，提高葡萄酒企 业经济效益的重要方法。这种高产乙醇酿酒酵母，将具有更高的乙醇产率。
[0003] 具有高乙醇产率的酿酒酵母不仅有益于葡萄酒工业，同时对乙醇生产行业也具有 重要作用。
[0004] 乙醇的生产方法包括化学合成法和微生物发酵法。前者用石油裂解产生的乙烯与 水合成乙醇，随着石油资源的日益枯竭，乙醇的这一合成方法也受到限制。微生物发酵生产 乙醇，利用可再生资源作为发酵底物，具有绿色环保的优点，而生产燃料乙醇最重要的的方 式就是利用酿酒酵母进行生物发酵，相较于其他方法，其优势在于产率高、易培养、乙醇耐 受性强的特点。目前大约有八成及以上的燃料乙醇是利用这种方式生产的。用于生产燃料 乙醇的主要是淀粉质原料，在生物酶制剂作用下，淀粉质原料被分解为酵母菌能够利用的 可发酵糖。在目前的条件下，利用传统工艺进行乙醇发酵，糖浓度约23% (w/v)，最终乙醇浓 度约为11%~12%(v/v)，生产成本较高，并且相当一部分成本被用于能耗。因此，选育高产 乙醇酿酒酵母，提高糖的利用率和转化率，成为了提高燃料乙醇发酵工业效率、降低生产成 本的关键。
[0005] 由于筛选高产酿酒酵母对于新能源和葡萄酒酿造新方式的重要意义，许多科研工 作者先后着眼于这项技术，比较常用的筛选方式有直接从自然界分离、连续培养法、诱变 法、原生质体融合法、热冲击处理法以及基因工程育种等。直接从自然界分离工作量大、筛 选效率低，诱变育种可能对目标形状产生一定程度上的不良影响，原生质体融合及基因工 程育种等在一定程度上解决了这些问题，提高了筛选效率。 三、
【发明内容】
：
[0006] 本发明为了解决上述【背景技术】中的不足之处，提供一种重组质粒PY16TEF1-A SPT15-125及其应用，可以提高酿酒酵母乙醇产率。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种重组质粒PY16TEF1-ASPT15-125,其特征在于：所述的重组质粒pY16TEFl-ASPT15-125中的ASPT15-125是SPT15基因经 过突变后获得，ASPT15-125碱基序列为SEQ ID如.2，其所翻译的转录因子叩丨15?的氨基 酸序列为SEQ ID No.3。
[0008] 所述的序列SEQ ID如.2中发生突变的碱基分别为39&\，128&\，156&\、163 &> g、247a>g、653a>g;
[0009] 所述的序列SEQ ID .3中发生突变的氨基酸分别为611143617，1^8556111， Lys83Glu,Lys218Arg〇
[0010] 所述的携带重组质粒PY16TEF1-ASPT15-125的酿酒酵母在提高乙醇产率中的应 用。
[0011] 与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下：本发明可提高酿酒酵母乙醇产 率。 四、【附图说明】：
[0012]图 1 为SPT15基因 PCR扩增结果电泳图（M:DL2,000DNA Marker，泳道 1:SPT15);
[0013] 图2为SPT15PCR产物与SPT15基因序列比对结果；
[0014] 图 3为质粒pY16TEFl酶切电泳图（M : λ-HindIIIdigest Marker，泳道1 :质粒 PY16TEF1)； 五:【具体实施方式】：
[0015] 下面结合附图和具体实施例来对本发明作更进一步的说明，但并不以此限制本发 明。
[0016] 一种重组质粒 pY16TEFl-ASPT15-125,所述的重组质粒 pY16TEFl-ASPT15-125 中 的ΛSPT15-125是SPT15基因经过突变后获得，ΛSPT15-125碱基序列为SEQIDNo.2，其所 翻译的转录因子sptl5p的氨基酸序列为SEQ ID Νο·3。
[0017] 所述的序列SEQ ID如.2中发生突变的碱基分别为39&\，128&\，156&\、163 &> g、247a>g、653a>g;
[0018] 所述的序列SEQ ID -.3中发生突变的氨基酸分别为611143617，1^8556111， Lys83Glu,Lys218Arg〇
[0019] 所述的携带重组质粒pY16TEFl-ASPT15-125的酿酒酵母在提高乙醇产率中的应 用。
[0020] 本发明的携带有质粒PY16TEF1-ASPT15-125的酿酒酵母工程菌的构建方法，是将 PY16TEF1-ASPT15-125质粒导入酿酒酵母中获得。
[0021 ]将质粒转化酿酒酵母的方法为电击转化法或氯化锂转化法。
[0022] 序列表
[0057]下述实施例中所用的方法如无特殊说明均为本领域内的国际标准方法，参考《分 子克隆实验指南》(第四版)Joe Sambrook书中所述具体方法进行。
[0058] 实施案例1酿酒酵母SPT15基因突变文库构建
[0059] 1)利用DNA提取试剂盒提取酿酒酵母YS59总DNA作为模板，设计上下游引物 CTG459F/R，对SPT15基因进行PCR扩增，引物为：
[0060]上游引物核苷酸序列为：
[0061 ] 5 '-TAGAACTAGTGGATCCATGGCCGATGAGGAACGTTTAAAG-3 '；
[0062]下游引物核苷酸序列为：
[0063] 5 '-GCTTGATATCGAATTCTCACATTTTTCTAAATTCACTTAGCACAG-3 '
[0064] PCR扩增得到与文献报道相同的SPT15基因⑶S区723 bp，反应体系为50yL反应体 系，由下列成分组成：
[0067] PCR反应条件如下：98°C变性10s，55°C退火15s，72°C延伸lmin，共30个循环，再72 。(:延伸10min，12°C 保温。
[0068]取5yL PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示在750bp处有一清晰条带（图 1)〇
[0069]为了验证上述PCR扩增产物是否为SPT15基因，以及在扩增过程中是否发生了突 变，因此对PCR产物进行了测序，结果显示在扩增过程中没有发生碱基突变。
[0070] 2)将扩增得到的SPT15基因与经过BamH I与EcoR I双酶切的PY16TEF1质粒进行连 接，构建重组质粒PY16TEF1-SPT15，质粒pY16TEFl双酶切反应体系如下：
[0072] 在37 °C条件下反应4小时。
[0073]酶切后的质粒PY16TEF1与扩增后的SPT15基因连接的反应体系如下：
[0075] 在50Γ条件下反应15分钟。
[0076] 将连接产物转化大肠杆菌JM109,从而扩增重组质粒pY16TEFl-SPT15。对重组进行 PCR，引物为：
[0077] 上游引物核苷酸序列为:5'-厶了厶666厶(：0^6厶(：1'11^66-3'；
[0078] 下游引物核苷酸序列为:5 ' -GACCTCCCATTGATATTTAAG-3 '
[0079] 反应体系如下：
[0082] PCR反应条件如下：98°C变性10s，55°C退火15s，72°C延伸lmin，共30个循环，再72 。(:延伸10min，12°C 保温。
[0083] 对pY16TEFl-SPT15PCR产物进行测序，测序结果表明，SPT15基因连接正确，质粒构 建成功。
[0084] 3)对pY16TEFl-SPT15中SPT15基因进行易错PCR的反应体系如下：
[0086] 反应条件:94°C预变性30s，94°C变性30s，68°C退火lmin，共25个循环，再68°C延伸 lmin，12°C 保温。
[0087] 取5yL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示。
[0088] 将突变后的ASPT15与质粒pY16TEFl按照2)中的方法进行酶切、连接，得到重组质 粒PY16TEF1-ASPT15。将连接产物转化大肠杆菌JM109,从而扩增重组质粒pY16TEFl-A SPT15。分别取5yL未经过和经过酶切的质粒pYl6TEF1-ΛSPT15进行琼脂糖凝胶电泳（图3)。 由图3电泳结果可以推断，ASPT15成功的连接到了pY16TEFl。
[0089] 将2.5yL突变后的重组质粒pY16TEFl-ASPT15热转化至E.coli JM109中，涂布平 板，37°C过夜培养。挑选20个E.coli JM109阳性菌落，提取质粒并测序。利用Vector NTI软 件对测序所得序列进行比对，序列比对结果表明，SPT15基因已发生随机突变，突变位点个 数在2~10个不等，且突变位点无偏好性。
[0090]因此，可以判断SPT15基因突变文库构建成功。
[0091] 本实施案例中S.cerevisiae YS59为本研究室保藏，E.coli JM109感受态细胞购 于大连宝生物公司，质粒PY16TEF1购于NTCC典型培养物保藏中心-BioVector质粒载体菌株 细胞基因保藏中心。本实施案例中涉及的引物合成与基因测序由上海生工生物技术公司完 成。本实施案例中涉及的DNA提取试剂盒，质粒提取试剂盒，胶回收试剂盒，酵母快速转化试 剂盒购于美国Omega生物技术公司。
[0092] 本实施案例中LB培养基：蛋白胨1%，酵母浸粉0.5%，NaCl 0.5%，琼脂1.5%，氨 苄青霉素〇. 1 %，PH7.4。Yro培养基:酵母浸粉1 %，葡萄糖2 %，蛋白胨2%，pH自然。SD-Ura培 养基：葡萄糖20g/L，YNB6.7g/L，Ura do supplementO.77g/L，pH6.8。
[0093] 实施案例2高产乙醇酿酒酵母工程菌株的筛选
[0094] 1)将SPT15随机突变质粒文库pY16TEFl-ASPT15,转化到酿酒酵母YS59中。将转化 液均匀涂布在SD-Ura固体培养基上，30 °C培养96h左右，获得转化子，将所有转化子用液体 SD-Ura培养基摇瓶培养后，进行菌种保藏，获得S.cerevisia YS59-pY16TEFl-ASPT15突变 文库；
[0095] 2)将获得的S.cerevisia YS59-pY16TEFl-ASPT15突变文库菌株分别活化24h后， 接种于SD-Ura液体培养基中，25 °C条件下静置发酵。发酵结束后利用SBA生物传感分析仪测 量乙醇含量等指标，获得与3.〇打^丨以&6￥559相比，乙醇合成率提高16.6%的菌株 S.cerevisiae pY16TEFl-ASPT15-125;
[0096] 3)利用实施案例 1 (2)中对pY16TEFl-SPT15PCR的方法，对S. cerevisiae pY16TEFl-ASPT15-125进行PCR扩增，并测序，与突变前的SPT15基因碱基序列（SEQ ID No · 1)相比，pY16TEFl-ASPT15-125中 ASPT15有6个碱基突变(SEQ ID No · 2，加粗显示）。 [0097] 本实施案例中的30-1]^液体培养基为：葡萄糖2(^/1^，￥顯6.78/1^，1^&(1 〇 supplement 0.77g，pH6.8〇
[0098] 实施案例3S.cerevisiae pY16TEFl-ASPT15-125在模拟葡萄汁中应用
[0099] 将获得的S.cerevisia pY16TEFl-ASPT15-125菌株活化24h后，按照 1%(V/V)接 种量，接种于800mL模拟葡萄汁中（发酵容器体积为1L)，25°C条件下静置发酵至残糖5 2g/ L。发酵结束后利用SBA生物传感分析仪测量其残糖与乙醇含量等指标，获得与对照菌株 S. cerevisiae YS59相比，乙醇合成率提高16%，见表1。
[0100] 本实施案例中的模拟葡萄汁为：ergo stock:12.5mL Tween80,37.5mL 95%乙醇， 0.125g麦角固醇;溶液A:375mL去离子水中加100g葡萄糖，100g果糖，4mL ergo stock，溶解 后去离子水补充到500mL;溶液B:250mL去离子水中加6g L( + )酒石酸，3g L(-)苹果酸，0.5g 梓檬酸；溶液C:250mL去离子水中1.7g YNB(无氨基酵母氮源），2g水解酪蛋白，6mg肌醇， 〇. 2g无水氯化钙，0.8g L-精氨酸，lg L-脯氨酸，0. lg色氨酸，lg磷酸铵;混合液:A、B、C混合 后，用氢氧化钾调pH至3.25，过滤除菌，现配现用。
[0101] 表1高产乙醇酿酒酵母菌株的模拟葡萄汁的发酵特性
[0102]
【主权项】
1. 一种重组质粒PY16TEF1-ASPT15-125,其特征在于：所述的重组质粒PY16TEF1-A SPT15-125中的ASPT15-125是SPT15基因经过突变后获得，ASPT15-125碱基序列为SEQ ID No.2,其所翻译的转录因子sptl5p的氨基酸序列为SEQ ID No.3。2. 根据权利要求1所述的一种重组质粒PY16TEF1-ASPT15-125,其特征在于:所述的序 列SEQ ID 吣.2中发生突变的碱基分别为393>8，1283>8，1563>8、1633>8、247&>8、653&> 8; 所述的序列SEQIDN0.3中发生突变的氨基酸分别为Glu43Gly，LyS55Glu，Ly S83Glu， Lys218Arg〇3. 如权利要求1所述的携带重组质粒PY16TEF1-ASPT15-125的酿酒酵母在提高乙醇产 率中的应用。
【文档编号】C12N1/19GK105950649SQ201610351632
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月25日
【发明人】秦义, 杜青, 宋育阳, 刘延琳
【申请人】西北农林科技大学