以海洋细菌为来源获取的κ-卡拉胶酶基因及重组酶制备方法
【专利摘要】本发明涉及分子生物学和基因工程领域，具体来讲涉及一种以海洋细菌为来源编码获取Κ?卡拉胶酶基因的及重组酶制备方法。本发明包括如下步骤：一、PCR法获得海洋细菌中κ?卡拉胶酶基因的全长序列；二、以海洋细菌为来源基因κ?卡拉胶酶基因的重组表达质粒和重组菌株的构建；三、利用重组表达菌株表达重组κ?卡拉胶酶；四、重组酶的活性检测。本发明通过一种新的、高效、准确的途径，以海洋细菌为来源获得的κ?卡拉胶酶基因应用于大肠杆菌工程菌株的构建，并实现具有活性重组酶的异源表达，为实现工业化生产卡拉胶酶提供基础；通过本发明中的以海洋细菌为来源获得的κ?卡拉胶酶基因，与已知κ?卡拉胶酶序列相似性最高为44％。
【专利说明】
以海洋细菌为来源获取的K-卡拉胶酶基因及重组酶制备方法
技术领域：
[0001] 本发明涉及分子生物学和基因工程领域，具体来讲涉及一种以海洋细菌为来源编 码获取Κ -卡拉胶酶基因的及重组酶制备方法。
【背景技术】：
[0002] 卡拉胶酶(Carrageenase)是一种海藻多糖水解酶，可降解卡拉胶的β-l，4糖苷键， 生成系列偶数的卡拉胶寡糖。根据识别底物特异性，可将卡拉胶降解酶分为以下三种卡 拉胶酶(EC 3.2.1.83)、I-卡拉胶酶(EC 3.2.1.157)和λ-卡拉胶酶(EC 3.2.1.162)4-卡拉 胶酶(κ-Carrageenase)属于糖苷水解酶GH16家族，该家族成员还包括昆布多糖酶、β-琼胶 酶、内切β-l，3-1，4-葡聚糖酶、内切β-牛乳糖苷酶和木葡聚糖转移酶等，它们有共同的保守 核心催化区域E[ILV]D[IVAF][VILMF(0，1)]E序列。I-卡拉胶酶（i-Carrageenase)属于糖苷 水解酶GH 82家族。具有DFGX3DGX6AX3A的糖苷酶保守区域。λ-卡拉胶酶(λ-Carrageenase) 既不属于κ-卡拉胶酶的GH16,也不属于^-卡拉胶酶的GH82,是一类新型的糖苷水解酶家族。
[0003] 卡拉胶酶主要来源海洋微生物，也有部分来源海洋软体动物。已在假单胞菌属 (Pseudomonas)、别单胞菌属（Alteromonas)、·纤维菌属（Cellulophaga)、弧菌属 (Vibrio)、黄杆菌属（Flavobacteriales)、浮霉菌属（Planctomycetales)、毛螺旋菌科 (Lachnospiraceae)、紫红球菌目（Puniceicoccales)等微生物中发现了不同类型卡拉胶 酶。卡拉胶酶在这些微生物体内的存在方式具有多样性。例如λ-卡拉胶酶仅存在某些特定 的微生物，有些微生物体内同时具有多种类型的卡拉胶降解酶，例如Pseudoalteromonas carrageenovora能同时分泌和 i -卡拉胶酉每，而Alteromonas carrageenovora和 Zobel 1 ia galactanovorans能同时分泌κ-和i -卡拉胶降解酶。
[0004] 目前关于卡拉胶酶的研究主要包括生化方面和分子生物学方面。前者主要集中在 卡拉胶酶高产菌株的选育、发酵剂产酶条件的优化、酶学性质研究、降解机制及产物鉴定； 后者主要集中编码卡拉胶酶基因的克隆、序列分析、重组表达、酶的纯化及酶学性质研究 等。虽然大量卡拉胶酶高产菌株被发现，并对其产酶发酵条件和酶学特性进行了大量研究， 但目前卡拉胶酶无法满足规模化酶解法制备卡拉胶寡糖的需求。酶解法制备卡拉胶寡糖研 究领域中存在:产酶量和酶活力普遍较低，无法达到规模化生产的要求;野生菌株培养体系 复杂，海洋来源需要大量的NaCl，为后续卡拉胶寡糖的纯化增加产本产酶条件不稳定;容易 出现菌种退化，无法连续生产等问题。采用分子生物学技术从编码卡拉胶酶的功能基因入 手，通过基因克隆、序列分析、重组表达、表达特性及构效关系方面的研究是解决上述困难 的有效方法之一，而获得优良的编码卡拉胶酶的基因是进行上述工作的基础。
[0005] 现有的分子生物学技术多数还是采用文库构建等传统方法获取卡拉胶酶基因，但 文库构建工作费时费力，需要通过大量筛选获得阳性克隆，进而通过亚克隆等环节才能获 得完整基因。伴随着高通量测序技术的发展，海量基因组被解析并释放基因组数据，如何借 助这些基因组数据服务于卡拉胶酶基因的挖掘是亟待解决的问题。如果有一种方法能在比 较基因组学分析的基础上，借助于传统同源克隆的原理而从基因组中通过一次PCR方法获 得完整目的基因，则可以免除上述文库构建的繁琐工作，从而实现目的基因的高效获得。
【发明内容】
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[0006] 本发明的目的⑴是提供一种从产卡拉胶酶的菌株中通过一次PCR方法直接获得完 整目的基因的方法，建立了一种新的、高效、准确的途径，并将获得的κ-卡拉胶酶基因应用 于大肠杆菌工程菌株的构建，并实现具有活性重组酶的异源表达，为实现工业化生产卡拉 月父酶提供基础。
[0007] 本发明的目的⑵是利用该方法克隆获得一个全新海洋细菌来源κ-卡拉胶酶基因。
[0008] 本发明的目的⑶是利用限制性内切酶，将克隆获得的卡拉胶酶基因连接到原核表 达载体pET-28a(+)中，构建卡拉胶酶基因的表达载体pET-28a(+)-Cly-K- car，通过转化技 术将表达载体转入到大肠杆菌(BL21)，构建工程菌株，最终获得能产活性重组卡拉胶酶的 BL21_Cly_K-CAR 工程菌株。
[0009] 本发明的技术方案包括如下步骤：
[0010] 一、PCR法获得海洋细菌C.lytica M9中K-卡拉胶酶基因的全长序列
[0011] ⑴根据海洋细菌C.lytica M9(菌种保藏号:CGMCC N〇:10829)中16s RNA序列构建 系统进化树，找到与目的菌株最相近且具有全基因组数据的参考菌株（Cellulophaga lytica DSM 7489,基因组数据信息NC_015167);
[0012] ⑵根据基因组注释信息和NCBI中blast程序验证之后，找到参考菌株(C.lytica DSM7489)基因组中编码κ-卡拉胶酶的基因 Celly_2915编号（gi | 325284916 :3333332-3334777蛋白序列ADY30732)，同时确定该参考菌株中编码κ-卡拉胶酶的相邻上游基因 Celly_2914编号（gi |325284916:3332347-3333021 蛋白序列ADY30731)和下游基因 Celly_ 2916编号（gi |325284916:3335359-3336312蛋白序列ADY30733)及分别对应的核苷酸和氨 基酸序列；
[0013] ⑶根据相邻上下游基因（Celly_2914和Celly_2916)的氨基酸序列通过BlocKMaK er在线软件程序进行比对和寻找保守核心区域，其中，Celly_2914的核心保守序列为： QGSINPM和Ce 1 ly_2916的核心保守序列为：SGLGEPNE;
[0014] ⑷根据Celly_2914基因的核心保守序列采用C0DEH0P软件设计正向引物，
[0015]正向引物为：TCTTGCTTCGCTACCAGCTC;
[0016]根据根据Celly_2916基因的核心保守序列采用C0DEH0P软件设计反向引物，
[0017]反向引物为:TTTGGCTCTCCCAAACCAGA;
[0018] (5)以目的菌株C.lytica M9基因组为模板，利用步骤⑷中所述的引物经一步PCR方 法获得一种全新的海洋细菌为来源，含有编码完整κ-卡拉胶酶基因的原始编码序列，其核 苷酸序列为Seq ID. NO. 1，该基因 DNA序列全长1488bp，编码495个氨基酸，含有45个氨基酸 的信号肽序列。κ-卡拉胶酶的氨基酸序列为Seq ID.N0.2，该酶属于糖苷水解酶GH16家族。
[0019] 二、海洋细菌C.lytica M9来源基因 K-卡拉胶酶基因的重组表达质粒和重组菌株 的构建
[0020] 将上一步骤获得的卡拉胶酶基因克隆到原核表达载体pET-28a( + )中，构建重组 表达质粒。首先基于获得的κ-卡拉胶酶基因的全长序列（采用软件预测0RF中的信号肽区 域），设计获取目的基因成熟肽部分的上下游引物：
[0021 ]上游引物 Cly-K-Car-F: CCCGAATTCCAAACATCTAATCCGAATGATAATT [0022]下游引物Cly-K-Car-R:GGCTCGAGCTATTGAATAAGCAGTTGTTTTG ；
[0023]米用含有原始编码序列的质粒pMD_18T_原始编码序列模板，通过PCR方法获得目 的基因成熟肽部分序列。采用限制性内切酶EcoR I和Xho I双酶切PCR产物，胶回收酶切之 后的片段，跟同样经过EcoR I和Xho I双酶切的质粒pET-28a(+)链接，按照CaCl2转化法转 化到大肠杆菌T0P10中，卡那霉素抗性筛选阳性克隆。采用质粒抽提试剂盒提取阳性克隆质 粒，通过测序和EcoR I和Xho I双酶切鉴定，获得目的基因的（Cly-K-car)重组表达质粒 pET-28a( + )-Cly-K-car，将该质粒进一步转化到大肠杆菌BL21中，构建重组表达工程菌株 BL21-Cly-K-CAR〇
[0024] 三、利用重组表达菌株BL21 -Cly-K-CAR表达重组κ-卡拉胶酶
[0025] 将活化好的lml重组表达菌株BL21-Cly-K-CAR转接到100ml含有20pg/ml卡那霉素 的LB液体培养基中，LB液体培养基为1000ml去离子水中胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、 NaCl 10g，用5mo 1/LNaOH调pH至7.0。37 °C 振荡培养(培养条件37 °C，转速 150r/min)至OD6〇〇达 到0.6-0.8，将培养液温度降至18°C度左右，此时加入终浓度为0.1 mM的IPTG进行诱导表 达，诱导条件为18°C，转速100r/min，培养24h，离心收集菌体，将50ml菌体重悬于20ml海洋 细菌C.lytica M9发酵培养基中（C.lytica M9发酵培养基:每100ml陈海水中卡拉胶0.1%、 蛋白胨0.5%、FeS〇4.7H20 0.002% )，在冰上进行超声波破碎处理，低温离心收集上清，上清 液即为粗酶液，SDS-PAGE检测上清中目的基因的表达量。
[0026] 四、重组Cly-K-CAR酶的活性检测。
[0027]本发明的有益效果为，本发明通过一种新的、高效、准确的途径，以海洋细菌为来 源获得的κ-卡拉胶酶基因应用于大肠杆菌工程菌株的构建，并实现具有活性重组酶的异源 表达，为实现工业化生产卡拉胶酶提供基础;通过本发明中的以海洋细菌为来源获得的κ-卡拉胶酶基因，与已知κ-卡拉胶酶序列相似性最高为44%(NCBI:WP_013991622，Zobellia galactanivorans)，经重组表达之后，最高酶活可达到100-120U/ml。
【附图说明】：
[0028]图1为重组κ-卡拉胶酶的SDS-PAGE电泳图，其中：C代表对照，1、2、3分别代表诱导 6h、8h、24h，Μ代表蛋白分子量；
[0029] 图2为重组κ-卡拉胶酶的酶谱图，其中：4代表降解条带，Μ代表蛋白分子量。
【具体实施方式】：
[0030] 现结合说明书附图和【具体实施方式】进一步说明本发明。
[0031] 实施例1:一步PCR法获得海洋细菌C.lytica Μ9中Κ-卡拉胶酶基因的全长序列 [0032]⑴根据海洋细菌C. lytica M9中16s RNA序列构建系统进化树，找到与目的菌株最 相近且具有全基因组数据的参考菌株(Cellulophaga lytica DSM 7489,基因组数据信息 NC_015167)，其核苷酸序列与Seq ID.N0:1所示序列一致；
[0033] ⑵根据基因组注释信息找到参考菌株(C.lytica DSM 7489)基因组中编码κ-卡拉 胶酶的基因 Celly_2915编号（gi |325284916:3333332-3334777蛋白序列ADY30732)，同时确 定该参考菌株中编码κ-卡拉胶酶的相邻上游基因 Cel ly_2914编号（gi |325284916: 3332347-3333021蛋白序列ADY30731)和下游基因 Cel ly_2916编号（gi I 325284916: 3335359-3336312蛋白序列ADY30733)及分别对应的核苷酸和氨基酸序列；
[0034] ⑶根据相邻上下游基因（Celly_2914和Celly_2916)的氨基酸序列通过BlocKMaK er在线软件程序进行比对和寻找保守核心区域(Celly_2914的核心保守序列：QGSINPM和 Celly_2916的核心保守序列：SGLGEPNE);
[0035] ⑷根据Celly_2914基因的核心保守序列QGSINPM，采用C0DH10P软件设计正向引物 (正向引物:TCTTGCTTCGCTACCAGCTC)，根据根据Ce 1 ly_2916基因的核心保守序列SGLGEPNE， 采用C0DEH0P软件设计反向引物(反向引物:TTTGGCTCTCCCAAACCAGA);
[0036] (5)以目的菌株C.lytica M9基因组为模板，利用本发明所述的方法包括如下步骤 ⑷中所述的简并引物经一步PCR方法获得卡拉胶酶基因的全长DNA序列。PCR采用Ta K aRa公 司的LATaqK 试剂盒，体系（总体积25yL)具体如下：10 X LA Buffer II (Mg2+free)，2 · 5yL; MgCl2(25mM)，2 · 5yL; dNTP Mixture(各2 · 5mM)，4yL;正向引物（10μΜ)，lyL;反向引物（10μ |〇，141^基因组模板（50即/^1^)，14^1^^^9(51]/^〇,0.241^(1诎20，12.84匕反应条件如下 ： 预变性 94°C5min;变性 94°C30s;退火 58°C30s;35 个循环;延伸 72°C3min(lKb/min);延伸 72 °C10min;保温4°C。扩增结束后，1.2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，上样量为3yL。随后对目的 片段进行胶回收，连接到克隆载体PMD-18T上，连接产物转化大肠杆菌ToplO感受态细胞， PCR进行阳性克隆筛选后测序，得到含有pMD-lST-原始编码序列的菌株。本发明得到海洋细 菌C.lytica M9来源长度为2530bp的原始编码序列，其中包括一个完整的编码κ-卡拉胶酶 基因的〇RF(881-2368)。该基因 DNA序列全长1488bp，编码495个氨基酸。该酶属于糖苷水解 酶GH16家族。与已知κ-卡拉胶酶序列相似性最高为44%(NCBI:WP_013991622，Zobellia galactanivorans)，结果显示得到一种全新的海洋细菌来源κ-卡拉胶酶基因。
[0037] 实施例2:海洋细菌C.lytica M9来源基因 κ-卡拉胶酶基因的重组表达质粒和重组 菌株的构建
[0038]将本发明获得的κ-卡拉胶酶基因克隆到原核表达载体PET_28a( + )中，构建重组表 达质粒。首先基于获得的κ-卡拉胶酶基因的全长序列(采用软件预测0RF中的信号肽区域）， 设计获取目的基因成熟肽部分的上下游引物（上游引物C 1 y - κ - C a r - F : CCCGAATTCCAAACATCTAATCCGAATGATAATT 和下游弓| 物 Cly-K-Car-R: GGCTCGAGCTATTGAATAAGCAGTTGTTTTG)。采用含有原始编码序列的质粒pMD-18T-原始编码序 列模板，通过PCR方法获得目的基因成熟肽部分序列。采用限制性内切酶EcoR I和Xho I双 酶切PCR产物，胶回收酶切之后的片段，跟同样经过EcoR I和Xho I双酶切的质粒pET-28a (+ )链接，按照CaCl2转化法转化到大肠杆菌T0P10中，卡那霉素抗性筛选阳性克隆。采用质 粒抽提试剂盒(宝生物)提取阳性克隆质粒，通过测序和EcoR I和Xho I双酶切鉴定，获得目 的基因的重组表达质粒pET-28a( + )-Cly-K-car。将该质粒进一步转化到大肠杆菌BL21中， 构建重组表达工程菌株BL21-Cly-K-CAR。
[0039] 实施例3:利用重组表达菌株BL21-Cly_K-CAR表达重组κ-卡拉胶酶
[0040] 将活化好的lml重组表达菌株BL21-Cly-K-CAR转接到100ml含有20pg/ml卡那霉素 的1^液体培养基中，37°(：振荡培养(培养条件37°(：，转速15(^/1^11)至006()()达到0.6-0.8，将 培养液温度降至18°C度左右，此时加入终浓度为0.1 mM的IPTG进行诱导表达，诱导条件为 18°C，转速100r/min，培养24h。离心收集菌体，将50ml菌体重悬于20ml海洋细菌C. lytica M9发酵培养基中（每100ml陈海水中卡拉胶0.1 %、蛋白胨0.5 %、FeS〇4.7H200.002 % )，在冰 上进行超声波破碎处理，低温离心收集上清，上清液即为粗酶液，SDS-PAGE检测上清中目的 基因的表达量。
[0041 ] 实施例4:重组Cly-K-CAR酶的活性检测
[0042]利用DNS( 3，5-二硝基水杨酸)方法测定纯化的重组Cly-K-CAR酶活性。具体操作： 取lml超声破碎后上清液即粗酶液，对照组酶液沸水浴5min灭活，对照组和实验组分别加入 lml浓度为0.2 % (w/v)的κ-卡拉胶底物溶液，于45 °C水浴反应30min，加入2ml DNS溶液，煮 沸5min，迅速冷却后用紫外分光光度计于540nm下测定0D值，根据葡萄糖标准曲线求出反应 液中的还原糖含量。测得的卡拉胶酶活性为70.07U/ml。另外，使用SDS-PAGE电泳对分别诱 导了 211、处、611、811的菌体进行检测，并用凝胶成像系统拍照，如图1所示，结果显示条带大小 与理论预测的基本吻合。并配制含0.2%的κ-卡拉胶的SDS-PAGE电泳胶，进行正常的不连续 SDS-PAGE电泳，电泳完毕，将凝胶取下先用预冷的蒸馏水漂洗，洗去电泳缓冲液，然后加入 适量2.5 %TritonX-100，摇床复性lh，倒掉之后，加入TritonX-ΙΟΟ洗脱液洗脱30min，重复 两次。倒掉洗脱液后加入适量孵育液，40°C孵育过夜后取出，预冷蒸馏水漂洗后，Alcian blue染色后蒸馏水脱色，直至出现清晰降解亮带，如图2所示，结果表明这个重组表达的 Cly-K-CAR酶是具有κ-卡拉胶降解活性的，为后续的研究和应用提供了良好材料。
【主权项】
1. 一种以海洋细菌为来源获取的K-卡拉胶酶基因，其特征在于，其核苷酸序列为Seq ID. NO. 1，该基因 DNA序列全长1488bp，编码495个氨基酸，含有45个氨基酸的信号肽序列。2. 权利要求1所述的一种以海洋细菌为来源获取的I卡拉胶酶基因，其特征在于，从海 洋细菌C. Iytica M9中获取的方法包括如下步骤： (1) 根据海洋细菌C. Iytica M9中16s RNA序列构建系统进化树，找到与目的菌株最相 近且具有全基因组数据的参考菌株； (2) 根据基因组注释信息和NCBI中blast程序验证之后，找到参考菌株C. Iytica DSM7489基因组中编码K-卡拉胶酶的基因 Celly_2915编号（gi I 325284916 :3333332-3334777蛋白序列ADY30732)，同时确定该参考菌株中编码K-卡拉胶酶的相邻上游基因 Celly_2914编号（gi I 325284916:3332347-3333021 蛋白序列ADY30731)和下游基因 Celly_ 2916编号（gi I 325284916:3335359-3336312蛋白序列ADY30733)及分别对应的核苷酸和氨 基酸序列； (3) 根据相邻上游基因 Celly_2914和下游基因 Celly_2916的氨基酸序列，通过BlocKMa Ker在线软件程序进行比对和寻找保守核心区域，其中，Celly_2914的核心保守序列为： QGSINPM和Ce I ly_2916的核心保守序列为：SGLGEPNE; (4) 根据Celly_2914基因的核心保守序列设计正向引物， 正向引物为:TCTTGCTTCGCTACCAGCTC; 根据根据Celly_2916基因的核心保守序列设计反向引物， 反向引物为:TTTGGCTCTCCCAAACCAGA; (5) PCR扩增，以目的菌株C. Iytica M9基因组为模板，利用步骤(4)中所述的正反向引 物经一步PCR方法扩增，扩增产物切胶纯化，获得含有编码完整K-卡拉胶酶基因的原始编码 序列。3. 权利要求1所述的一种以海洋细菌为来源获取的I卡拉胶酶基因所编码的I卡拉胶 酶，其特征在于，K-卡拉胶酶的氨基酸序列为Seq ID. NO. 2，属于糖苷水解酶GH16家族。4. 根据权利要求3所述的K-卡拉胶酶，其特征在于，通过下述步骤制备而成： 1) 、κ_卡拉胶酶基因的重组表达质粒和重组菌株的构建 (1) 将K-卡拉胶酶基因克隆到原核表达载体pET_28a( + )中，构建重组表达质粒，基于获 得的K-卡拉胶酶基因的全长序列，设计获取目的基因 Cly-K-car成熟肽部分的上下游引物： 上游引物 Cly-K-Car-F: CCCGAATTCCAAACATCTAATCCGAATGATAATT 下游引物Cly-K-Car-R: GGCTCGAGCTATTGAATAAGCAGTTGTTTTG ； (2) 采用含有原始编码序列的质粒PMD-18T-原始编码序列模板，通过PCR方法获得目的 基因成熟肽部分序列;采用限制性内切酶EcoR I和Xho I双酶切PCR产物，胶回收酶切之后 的片段，跟同样经过EcoR I和Xho I双酶切的质粒pET-28a( + )链接，按照CaCl2转化法转化 到大肠杆菌TOPlO中，卡那霉素抗性筛选阳性克隆； (3) 采用质粒抽提试剂盒提取阳性克隆质粒，通过测序和EcoR I和Xho I双酶切鉴定， 获得目的基因的Cly-K-car重组表达质粒pET-28a( + )-Cly_ic-car，将该质粒进一步转化到 大肠杆菌BL21中，构建重组表达工程菌株BL21-Cly-K-CAR; 2) 、利用重组表达菌株BL21-Cly-K-CAR表达重组K-卡拉胶酶 将活化好的Iml重组表达菌株BL21-Cly-K-CAR转接到100mL含有20pg/ml卡那霉素的LB 液体培养基中，LB液体培养基为1000 ml去离子水中胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaC110g， 用5mol/LNaOH调pH至7.0，37°C振荡培养，培养条件37°C，转速150r/min，至OD6QQ达到0.6-〇. 8，将培养液温度降至18°C度左右，此时加入终浓度为0.1 mM的IPTG进行诱导表达，诱导 条件为18°C，转速100r/min，培养24h，离心收集菌体，将50ml菌体重悬于20ml海洋细菌 C. Iytica M9发酵培养基中，C. Iytica M9发酵培养基为每100mL陈海水中卡拉胶0.1%、蛋 白胨0.5%、FeS〇4.7H20 0.002%，在冰上进行超声波破碎处理，低温离心收集上清，上清液 即为粗酶液，SDS-PAGE检测上清中目的基因的表达量； (3)重组Cly-K-CAR酶的活性检测。
【文档编号】C12N15/70GK105950640SQ201610503827
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年6月30日
【发明人】姚子昂, 吴海歌, 赵博闻, 崔红利
【申请人】大连大学