变形链球菌细胞表面蛋白抗原(SpaP)和葡糖基转移酶(GtfB)融合蛋白疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种变形链球菌细胞表面蛋白抗原（SpaP) 和葡糖基转移酶（GtfB)融合蛋白疫苗及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 龋齿、心血管疾病和癌症并称为人类三大疾病。在中国，80%的儿童、50%的成人、 98%的老年人都不同程度受其困扰。要达到龋齿的有效预防，除了降低碳水化合物摄入、 利用氟化物增强牙齿对酸的抵抗力和采用密封剂减少致病菌在齿沟的定植之外，使用抗菌 物质减少或者消灭致龋微生物是科学家数十年来研宄的重点，龋齿疫苗的研发更是重中之 重，但到目前为止，仍然没有一种疫苗能够在临床应用。
[0003] 龋齿疫苗的研发是随着对致龋微生物的逐渐认识而进行的，变形链球菌是主要的 致龋微生物，其致龋性主要表现在对牙面的黏附、产酸、耐酸以及产生多糖和细菌素等方 面，针对变形链球菌的疫苗种类较多。早期，科学家们尝试将完整的变形链球菌灭活，作为 经口途径的疫苗使用，但是因为变形链球菌有能与心肌特别是心脂质和肌纤维膜鞘交叉反 应的抗原，导致接种者死亡的潜在危险而不被接受。随后，DNA重组技术被用来将致龋微生 物的抗原成分重组到非致龋、无交叉反应的良性细菌（如乳酸杆菌等）中，但是没有足够证 据能够保证所谓的良性细菌足够安全。同时，DNA疫苗的研宄也受到广泛重视，也因为人们 对其生物安全性的担心而迟迟不能在临床上应用。本课题组在防龋DNA疫苗方面进行了系 列研宄，开发3代防龋DNA疫苗，已经进入中试阶段，但是DNA疫苗应用于临床尚存在诸多 障碍，因安全上的顾虑，目前尚无任何一种DNA疫苗被批准应用。
[0004] 近来，由于蛋白质亚单位和多肽疫苗不含有核酸，其安全性理论上比DNA疫苗高， 多种蛋白类疫苗已经成功应用于临床（如乙肝疫苗等）。80年代人们随着对变链菌细胞壁 各种抗原性多聚物的逐渐认识，免疫防龋转入以变链菌单一抗原成分制备亚单位防龋疫苗 的研宄。研宄的焦点集中于两种候选疫苗，即变链菌主要表面蛋白抗原SpaP和葡糖基转移 酶GtfB，它们在介导变链菌对牙面的粘附和定殖过程中起着重要作用。近10年的大量研宄 证实，用SpaP和GtfB主动免疫能明显抑制实验动物和自愿受试者牙面变链菌的粘附和龋 病发生率，且纯化的抗原不会介导心脏交叉反应。变异链球菌表面蛋白抗原（SpaP)又被称 为蛋白 Pl(protein P1)、抗原 I / II (antigen I / II ,Ag I / II )等，是一种存在于细胞 壁的大分子表面糖蛋白，也是变异链球菌菌体胞壁上主要的黏结蛋白之一，在细菌对牙面 的初始黏附（非蔗糖依赖性黏附）和促进菌体之间的聚集过程中发挥重要的介导作用，是 致龋变异链球菌的重要毒力因子之一。GtfB已被证实是防龋疫苗重要的有效抗原，它包含 两个功能区：氨基端催化活性区CAT和羧基端葡聚糖结合区GLU。目前已经在变形链球菌 的表面抗原（SpaP)和GtfB(GlU区）多肽疫苗的研发方面取得了初步的结果，发现这两种 蛋白多肽疫苗都能提供一定的防龋齿保护效果，但是如何进一步提高其免疫效果，是一大 挑战。
【发明内容】
[0005] 本发明涉及一种将变形链球菌SpaP和GtfB通过柔性连接，构建了同时包含SpaP 和GtfB的融合蛋白，增强了黏膜免疫的效能，更加有效的预防龋齿的发生。柔性接头 linker (G4S) 3主要是利用gly和ser空间柔性使融合的两个蛋白在空间上能自由伸展，不 造成活性位点的相互掩盖。以期能够得到更容易表达的结构正确的融合蛋白。
[0006] 本发明一个方面涉及一种融合蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO :1。
[0007] 本发明的另一个目的是提供以上融合蛋白的制备方法，其主要包含步骤：
[0008] 1)引物的设计合成
[0009] 从 NCBI:BLAST 中的变形链球菌 UA159 (Streptococcus mutans UA159)基因组序 列中表面蛋白SpaP序列（Genbank Gene ID:102805)，以及β-1,3-葡聚糖酶GtfB编码序 列（Gene ID: 1028336)，设计合成二对特异性引物，引物的序列和编号如下：
[0010] (I)GtfB基因 PCR扩增引物
[0011] 上游引物 Pl (SEQ ID NO. 2)
[0012] 5' -CGC GGATCC ATGGGCTATCAAGCCAAAG-3，
[0013] 下游引物 P2(SEQ ID NO. 3)
[0014] 5' -CCG CTCGAG AATCCGAACTCGTTCTCCAG-3'
[0015] (扩增产物Y端含有BamHI位点，3'端含有XhoI位点）
[0016] (2) SpaP-(G4S) 3 基因 PCR 扩增引物
[0017] 上游引物 P3(SEQ ID NO. 4)
[0018] 5， -CTA GCTAGC ATGACCAATGCTGCCAATC-3'
[0019] 下游引物 P4 (SEQ ID NO. 5)
[0020] 5r -CGC GGATCC GCTTCCTCCTCCTCCGCTTCCTCCTCCTCCGCTTCCTCCTCCTCCCTCTGCTTC ATAGCTTGGC-3r
[0021] (扩增产物Y端含有NheI位点，3'端含有BamHI位点）
[0022] 2)将所述GtfB基因片段、SpaP-(G4S) 3基因片段分别构建到含有6-His组氨酸标 签的表达载体上，得到重组质粒，转化至表达菌，酶切鉴定；
[0023] 3)诱导表达可溶性的重组蛋白；
[0024] 4)纯化步骤3获得的重组蛋白，冰浴搅拌透析换液，除去咪唑；
[0025] 所述步骤（2)中的含6-His组氨酸标签的表达载体为pET28a质粒，表达菌为 E. coli DH5a ；
[0026] 优选的，步骤（3)具体为：挑取含有目的蛋白的重组子的单克隆，转入卡那霉素阳 性的LB液体培养基，37°C过夜震荡培养；再接种至新鲜配制的卡那霉素阳性的LB液体培养 基中，37°C摇床震荡过夜，增菌，待A6000D值为0. 5-0. 6时，加入IPTG终浓度为I. 0mmol/L， 37°C继续培养4小时。
[0027] 优选的，步骤（4)具体为：4°C，8000rpm离心5分钟收集诱导后的菌体，去上清，用 binding buffer洗绦一次，根据菌体的量，选择适量的binding buffer重悬菌体；冰浴环 境下，超声破碎，收集蛋白粗液；lOOOOrpm，30min，4°C离心破碎液，收集上清，并经0. 45 μ m 过滤器过滤，冰浴备用；使用Iml HisTrap FF镍柱以及AKTA purifier 10仪器进行纯化， SDS-PAGE电泳，分析目的蛋白的纯度；冰浴搅拌透析换液，除去咪唑。
[0028] 本发明的融合蛋白用于制备防龋蛋白疫苗。
[0029] 本发明将变形链球菌表面蛋白抗原SpaP与葡糖基转移酶GtfB通过Lingker序列 连接获得融合蛋白。一次免疫操作就可以使接种对象获得双重免疫保护。本发明的基因工 程亚单位疫苗免疫原性良好，安全高效，具有良好的开发和应用前景。本发明所构建和纯化 得到的重组融合蛋白疫苗，将为后续研宄蛋白疫苗的免疫效应提供充足的物质基础。
【附图说明】
[0030] 图1为SpaP、GtfB基因、SpaP-(G4S) 3基因 PCR扩增结果图
[0031] A图M为DNA marker，1为SpaP基因目的片段，2为GtfB基因目的片段，B图M为 DNA marker，1 为 SpaP-(G4S) 3 基因目的片段；
[0032] 图2为XholI、NheI和BamHI酶切质粒、GtfB基因、SpaP_(G4S)3基因 PCR扩增片 段结果图
[0033] 图中 M 为 DNAmarker，1 为 pET28a，2 为 GtfB，3 为 SpaP- (G4S) 3
[0034] 图3为重组蛋白SDS-PAGE电泳图
[0035] 1为SpaP -（G4S) 3-GtfB融合重组蛋白，2为SpaP重组蛋白；
[0036] 图4为蛋白疫苗免疫小鼠后唾液中产生特异性抗体水平比较图
[0037] A为PBS空白对照，B为SpaP蛋白免疫，C为PAc蛋白免疫，D为SpaP - (g4s) 3-GtfB，E 为 PCIA-P DNA 疫苗免疫组；
【具体实施方式】
[0038] 通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施 例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。下列实施例中 未注明的具体实验条件和方法，通常按照常规条件如：J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社， 1992,分子克隆实验指南（第三版）；D. L斯佩克特等，科学出版社，2001，细胞实验指南等 书中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0039] 【实施例1】Spap和SpaP -（G4S) 3-GtfB重组蛋白的构建
[0040] 1.引物的设计合成
[0041] 从 NCBI:BLAST 中的变形链球菌 UA159 (Streptococcus mutans UA159)基因组序 列中表面蛋白SpaP序列（Genbank Gene ID:102805)，以及β-1,3-葡聚糖酶GtfB编码序 列（Gene ID: 1028336)