一种曲马多人工抗原的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种曲马多人工抗原的制备方法。
【背景技术】
[000引曲马多，英文名；Tramadol(I順)，是一种非阿片类中枢性镇痛药，虽也可与阿片受 体结合，但其亲和力很弱，主要用作镇痛药，可缓解普通到严重的疼痛。该药是人工合成的， 作用于μ-阿片类受体W及去甲肾上腺素和血清张力素系统。曲马多可用于治疗中等至严 重的疼痛。有研究表明，曲马多对去甲肾上腺素和血清张力素系统的作用W及减轻痛感的 作用，可W减轻抑郁症和焦虑症的痛苦。
[0003]曲马多主要作用于中枢神经系统，其作用广，对急慢性疼痛有效，对人体的作用类 似吗啡和海洛因。作为唯一一种中枢性镇痛药，由于其镇痛效果强大而成癒性低故而在临 床上得到广泛使用。但随着曲马多的广泛使用，曲马多成癒的问题引起关注。据有关资料显 示，正常人如每天服用曲马多200毫克，大约半年后会产生药物依赖，而如果每天服用300 到400毫克（6到8颗药)甚至更多，可在短期内上癒。长期大剂量服用可致中枢神经兴奋、 呼吸抑制，并可产生耐受性和成癒性及其他不良反应。盐酸曲马多成癒的现象，在世界范围 内都有发现，世界卫生组织因此将该药列入了世界第五大被滥用的药品。2008年，中国将盐 酸曲马多作为精神药品进行管制。
[0004] 其结构式为：
目前，对曲马多的检测主要依靠高效液相色谱法（HPLC)，气相色谱（GC)，薄层色谱 (TLC)，质朴（Μ巧等，但是存在仪器昂贵，检测费时，并且需要专业技术人员进行操作，不能 达到现代检测对快速，准确的要求。而免疫分析法可W弥补W上所有缺点，免疫分析法是一 种利用抗原抗体特异性结合反应检测各种物质（药物、激素、蛋白质、微生物等）的分析方 法，该方法的前提就是需要提供特异性的抗原和抗体。因此有必要提供一种有效的曲马多 人工抗原的制备方法，制备的曲马多人工抗原可用于免疫制备具有特异性的曲马多抗体， 进一步用于检测。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷与不足，提供一种曲马多人工抗原 的制备方法，所制备的曲马多人工抗原可进行动物免疫，取得相应的曲马多抗体，可用于各 种曲马多类免疫分析法的研究，为曲马多类的检测提供更加方便快速准确的途径。
[0006] 一种曲马多人工抗原的制备方法，其特征在于，包括W下步骤： (1)制备人工半抗原： (a)将盐酸曲马多溶于纯化水，滴加25%氨氧化钢，游离使之抑W10 ;加入5-漠戊酸 己醋330ul，在80~9(TC的油浴中反应3小时。展开剂；95%己醇；氨水；二氯甲焼；1，4-二 氧六环=8: 1: 10: 1 (v/v)，Rf=0. 6-0. 7。
[0007] (b)反应结束后，用IN盐酸调抑=5. 5,减压蒸干，得油状产物I。
[0008] (C)产物I用薄层色谱分析（TLC)法分离，展开剂；95%己醇；氨水；二氯甲焼；1， 4-二氧六环=8: 1: 10:l(v/v)，Rf=0. 6-0. 7。收集所需部分硅胶，用无水己醇提取，减压 蒸干，得无色油状产物II。
[0009] (d)产物II按比例加入纯化水后，用DAS调抑=9,减压蒸干。按比例加入N，N-二 甲基甲醜胺，过滤，滤液蒸干，得曲马多半抗原。反应比例；产物II;纯化水；N，N-二甲基甲 醜胺：=l〇〇mg; 10ml; 10ml。
[0010] (2)制备曲马多人工抗原： (e) 将曲马多半抗原溶于N，N-二甲基甲醜胺中，加入N-居基玻巧醜亚胺、环己基碳醜 二亚胺，反应比例；曲马多半抗原；N，N-二甲基甲醜胺；N-居基玻巧醜亚胺；环己基碳醜二 亚胺=20mg;lml;10mg;17mg，室温揽拌反应18小时W上，反应结束后离必取上清液记为A 液； (f) 将氯化钢与十二水磯酸氨二钢、二水磯酸二氨钢W摩尔比为78. 3:4. 2:1溶于双 蒸水中，制备钢离子浓度为0.Imol/L的PBS缓冲液，pH为7. 2^7. 4 ; (g) 将BGG蛋白溶于PBS缓冲液中，得到浓度为5mg/ml的B液； 化）将A液缓慢滴加到B液，A液与B液的体积比为1:5,得到的混合液在2-8°C条件 下静置保存过夜，得到人工抗原混合液； (i)将人工抗原混合液于PBS缓冲液中透析，透析结束后离必取上清液即得到人工抗 原：曲马多-牛丙种球蛋白。
[0011] 由于曲马多的分子量较小，单独作用时不具有免疫原性或免疫原性较弱，因此必 须将其与大分子载体比如牛丙种球蛋白连接形成曲马多抗原后，才能刺激机体产生相应的 曲马多抗体。本发明在制备曲马多人工抗原过程中，所选的位点和交联方法都没有明显改 变其结构，保留了抗原决定簇。在曲马多半抗原和牛丙种球蛋白之间引入桥结构，暴露抗原 决定簇，所获得的曲马多人工抗原保持了曲马多的结构特异性，有利于相应曲马多抗体的 产生。
[0012] 本发明的技术方案分为两步，第一步为半抗原的制备及检测：W曲马多为原料通 过化学修饰，和5-漠戊酸己醋反应得到含駿基的半抗原；第二步为人工抗原的制备与检 巧h通过碳二亚胺法使之与牛丙种球蛋白度GG)结合制备曲马多的人工抗原即曲马多-牛 丙种球蛋白。其反应方程式如下：
本发明制备得到的曲马多人工抗原可通过w下方法进行鉴定： 偶联物蛋白浓度的测定：精确量取Proteinstandard(BGG)分别配制成浓度为0. 2， 0. 4,0. 6,，0. 8, 1. 0, 1. 2, 1. 6mg/ml的标准系列浓度，混匀，取50ul各浓度标准蛋白溶液加 入到一次性比色杯中，加入250ulreagentA，混匀，再加入2. 0mlreagentB,反应10分钟 后W分光光度计测得吸光度。空白液为reagentA250ul加reagentB2.0ml。W0D值 为横坐标，浓度为纵坐标作标准曲线，得出标准曲线线性方程。精确量取样品量为50ul，加 入到一次性比色杯中，加入250ulreagentA,摇匀，再加入2. 0mlreagentB,反应10分钟 后W分光光度计测得吸光度。通过已得出的标准曲线求得样品浓度。本发明计算得曲马多 抗原的蛋白浓度为2. 35mg/ml。
【具体实施方式】
[0013] 曲马多人工抗原制备分为两步，第一步为半抗原的制备及检测：W曲马多为原料 通过化学修饰，和了二酸酢反应得到含駿基的半抗原；第二步为人工抗原的制备与检测： 通过碳二亚胺法使之与牛丙种球蛋白度GG)结合制备曲马多的人工抗原即曲马多-牛丙种 球蛋白。
[0014] 实施例1 (1)制备人工半抗原： (a)将200mg盐酸曲马多溶于4ml纯化水，滴加4滴25%氨氧化钢，游离使之抑W10; 加入5-漠戊酸己醋330ul，在80~9(TC的油浴中反应3小时。展开剂；95%己醇；氨水；二氯 甲焼；1，4-二氧六环=8: 1: 10: 1 (v/v)，Rf=0. 64。
[0015] (b)反应结束后，用IN盐酸调抑=5. 5,减压蒸干，得油状产物I。
[0016] (C)产物I用薄层色谱分析（TLC)法分离，展开剂；95%己醇；氨水；二氯甲焼；1， 4-二氧六环=8: 1: 10:l(v/v)，Rf=0.6-0.7。收集所需部分硅胶，用无水己醇提取，减压 蒸干，得124mg无色油状产物II。
[0017] (d)产物II加入12. 4ml纯化水后，用DAS调抑=9,减压蒸干。加入12. 4mlN，N-二 甲基甲醜胺，过滤，滤液蒸干，得曲马多半抗原llOmg。
[0018] (2)制备曲马多人工抗原： (e) 将曲马多半抗原溶于5.5mlN，N-二甲基甲醜胺中，加入55mgN-居基玻巧醜亚 胺、94mg环己基碳醜二亚胺，室温揽拌反应20小时，反应结束后离必取上清液记为A液； (f) 将氯化钢与十二水磯酸氨二钢、二水磯酸二氨钢W摩尔比为78. 3:4. 2:1溶于双 蒸水中，制备钢离子浓度为0.Imol/L的PBS缓冲液，pH为7. 2^7. 4 ; (g) 将BGG蛋白溶于PBS缓冲液中，得到浓度为5mg/ml的B液； 化）将A液缓慢滴加到B液，A液与B液的体积比为1:5,得到的混合液在2-8°C条件 下静置保存过夜，得到人工抗原混合液； (i)将人工抗原混合液于PBS缓冲液中透析，透析结束后离必取上清液即得到人工抗 原：曲马多-牛丙种球蛋白。
[0019] (3)曲马多人工抗原的鉴定： 偶联物蛋白浓度的测定：精确量取Proteinstandard(BGG)分别配制成浓度为0. 2， 0. 4,0. 6,，0. 8, 1. 0, 1. 2, 1. 6mg/ml的标准系列浓度，混匀，取50ul各浓度标准蛋白溶液加 入到一次性比色杯中，加入250ulreagentA，混匀，再加入2. 0mlreagentB,反应10分钟 后W分光光度计测得吸光度。空白液为reagentA250ul加reagentB2.0ml。W0D值 为横坐标，浓度为纵坐标作标准曲线，得出标准曲线线性方程。精确量取样品量为50ul，加 入到一次性比色杯中，加入250ulreagentA,摇匀，再加入2. 0mlreagentB,反应10分钟 后W分光光度计测得吸光度。通过已得出的标准曲线求得样品浓度。本发明计算得曲马多 抗原的蛋白浓度为2. 35mg/ml。
【主权项】
1. 一种曲马多人工抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 制备人工半抗原： (a) 将盐酸曲马多溶于纯化水，滴加25%氢氧化钠，游离使之pH~10 ;加入5-溴戊酸 乙酯330ul，在8(T90°C的油浴中反应3小时；展开剂：95%乙醇：氨水：二氯甲烷：1，4_二氧 六环=8: 1: 10: 1 (v/v)，Rf=0.6-0.7; (b) 反应结束后，用IN盐酸调pH=5.5,减压蒸干，得油状产物I; (c) 产物I用薄层色谱分析（TLC)法分离，展开剂：95%乙醇：氨水：二氯甲烷：1，4_二 氧六环=8: 1: 10: 1(>八），1^=0.6-0.7;收集所需部分硅胶，用无水乙醇提取，减压蒸干， 得无色油状产物Π; (d) 产物II按比例加入纯化水后，用DAS调pH=9,减压蒸干；按比例加入N,N-二甲 基甲酰胺，过滤，滤液蒸干，得曲马多半抗原；反应比例：产物II:纯化水：N，N-二甲基甲酰 胺：=100mg:10ml:10ml; (2) 制备曲马多人工抗原： (e) 将曲马多半抗原溶于N，N-二甲基甲酰胺中，加入N-羟基琥珀酰亚胺、环己基碳酰 二亚胺，反应比例：曲马多半抗原：N，N-二甲基甲酰胺：N-羟基琥珀酰亚胺：环己基碳酰二 亚胺=20mg:1ml:10mg:17mg，室温搅拌反应18小时以上，反应结束后离心取上清液记为A 液； (f) 将氯化钠与十二水磷酸氢二钠、二水磷酸二氢钠以摩尔比为78. 3:4. 2:1溶于双 蒸水中，制备钠离子浓度为〇.lmol/L的PBS缓冲液，pH为7. 2~7. 4 ; (g) 将BGG蛋白溶于PBS缓冲液中，得到浓度为5mg/ml的B液； (h) 将A液缓慢滴加到B液，A液与B液的体积比为1:5,得到的混合液在2-8°C条件 下静置保存过夜，得到人工抗原混合液； (i) 将人工抗原混合液于PBS缓冲液中透析，透析结束后离心取上清液即得到人工抗 原：曲马多-牛丙种球蛋白。
【专利摘要】本发明提供了一种曲马多人工抗原的制备方法，第一步为半抗原的制备及检测：以曲马多与5-溴戊酸乙酯为原料通过化学修饰，接臂，反应得到含羧基的半抗原；第二步为人工抗原的制备与检测：通过碳二亚胺法使之与牛丙种球蛋白(BGG)结合制备曲马多的人工抗原即曲马多-牛丙种球蛋白。所制备的曲马多人工抗原可进行动物免疫，取得相应的曲马多抗体，可用于各种曲马多类免疫分析法的研究，为曲马多的检测提供更加方便快速准确的途径。
【IPC分类】C07K1/107, C07K14/47
【公开号】CN105367645
【申请号】CN201410412351
【发明人】韩洁茹, 董媛媛
【申请人】艾博生物医药(杭州)有限公司
【公开日】2016年3月2日
【申请日】2014年8月21日