隐丹参酮在制备肿瘤药物中的应用
【专利摘要】本发明公开了隐丹参酮在制备肿瘤药物中的应用，本发明发现了隐丹参酮（CTS）可以显著抑制肿瘤细胞IGF?1R的磷酸化水平。这种抑制作用至少部分是通过磷酸酶SHP2介导的。干扰这些磷酸酶SHP2表达后，能够逆转CTS对IGF?1R磷酸化水平的抑制作用。本发明还发现CTS能时间和剂量依赖性地增加SHP2的磷酸化水平；CTS处理后SHP2的磷酸酶活性增加，这些发现对肿瘤的有效治疗具有重要意义。
【专利说明】
隐丹参酮在制备肿瘤药物中的应用
技术领域
[0001]本发明涉及隐丹参酮在制备肿瘤药物中的应用。
【背景技术】
[0002]隐丹参酮(Cryptotanshinone，CTS)是活血化瘀类中药丹参的有效成分之一，其独特的化学结构和药动学特性使其逐渐成为人们关注的对象。它具有清除氧自由基、抗感染、改善微循环等广泛的药理作用，研究证实其在抗菌消炎、代谢紊乱性疾病及神经退行性疾病等方面显示出很好的前景，临床上主要用于抗炎及心血管系统疾病的治疗。近年来它的抗肿瘤活性也逐渐被认识，研究发现CTS对多种人类肿瘤如前列腺癌、神经胶质细胞瘤、淋巴细胞白血病等具有明显的抑制作用，引起了人们的广泛关注，但对其作用机制的研究还不是很多，尚需要从分子机制及对细胞信号通路的影响等方面深入探讨。
[0003]胰岛素样生长因子UInsulin-1ike Growth Factor-1，IGF-1)是胰岛素样生长因子系统的重要成员，是一种作用于多种组织和器官的多功能细胞调控因子。对大多数细胞而言，IGF-1是一种强有力的有丝分裂原，可以促进细胞的存活，对抗凋亡。IGF-1生物学功能的发挥依赖于其高亲和力受体IGF-1Rt3IGF-1R属于酪氨酸激酶受体家族，在多种肿瘤细胞中高度表达。大量研究表明IGF-1R及其下游PI3K/Akt、Ras/Raf/MAPK信号通路的过度激活在肿瘤的发生、发展中发挥重要作用。因此抑制IGF-1R及下游促存活信号通路的活性已经成为抑制肿瘤生长的重要对策之一。
【发明内容】
[0004]为了解决上述存在的问题，本发明主要研究了CTS对IGF-1诱导的肿瘤细胞增殖的影响，研究IGF-1R信号通路调控的关键因子，并从细胞内信号转导角度研究其可能的作用机制，从进一步阐述CTS在治疗肿瘤中的应用。
[0005]本发明的目的在于提供隐丹参酮在制备肿瘤药物中的应用。
[0006]本发明所采取的技术方案是:
蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2的活性诱导剂在制备肿瘤药物中的应用。
[0007]进一步的，上述活性诱导剂为隐丹参酮。
[0008]本发明的有益效果是:
本发明发现了 CTS(隐丹参酮)可以显著抑制肿瘤细胞IGF-1R的磷酸化水平。这种抑制作用至少部分是通过磷酸酶SHP2介导的。干扰这些磷酸酶SHP2表达后，能够逆转CTS对IGF-1R磷酸化水平的抑制作用。本发明还发现CTS能时间和剂量依赖性地增加SHP2的磷酸化水平;CTS处理后SHP2的磷酸酶活性增加，这些发现对肿瘤的有效治疗具有重要意义。
【附图说明】
[0009]图1为不同浓度IGF-1处理对PCl2细胞增殖的影响;CTL表示对照；
图2为不同浓度IGF-1处理对hRPE细胞增殖的影响;CTL表示对照； 图3为CTS对IGF-1诱导的PC12细胞增殖的影响；
图4为CTS剂量依赖性降低IGF-1诱导的IGF-1R及其下游PI3K/Akt和Ras/Erk的磷酸化；
图5为CTS对IGF-1R下游PI3K/Akt及Ras/Erk级联信号通路的影响，A为CTS对IGF-1R及其下游Akt、Foxo3a、GSK30磷酸化水平的影响，B为CTS在Raf / MEKI/2 / Erkl/2级联信号通路中对相关蛋白磷酸化水平的影响；
图6为磷酸酶⑶45、SHP2、LAR siRNA干扰效率验证；
图7为转染蛋白磷酸酶siRNA对CTS抑$ijIGF-lR磷酸化的影响；
图8为不同CTS剂量对SHP2磷酸化水平的影响；
图9为CTS处理不同时间后对SHP2磷酸化水平的影响。
【具体实施方式】
[0010]下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0011]实施例1 IGF-1诱导细胞增殖
分别加入终浓度为1、3、10、30、100 yg.L1的IGF-1处理PC12细胞和hRPE细胞。每孔分别加入10 yL IGF-1，对照组加入相同体积的DMEM培养液。每个浓度设3-5个复孔。置于37°C，5% CO2细胞培养箱培养24 h后，吸去培养基，行MTT assay检测，测定IGF-1对PC12细胞、hRPE细胞增殖的影响。
[0012]MTT检测结果如图1和图2所示，从图1中可以看出，不同浓度的IGF-1作用于PC12细胞后，与空白组相比，IGF-1能显著地促进细胞的增殖，并呈剂量依赖性。IGF-1浓度为3 μg.L1时已经对PC12细胞的增殖有促进作用(K0.05)，到10 yg.L1时，对细胞增殖的促进作用已经极显著(代0.01)。
[0013]从图1中可以看出，不同浓度的IGF-1作用于hRPE细胞后，与空白组相比，IGF-^g显著地促进细胞的增殖，并呈剂量依赖性。IGF-1浓度为10 yg.L1时已经对hRPE细胞的增殖有促进作用(K0.05)，到100 yg.L1时，对细胞增殖的促进作用已经非常显著(K0.01)，之后浓度增加，对细胞增殖的作用已不明显，提示已达到峰值。IGF-1剂量依赖性地促进hRPE细胞的增殖，与PCl 2细胞类似。
[0014]实施例2隐丹参酮对IGF-1诱导的细胞增殖的抑制作用
为了考察CTS对IGF-1诱导PC12细胞增殖是否具有抑制作用，我们首先加入CTS(20 μΜ)预处理PC12细胞40 min，之后加入IGF-l(10yg/L)共同作用于PC12细胞24 h，以MTT法检测CTS对IGF-1诱导的细胞增殖的影响。同时设置只用10 yg.L1 IGF-1处理的对照组；只用CTSC20 μΜ)处理的对照组；以及无IGF-1和CTS条件下培养的对照组。每个浓度设3-5个复孔。置于37°C，5% CO2细胞培养箱培养24 h后，吸去培养基，进行MTT检测，考察CTS对IGF-1诱导的细胞增殖作用的影响。
[0015]MTT检测结果如图3所示，从中可以看出，与空白对照组相比，IGF-1处理组对PC12细胞的增殖有明显的促进作用(K0.0I)，而CTS处理组则对PCl 2细胞的生长有显著的抑制作用(P〈0.01) XTS+IGF-1共同处理组与IGF-1组比较的结果，显示CTS能显著抑制IGF-1的促增殖作用，并使其恢复至与空白对照组相近的水平(K0.01)。提示CTS可通过抑制IGF-1的增殖作用发挥抗细胞增殖的作用。
[0016]实施例3隐丹参酮对IIGF-1R信号通路的抑制作用
1)CTS对IGF-1诱导的IGF-1R、PI3K/Akt及Ras/Erk蛋白磷酸化水平的影响为了研究CTS对IGF-1刺激引起的IGF-1R及其下游PI3K/Akt和Ras/Erk的磷酸化的作用，我们用CTS干预PC12细胞，之后IGF-1处理10 min。收集样品，用Western Blot检测IGF-lR，Akt以及Erk的磷酸化水平，制备IGF-lR，Akt以及Erk磷酸化水平随CTS处理而改变的量效曲线和时效曲线。
[0017]Western Blot结果如图4所示，从中可以看出，使用不同浓度CTS处理PC12细胞40min，随着CTS浓度的增加，IGF-1R的磷酸化水平逐渐下降，呈剂量依赖性。其下游两条主要的信号通路:PI3K/Akt和Erkl/2的磷酸化水平也出现明显下降，而总Akt和总Erk的蛋白水平没有发生变化，表明CTS处理能剂量依赖性降低Akt、Erk的磷酸化水平。如图所示，CTS浓度为10-30 μΜ时即可明显降低磷酸化水平，故后续实验CTS以20 μΜ的剂量来进行。
[0018]2)CTS对IGF-1R下游级联信号通路的影响
前面的结果显示，CTS处理能影响IGF-1R下游Akt以及Erk的磷酸化水平，为了研究CTS在PI3K / Akt / GSK30和Raf / MEK1/2 / Erkl/2级联信号通路中发挥的作用，开展了进一步的实验探讨。
[0019]使用20 μΜ的CTS预处理PC12细胞40 min后，再用10 yg.L1的IGF-1诱导10 min,如图2-6所示，10 yg.L1的IGF-1诱导能显著增强IGF-1R及其下游级联信号通路的磷酸化水平。在PI3K /Akt/ GSK30级联信号通路中，CTS 20 μΜ预处理能够显著抑制IGF-1R的磷酸化水平，并能降低其下游Akt，Foxo3a，GSK30的磷酸化水平，但对FoxOl (Ser256)的磷酸化作用不明显(图5A)。而在Raf / MEK1/2 / Erkl/2级联信号通路中，CTS能够降低c-Raf?和Erkl/2的磷酸化水平，但对MEK1/2的磷酸化水平作用不明显(图5B)。
[0020]另外，本发明还在大鼠C6胶质瘤细胞中进行了上述实施例1?3中所述的实验，其结果也上述PCl 2细胞的结果类似，说明CTS在其他肿瘤细胞株中也具有抑制IGF-1R磷酸化的作用。
[0021]上述结果说明CTS能够剂量依赖性地抑制IGF-1诱导的PC12细胞增殖，并且能够剂量依赖性和时间依赖性地降低IGF-1R及其下游信号通路的磷酸化。在大鼠C6胶质瘤细胞中，CTS也能够剂量依赖性降低IGF-1诱导的IGF-1R磷酸化。CTS的抑制细胞增殖的作用可能是因为降低了 IGF-1R信号通路的磷酸化水平。
[0022]实施例4隐丹参酮抑制IGF-1R磷酸化的机制研究 I)蛋白磷酸酶siRNA干扰效率验证
本发明从磷酸酶的角度探讨CTS抑制IGF-1R磷酸化以及细胞增殖的作用机制。
[0023]根据文献查阅以及相关研究，找出若干能与IGF-1R相互作用的蛋白磷酸酶，设计特异siRNA干扰这些蛋白磷酸酶，每种蛋白磷酸酶的siRNA各有两组。收集PCl 2细胞并进行电转染，转染各组磷酸酶的siRNA及Negative control-siRNA(NC-siRNA)。待转染36 h，采用RT-PCR验证siRNA的干扰效率，筛选出有效的siRNA序列。
[0024]实验室前期研究结果表明，合成的磷酸酶siRNA序列均能有效地干扰相应蛋白磷酸酶的表达，能够满足后续实验的需求。从图6的RT-PCR检测结果中可知，转染siRNA之后，磷酸酶如⑶45、SHP2、LAR与阴性对照相比，mRNA的表达显著被抑制。
[0025]2)作用于IGF-1R的几种磷酸酶对CTS抑制IGF-1R磷酸化的影响前面的结果提示了 CTS能够抑制IGF-1R的磷酸化，并能下调其下游Akt及Erk的磷酸化水平，呈剂量和时间依赖性。为了研究CTS是如何影响IGF-1R磷酸化的水平，合成作用于IGF-1R的几种蛋白磷酸酶的siRNA，并运用Western blot检测CTS处理对IGF-1R磷酸化水平的影响。
[0026]方法:收集PC12细胞并进行电转染，转染已经过干扰效率验证的蛋白磷酸酶的siRNA(SHPl、SHP2、PP2A、NR2A、CD45和LAR 的siRNA)及Negative control-siRNA，结束后接种于12孔板中，转染36 h后，加入20 μΜ的CTS处理40 min，再加入10 yg.L1的IGF-1干预10 min，迅速抽出细胞培养板中的培养基，用冰冷I3BS润洗两次，采用Western Blot检测可能相关的蛋白的表达水平以及信号通路的变化情况，考察在以上蛋白磷酸酶的表达被干扰的情况下，CTS抑制IGF-1R磷酸化作用是否被逆转，并研究干扰哪种或是哪些特异磷酸酶可以逆转CTS的作用。
[0027]Western Blot检测结果如图7所示，从中可以看出，IGF-1处理未转染的PC12细胞，磷酸化水平做为阳性对照，较空白组显著增强;转染NC-siRNA做为阴性对照，CTS处理能降低IGF-1R的磷酸化水平；在转染的6种磷酸酶的siRNA(SHPl、SHP2、PP2A、NR2A、CD45和LAR的siRNA)中，转染SHP2-siRNA后，CTS对IGF-1R磷酸化水平的抑制作用被逆转。经分析，逆转后的磷酸化水平与转染SHP2-siRNA的IGF-1处理组的磷酸化水平并没有显著性差异(P〉
0.05)，而转染3即1、？?24、斯2六、0)45、1^的8丨1?熟并没有得到类似的效果。
[0028]结果表明:SHP2被干扰后，CTS降低IGF-1R磷酸化水平的作用被抑制，提示蛋白磷酸酶SHP2在CTS抑制IGF-1R磷酸化从而抑制肿瘤细胞增殖的作用过程中扮演重要角色。
[0029]3)CTS剂量和时间处理对SHP2磷酸化水平的影响
为进一步考察蛋白磷酸酶SHP2在CTS降低IGF-1R磷酸化过程中的作用，以及CTS与SHP2之间的相互关系，采用Western blot检测CTS不同剂量以及不同时程处理对SHP2磷酸化水平的影响。
[0030]方法:更换不含血清的DMEM培养液I h后，分别加入终浓度为1、3、10、30、100 μΜ的CTS干预细胞40 min，对照组加入相同体积的DMEM培养液。处理结束后，迅速抽出培养板中的培养基，用冰冷的I3BS润洗两次，收集蛋白样品，采用Western Blot检测CTS剂量处理对上述特异磷酸酶的磷酸化水平的影响。
[0031 ] Western Blot检测结果如图8所示，随着CTS浓度的增加，SHP2的磷酸化水平逐渐增加，具有明显的剂量依赖性。
[0032]方法:更换不含血清的DMEM培养液I h后，加入20 μΜ的CTS干预细胞，分别处理5、
1、20、40、80 min，对照组加入相同体积的DMEM培养液。处理结束后，迅速抽出培养板中的培养基，用冰冷的PBS润洗两次，收集蛋白样品，采用Western Blot检测CTS时间处理对上述特异磷酸酶的磷酸化水平的影响。
[0033]Western Blot检测结果如图9所示，随着CTS作用时间的延长，SHP2的磷酸化水平逐渐增加，具有明显的时间依赖性。
[0034]综上所述，本发明从磷酸酶的角度探讨CTS抑制IGF-1R磷酸化的可能机制，发现SHP2可逆转CTS的抑制作用，提示CTS的作用经过SHP2的调控作用;本发明还发现CTS能诱导SHP2的活性，说明CTS的作用通过增加SHP2的活性而实现的。这些结果证明CTS降低IGF-1受体磷酸化水平从而抑制肿瘤细胞增殖的作用，至少部分是通过诱导蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2 的活化而实现的。
【主权项】
1.蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2的活性诱导剂在制备肿瘤药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的活性诱导剂为隐丹参酮。
【文档编号】A61P35/00GK106074571SQ201610543228
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月11日
【发明人】郑文华, 孟茜, 周旋和, 苏肖英, 廖日房
【申请人】中山大学